PATOLOGI KLINIK

Bilirubin dalam serum

Pendahuluan
Bilirubin dibentuk dari fragmen heme dari pelepasan hemoglobin oleh sel-sel darah
merah yang sudah tua atau rusak. Hati, limpa dan sumsum tulang adalah situs produksi
bilirubin. Bilirubin terbentuk dalam limpa dan sumsum tulang kemudian diangkut ke hati. Di
dalam hati bilirubin diubah menjadi bilirubin konjugasi - bilirubin monoglucoronides dan
diglucuronides. Setiap penyakit hati mempengaruhi sistem di atas, dan karenanya bilirubin
terakumulasi dalam serum menyebabkan penyakit kuning.

Prinsip Metode
Bilirubin bereaksi dengan asam sulfanilic diazotized untuk membentuk suatu zat
warna azo yang merah dalam larutan netral dan biru dalam larutan alkali. Sedangkan bilirubin
glucuronides larut dalam air bereaksi "langsung", bebas "tidak langsung" bilirubin bereaksi
jika terdapat akselerator.
Larutan kafein benzoat digunakan untuk membagi kompleks bilirubin tak
terkonjugasi pelepasan protein kompleks bilirubin sehingga dapat bereaksi dengan asam
sulphanilic diazotised.
Bilirubin total dalam serum atau plasma ditentukan dengan menggunakan metode
Jendrassik dan Grof dimana menggabungkan dengan asam sulfanilic diazotized setelah
penambahan kafein, natrium benzoat dan natrium asetat. Sebuah azobilirubin biru terbentuk
dalam larutan Fehling alkali II. Senyawa biru ini juga dapat ditentukan secara selektif pada
presence of yellow oleh produk (pewarnaan campuran hijau) oleh fotometri pada 578 nm.
Bilirubin direct diukur sebagai pewarna azo merah pada 546 nm menggunakan
metode Schellong dan Wende tanpa additin alkali.
Bilirubin indirect dihitung dari perbedaan antara bilirubin total dan direct.

Jenis Spesimen, Pengumpulan Dan Penyimpanan

 Gunakan hanya yang jelas, non-haemolysed sampel serum. Bilirubin tidak stabil dan
sensitif terhadap cahaya dan karena itu uji harus dilakukan dalam waktu 2 jam dari koleksi
sampel. Jika penundaan tidak dapat lagi dihindari, mendinginkan sampel. Sampel dapat
dibekukan pada -20°C, untuk menjaga bilirubin stabil selama 2 bulan.

Peralatan Yang Diperlukan

Spektrofotometer atau fotometer filter.

Reagen
1. Asam Sulfanilic (29 mmol/I C6H7NO3S, 170 mmol /I HCL)
2. Natrium nitrit (29 mmol/l NaNO2)
3. Accelerator (130 mmol/I kafein, 156 mmol/I natrium benzoat, 460 mmol/l natrium
asetat)
4. Larutan Fehling II (930 mmol/l kalium natrium tartrat, 1,9 mol/l natrium hidroksida)

Bilirubin Total
Prosedur
Pipet ke dalam tabung reaksi
Sample Blanko
Natrium Nitrit I tetes -
Asam Sulfanilic 0.2 mL 0.2 mL
Accelerator I.0 mL I.0 mL
Serum 0.2 mL 0.2 mL
Mencampur dan diamkan selama I0 sampai 60 menit pada suhu kamar (I5 to 25 °)
Larutan Fehling ll I.0 mL I.0 mL
mencampur dan setelah 5 sampai 30 menit mengukur absorbansi sampel terhadap blanko.

Filter:Hg578nm.
Denganabsorbansidi atas1, 0serum encer1+ 5dengan garamisotonikdan kalikanhasilnya
dengan6.

Perhitungan

Konsentrasi bilirubin total = A X l0,5 mg/dL

= A X l80 umol/L
Rentangnormal
Sampai 1mg/dL
Sampai 17mmol/L

Bilirubin Direct
Metode ini didasarkanpada definisibilirubindirect sebagaijumlahbilirubinyang,
tanpapenambahanakselerator, dapat ditentukansetelahwaktu reaksidari 5menit.
Bilirubininiterutama terdiri dari bilirubin glucoronides larut air. Dalam kondisiyang
digunakan di sini, bilirubin bebashanyabereaksilambat.

Prosedur
Pipetke dalamtabung reaksi

Sample Blanko
Natrium Nitrit I tetes -
Asam Sulfanilic 0.2 mL 0.2 mL
lsotonic saline 2.0 mL 2.0 mL
Serum
Campurdan diamkan pada suhu kamar(+l5sampai +25° C). Tepat5menit setelahpenambahan
serummengukurabsorbansisampelterhadap blanko.

