REKAYASA GENETIKA
LAPORAN IV
(ISOLASI RNA DARI TANAMAN)
KHAIRUL ANAM
P051090031/BTK
BIOTEKNOLOGI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2010
0
ISOLASI RNA DARI TANAMAN
TUJUAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui dan memahami prinsip bagaimana cara
mengisolasi suatu gen dari hasil ekspresinya (pada jaringan tanaman).
TINJAUAN PUSTAKA
Identifikasi gen yang diekspresikan pada tahap perkembangan atau kondisi tertentu suatu
tanaman serta pengujian pola ekspresinya merupakan tahapan penting untuk mendapatkan informasi
tentang fungsi gen, baik yang berhubungan dengan proses diferensiasi, perubahan morfologi dan
metabolisme serta respons terhadap infeksi patogen. Salah satu cara yang dapat ditempuh untuk
mengidentifikasi gen atau bagiannya adalah melalui penapisan (screening) terhadap pustaka cDNA,
(complementary DNA) yaitu suatu pustaka yang merepresentasikan gen‐gen yang diekspresikan dalam
suatu jaringan, waktu, atau kondisi tertentu. Pustaka cDNA diperoleh melalui proses kloning sehingga
ratusan gen berbeda dimungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus. Identifikasi
cDNA spesifik dapat dilakukan melalui proses hibridisasi ataupun melalui proses amplifikasi PCR dengan
menggunakan primer spesifik untuk gen tertentu (Haris et al, 2005).
Dalam konstruksi pustaka cDNA, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA dependent DNA
polymerase) yakni reverse transcriptase (RT) digunakan untuk mengcopy messenger RNA (mRNA)
menjadi molekul cDNA utas ganda. Berbeda dengan mRNA yang dengan mudah terdegradasi dan
menggambarkan proses transkripsi dari gen‐gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cDNA
merupakan molekul yang lebih stabil sehingga sesuai untuk disisipkan ke dalam vektor kloning, baik
berupa plasmid, cosmid, atau bakteriofage. Populasi mRNA yang telah di copy menjadi cDNA apabila
diklon akan menghasilkan pustaka cDNA yang bersifat permanen. Keuntungan pustaka cDNA adalah
hanya mengandung sekuen yang terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi atau waktu
tertentu (Kleinsmith & Kish, 1995).
1
BAHAN DAN METODE KERJA
Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah daun tembakau, nitrogen cair, CTAB,
DEPC, LiCl, PCI, etanol 70%, bufer MOPS, formaldehida, dNTP, reverse transcriptase dan Taq
polymerase.
Metode
Isolasi RNA
1 gram daun tembakau segar ditimbang sambil di potong kecil dan dimasukkan ke dalam mortar
yang telah disteril. Ke dalam mortar yang berisi jaringan daun, ditambahkan larutan nitrogen cair,
biarkan menguap hingga tinggal sedikit, kemudian digerus cepat hingga terbentuk serbuk kering. Serbuk
kering dimasukkan ke dalam larutan 0,6 ml buffer CTAB di dalam tabung 1,5 ml dan diinkubasi pada
water bath dengan suhu 65°C selama 15 menit. Tabung dimasukkan ke dalam es lalu ditambah dengan
0,6 ml CI kemudian kocok dengan kuat. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu
4°C selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan diukur volumenya lalu ditambahkan
kedalamnya larutan LiCl 10 M, ¼ volume, kemudian diinkubasi di dalam lemari pembeku selama 2 jam.
Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan dibuang
dan pelet diresuspensi dengan 500 ul dH2O lalu diekstraksi menggunakan larutan fenol pH 9, 1x volume,
kemudian di vorteks dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit.