Filter: Hg 546 nm.

Perhitungan
Konsentrasi bilirubin direct = A X 14.0 mg/dL
= A X 240 mol/L

Rentang normal
Sampai 0,25 mg / dl
Sampai 4,3 mmol / l

Batasan
Sampel dengan konsentrasi bilirubin lebih tinggi dari 20 mg/dl harus diencerkan dengan
volume air yang setara dengan air suling dan hasil yang diperoleh harus dikalikan dengan 2. Tidak ada
gangguan dalam pengujian dengan hemoglobin hingga konsentrasi 1,0 g/dl; hemolisis namun kuat
akan menginterfensi negatif dengan pengukuran. Jangan melaporkan hasil spesimen yang gangguan
suspect. Menginformasikan pada dokter terhadap masalah yang ditemukan.
Bilirubin Bilirubin Bilirubin
Usia
Total Konjugasi Tak Terkonjugasi
Bayi baru lahir I–3 -
1-2 hari 3.4-Il.5 -
3-5 hari I.5-I2 -
Dewasa 0.3 - I 0.2 - 0.7

Bilirubin dalam urin

Pendahuluan
Ekskresi bilirubin dalam urin akan mencapai tingkat yang signifikan dalam setiap
proses penyakit yang meningkatkan jumlah bilirubin terkonjugasi dalam aliran darah. Pada
beberapa penyakit hati akibat infeksi atau hepatotoxicagents, sel-sel hati tidak dapat
mengeluarkan semua bilirubin terkonjugasi dalam empedu, sehingga jumlah yang cukup
dikembalikan ke darah untuk meningkatkan kadar darah dan menyebabkan bilirubinuria
signifikan.
Pada penyakit saluran empedu obstruktif, mengganggu stasis bilier dengan ekskresi
normal bilirubin terkonjugasi melalui saluran pencernaan, sehingga menyebabkan build-up
dalam aliran darah dengan menghasilkan bilirubinuria. Karena bilirubin mungkin sering
muncul dalam urin sebelum tanda-tanda disfungsi hati (penyakit kuning, penyakit klinis)
terlihat jelas, bilirubinuria adalah tanda diagnostik yang penting dari penyakit hati dan tes
bilirubin harus menjadi bagian dari setiap urinalisis rutin.

Harrison Spot Tes (Uji Fouchet¢s)

Prosedur
1. Tempatkan 10 ml urin asam dalam tabung reaksi
2. Tambahkan 5 ml larutan barium klorida 10%
3. Kocok dan filter
4. Untuk endapan sisa pada kertas saring, tambahkan 1 tetes pereaksi dibuat berikut:
Asam trikloroasetat 25 gm
10% larutan ferric klorida 10 ml
Air suling 100 mL
5. Ketika terdapat bilirubin, akan terlihat warna hijau atau biru-hijau

Bilirubin merupakan senyawa tidak stabil dan menghilang dari urin jika didiamkan, terutama
jika terkena cahaya. Hal ini sangat penting bahwa uji urin untuk bilirubin segera setelah
ekskresi.
Referensi nilai
Bilirubin yang terdapat dalam urin adalah sekitar 0,02 mg/dL, mencerminkan level
darah normal yang rendah bilirubin terkonjugasi. Jumlah ini tidak terdeteksi oleh teknik
semikuantitatif rutin, dan ditafsirkan sebagai hasil negatif.

Transaminase dalam serum

Pendahuluan
Terdapat dua transaminasee yang penting untuk diagnostik:
1) serum glutamat oksaloasetat transaminase (SGOT) atau aspartate transferase (AST),
dan
2) serum glutamat piruvat transaminase (SGPT) atau alanin amino transferase (ALT).
Sementara AST ditemukan dalam setiap jaringan tubuh, termasuk sel darah merah, dan
sangat tinggi dalam otot jantung, ALT ditemukan dalam konsentrasi cukup tinggi dalam hati
dan rendah di jantung, otot rangka dan jaringan lain. Kedua pengukuran AST dan ALT
berguna dalam diagnosis dan pemantauan pasien dengan penyakit hepatocelluler.
Rasio ASAT / ALAT digunakan untuk diagnosis diferensial dalam penyakit hati.
Sementara rasio <1 berhubungan dengan kerusakan hati ringan, rasio> 1 adalah berhubungan
dengan gejala berat, sering penyakit hati kronis.

Prinsip Metode
Transaminasi adalah proses di mana kelompok amino ditransfer dari asam amino
untuk asam a-keto. Para enzym yang bertanggung jawab untuk transaminasi disebut
transaminase. Para substrat dalam reaksi adalah asam a-ketoglutarat (KG) ditambah L-
aspartat untuk AST, dan KG ditambah L-alanin untuk ALT. Produk dibentuk oleh tindakan
enzim glutamat dan oksaloasetat untuk AST dan glutamat dan piruvat untuk ALT.
Penambahan 2,4 dinitrophenyl hidrazin hasil dalam pembentukan kompleks hydrazone
dengan ketoacids. Sebuah warna merah yang dihasilkan pada penambahan natrium
hidroksida. Intensitas warna yang terkait dengan aktivitas enzim.

Alanine Transaminase/ALAT (GPT) FS

ALAT
L-Alanin + 2-Oxoglutarat  L-Glutamat + Pyruvate

LDH
Pyruvate + NADH + H+ D-Lactate + NAD+

Penambahan piridoksal-5-fosfat (P-5-P) stabilizsed transaminase dan menghindari nilai-nilai

palsu yang rendah dalam sampel yang mengandung P-5-P endogen tidak cukup, misalnya
dari pasien dengan penyakit hati, pasien perawatan intensif.

Aspartate Transaminase/ASAT (GOT) FS

ASAT
L-Alanin + 2-Oxoglutarat  L-Glutamat + Pyruvate

MDH
Oxalacetate + NADH + H+ L-malate + NAD+

Jenis spesimen, pengumpulan dan penyimpanan

Serum atau plasma EDTA/heparinized dapat digunakan dalam pengujian ini.
Transaminase stabil dalam serum selama 6 jam pada 25 - 35°C, 7 hari pada 2 - 8°C dan
selama satu bulan bila disimpan pada -20°C

Peralatan yang diperlukan

Spektrofotometer atau fotometer filter.

Reagen
Komponen dan Konsentrasi SGPT:
R1: TRIS pH 7.15 100 mmol/l
L-Alanin 500 mmol/l
LDH (lactat dehydrogenase) ≥ 1700 U/l
R2: 2-Oxoglutatrate 15 mmol/l
NADH 0.18 mmol/l
Pyridoxal-5-+hosphate FS
Goodcs buffer pH 9.6 0.7 mmol/l
 Pyridoxal-5-Phosphate 0.09 mmol/l
Komponen dan konsentrasi SGOT:
R1: TRIS pH 7.15 80 mmol/l
L-Asparte 240 mmol/l
MDH ≥ 600 U/l
LDH (lactat dehydrogenase) ≥ 600 U/l
R2: 2-Oxoglutatrate 12 mmol/l
NADH 0.18 mmol/l
Pyridoxal-5-+hosphate FS
Goodcs buffer pH 9.6 0.1 mmol/l
Pyridoxal-5-Phosphate 13.8 mmol/l

Prosedur
Sample 100 L
Reagent l I000 L
Campur, inkubasi selama 5 menit, kemudian menambahkan:
Reagent 2 250 L
Campur, membaca absorbansi setelah I menit, dan mulai stopwatch. Membaca
kembali absorbansi, 2 and 3 menit kemudian.

WaveIength: 340 nm, 365 nm, Hg 334 nm.

Temprature: 37°C

Perhitungan
Dari pembacaan absorbansi menghitung delta A/min dan kalikan dengan faktor yang sesuai dari
tabel di bawah ini:
Substrate start 37oC; Sample start 37oC
340 nm 2143 1745
334 nm 2184 1780
365 nm 3971 3235

Rentang Normal SGPT

Wanita < 34 U/I
Pria < 45 U/l
Anak-anak 1 - 30 hari < 25 U/l
2 - 12 bulan < 35 U/l
1 - 3 tahun < 30 U/l
 4 - 6 tahun < 25 U/I
7 - 9 tahun < 25 Ull
10 - 18 tahun < 30 U/I

Rentang Normal SGOT

Wanita 10 - 35 U/l
Pria 10 - 50 U/l

Batasan
Untuk sampel dengan aktivitas enzim yang lebih besar dari 150 U/l untuk ALT,
mengencerkan spesimen 1 in 10 dengan saline. Beberapa spesimen mungkin memerlukan 1
in 10 pengenceran lebih lanjut untuk memberikan pengenceran akhir dari 1 in 100. Kalikan
hasil akhir oleh faktor pengenceran.
Hindari menggunakan sampel haemolysed karena hal ini akan menyebabkan nilai-
nilai palsu meningkat. Dalam hal ini menginformasikan dokter dan meminta spesimen lain.