Supernatan diambil dan diekstraksi kembali menggunakan PCI pH 9, 1x volume, kemudian di veorteks
dan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan yang
diperoleh diambil dan dipindahkan pada tabung baru lalu ditambah dengan LiCl 10 M sebanyak ¼
volume yang kemudian diinkubasi di dalam lemari pembeku selama 1 jam agar pengendapan terjadi
lebih cepat. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit lalu
supernatan dibuang dan ditambahkan ke dalam tabung sebanyak 500 ul etanol 70%. Sentrifugasi
kembali dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 5 menit lalu buang supernatan dan pelet
yang tersisa dikeringkan. Setelah kering, pelet dilarutkan menggunakan 30 ul air DEPC.
Identifikasi RNA
Identifikasi dilakukan dengan gel terdenaturasi menggunakan elektroforesis. Gel dibuat dengan
melarutkan 0,4 g agarose dengan MOPS (20x) 2 ml, formaldehida 2,2 ml dan air DEPC 0,1% hingga
2
volume 40 ml. Untuk larutannya digunakan premix (12 ml/sampel; komposisi: 5% MOPS 20x, 50%
formamida, 17,5% formaldehida, 27,5% DEPC 0,1%) dan larutan RNA 5 ul (± 10 ug). Larutan dicampur
lalu dimasukkan ke dalam es selama 5 menit, kemudian ditambahkan ke dalamnya loading dye. Larutan
yang diperoleh di elektroforesis pada gel di dalam bufer MOPS 1x.
Reverse Transcriptase PCR
Tabung PCR diisi dengan larutan yang terdiri dari 2 ul first strand buffer 5x, 0,5 ul oligo (dt), 1 ul
dNTP mix, 1 ul RNA, 0,1 ul superscript TmRT, 5,4 ul DTT dan ddH2O hingga 10 ul. PCR dilakukan pada
kondisi annealing (penempelan) pada suhu 30oC selama 10 menit, pemanjangan dengan suhu 42oC
selama 50 menit, inaktivasi RTase pada suhu 95oC selama 5 menit dan pasca PCR pada suhu 15 oC selama
15 menit.
PCR
Produk RT PCR yang diperoleh di PCR kembali. Komposis PCR terdiri dari 1 ul dNTP, 0,5 ul taq
polymerase, 1 ul buffer mix, 0,4 ul DMSO, 1,5 ul cDNA, 0,5 ul primer SOD F, 0,5 ul primer SOD R dan
ddH2O hingga volume 10 ul. PCR dilakukan pada kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94oC selama
5 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 58oC selama 30
detik, pemanjangan 72oC selama 1 menit, pasca PCR 72oC selama 5 menit, pendinginan pada suhu 15oC
selama 15 menit. Semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus. Hasil PCR kemudian di
elektroforesis selama 30 menit.
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Dari hasil elektroforesis, dapat diketahui ada pita berbentuk smear dan pita lainnya yang
terbentuk. Pita ini merupakan pita dari RNA yang berhasil diisolasi.
Gambar 8. Elusi mRNA dari tanaman
Pembahasan
Seperti halnya isolasi DNA, isolasi RNA pun juga memiliki prinsip yang sama yang terdiri dari tiga
tahap, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi RNA, 3. Pengendapan RNA.
Proses lisis diawali dengan adanya penggerusan terhadap jaringan daun yang telah diberi
nitrogen cair. Tujuan dari penggerusan adalah untuk menghancurkan dinding sel tanaman dan
penambahan nitrogen cair bertujuan untuk menjaga RNA agar tidak mudah terdegradasi oleh protease
kuat seperti RNase dan menghilangkan kandungan air pada jaringan daun. Untuk lebih mengintensifkan
proses lisis, serbuk atau bubuk yang terbentuk dimasukkan ke dalam larutan CTAB. Larutan CTAB ini
berfungsi sebagai deterjen yang melisis membran sel dan dinding sel.
Setelah dilisis, larutan yang mengandung RNA kemudian diekstraksi dengan larutan CI. Larutan
CI berfungsii untuk mengikat lemak dan karbohidrat yang terkandung di dalam larutan. Dalam proses
ekstraksi, tabung eppendorf dimasukkan ke dalam es dengan tujuan agar CI yang sudah dimasukkan
tidak mudah menguap. Karena larutan polar yang mengandung RNA lebih ringan berat jenisnya
dibandingkan dengan CI , maka supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi, dikoleksi.