Permukaan antigen hepatitis B

Pendahuluan
Antigen kompleks yang ditemukan pada permukaan HBV disebut HBs Ag. Kehadiran
HBs Ag dalam serum atau plasma adalah indikasi dari infeksi Hepatitis B aktif, baik akut atau
kronis. Dalam infeksi Hepatitis B yang khas, HBs Ag akan terdeteksi 2 - 4 minggu sebelum
tingkat ALT menjadi abnormal dan 3 sampai 5 minggu sebelum gejala atau ikterus
berkembang. HBs Ag memiliki empat subtipe utama: adw, ayw, adr dan ayr. Karena antigenik
heterogeneneity determinan, ada 10 serotipe utama virus Hepatitis B.

Prinsip metode
Salah satu langkah Antigen permukaan hepatitis B tes perangkat (serum/plasma)
adalah kualitatif, aliran immunoassay lateral untuk deteksi HBs Ag dalam serum atau plasma.
Membran pra-dilapisi dengan antibodi anti-HBsAg pada tes daerah garis strip. Selama
pengujian, spesimen serum atau plasma bereaksi dengan partikel dilapisi dengan antibodi
anti-HBsAg. Campuran bermigrasi ke atas pada membran chromatographically oleh tindakan
kapiler untuk bereaksi dengan antibodi anti-HBs Ag pada membran dan menghasilkan garis
berwarna. Kehadiran garis berwarna di wilayah pengujian menunjukkan hasil positif,
sementara ketiadaan menunjukkan hasil negatif. Untuk melayani sebagai kontrol prosedural,
garis berwarna akan selalu muncul di wilayah garis kontrol menunjukkan bahwa volume
tepat dari spesimen telah ditambahkan dan wicking membran telah terjadi.

Jenis spesimen, pengumpulan dan penyimpanan

Tes dapat dilakukan menggunakan serum atau plasma manusia. Jika spesimen tidak
segera diuji mereka harus refrigrated pada 2-8oC. Untuk periode penyimpanan yang lebih
besar dari tiga hari, pembekuan dianjurkan. Spesimen dapat menghasilkan endapan yang
mengandung hasil tes yang tidak konsisten. Spesimen tersebut harus diklarifikasi sebelum
pengujian.
Peralatan yang diperlukan
Spesimen koleksi container, centrifuge, timer.

Reagen
Materi yang disediakan
Perangkat tes Delta HbsAg

Prosedur
Biarkan test strip, spesimen serum atau plasma, dan / atau kontrol untuk menyeimbangkan
untuk temprature ruangan (15-30°C) sebelum pengujian.
1. Bawa kantong untuk temprature kamar sebelum membukanya. Lepaskan strip tes dari
kantong yang disegel dan menggunakannya sesegera mungkin. Hasil terbaik akan
didapat jika pengujian dilakukan dalam waktu satu jam.
2. Dengan tanda panah menunjuk ke arah spesimen serum atau plasma, membenamkan
test strip secara vertikal dalam serum atau plasma selama 10-15 detik.
3. Tempatkan strip tes non-penyerap permukaan datar, menginterpretasikan hasil tes pada
20 - 30 menit.

Interpretasi
1. Sebuah pita warna akan muncul di bagian atas Result Window untuk menunjukkan
bahwa tes tersebut bekerja dengan benar. Pita ini adalah Pita Kontrol.
2. Bagian bawah Result Window menunjukkan hasil. Jika Pita warna lain muncul di
bagian bawah Result Window, pita ini Pita Test.

Hasil positif
 Kehadiran dua pita warna (pita "?" dan pita "C") di dalam Result Window tidak peduli
pita mana yang muncul pertamakali menunjukkan hasil positif (Gambar 2) Catatan:
Umumnya, semakin tinggi tingkat analit dalam spesimen, semakin kuat pita warna. Ketika
tingkat analit spesimen is close tapi masih dalam batas sensitivitas tes, warna "?" akan sangat
samar.
Hasil negatif
Kehadiran hanya satu pita warna ungu dalam Result Window menunjukkan hasil
negatif (gambar 2).

Hasil tidak valid

Jika setelah melakukan tes tidak ada pita yang terlihat dalam Result Window, hasilnya
dianggap tidak valid (Gambar 2). Arah mungkin belum diikuti dengan benar atau tes mungkin
deterioated. Disarankan bahwa spesimen kembali diuji.

Batasan tes
Sebuah hasil negatif tidak menghalangi kemungkinan infeksi dengan HBV. Tes klinis
lain yang tersedia diperlukan jika hasil yang diperoleh dipertanyakan. Seperti dengan semua
tes diagnostik, diagnosis klinis yang pasti tidak harus didasarkan pada hasil tes tunggal, tetapi
hanya harus dilakukan oleh dokter setelah semua temuan laboratorium klinis dan telah
dievaluasi.