4
Larutan yang diperoleh kemudian di endapkan dengan menggunakan LICl. Larutan LiCl yang
diperlukan adalah larutan dengan konsentrasi LiCl mencapai 2,5 M. karena sifat dari RNA yang single
strand sehingga lebih mudah mengikat LiCl daripada DNA. Oleh karena itu, dalam persitiwa ini, endapan
yang terbentuk adalah endapan RNA dimana bobot molekul RNA menjadi lebih besar dibandingkan
dengan DNA. Penambahan LiCl jangan berlebih karena bisa RNA telah jenuh sehingga kemudian LiCl
berikatan dengan DNA dan mengendapkan DNA juga. Dengan peristiwa pengendapan, RNA dapat
dipisahkan dengan DNA.
Pelet yang diperoleh lalu diresuspensikan dengan dH2O yang kemudian diekstraksi kembali
dengan menggunakan PCI. Penggunaan PCI dimaksudkan untuk kembali mengekstraksi senyawa‐
senyawa organik yang ditakutkan masih terikut di dalam larutan RNA. Dari pelet yang terbentuk
kemudian dilarutkan dengan dH2O yang mengandung DEPC (dietil piro carbonat) 0,01%. Penggunaan
DEPC pada air yang digunakan dalam isolasi DNA atau pembilasan pada alat‐alat yang digunakan dalam
isolasi RNA diperuntukkan untuk menghindari RNA mengalami denaturasi akibat RNase. Adanya DEPC
menghambat kerja RNase.
RNA pada jaringan terdiri dari 3 jenis RNA, yaitu rRNA (ribosomal), tRNA (transport), mRNA
(messenger). rRNA memiliki konsentrasi yang paling besar diantara yang lain, yaitu sekitar 88%, sehingga
apabila terbentuk pita yang tebal pada hasil elektroforesis maka dapat diasumsikan pita tersebut adalah
tRNA diaman tRNA dengan bobot molekul yang lebih besar berada lebih dekat dengan sumur. mRNA
yang hanya sedikit terkandung di dalam jaringan (sekitar 2%) akan membentuk smear pada hasil
elektroforesis seperti yang terlihat pada gambar 1.
Untuk mendapatkan gen yang diinginkan, maka dari RNA yang berhasil diisolasi, dilakukan
reverse transcriptase PCR untuk mendapatkan cDNA. Proses transkripsi terbalik meliputi pembentukan
hybrid RNA‐DNA yang kemudian diikuti dengan pembentukan cDNA diawali dengan penempelan primer
yang berupa rantai poliT (oligo dT) dimana rantai ini secara spesifik akan menempel pada mRNA yang
telah mengalami pasca transkripsi yaitu penempelan poliA pada ujung 3’.
Setelah terbentuk cDNA, maka dilakukan PCR untuk mendapatkan gen SOD. Untuk
mendapatkan gen tersebut diperlukan primer spesifik yang dapat menempel dan mengamplifikasi gen
tersebut secara spesifik sehingga cDNA tersebut dapat diketahui mengandung gen SOD dan dapat
dijadikan sebagai pustaka cDNA.
5
SIMPULAN
1. Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa dalam mengisolasi RNA sangat diperlukan kehati‐
hatian dalam bekerja karena sifat RNA yang single strand sangat rentan dan mudah terdegradasi
(RNase ada dimana‐mana).
2. Proses isolasi RNA tahapannya mirip dengan mengisolasi DNA akan tetapi proses pemisahan
DNA dan RNA dilakukan dengan pengendapan menggunakan LiCl.
3. Pustaka cDNA dapat diperoleh dari mengisolasi mRNA dari suatu jaringan tanaman sebagai hasil
ekspresi dari sebuah gen target.
DAFTAR ACUAN
Kleinsmith, L.J. & V.M. Kish (1995). Principles of Cell and Molecular Biology. Second Edition. New York,
Harper Collins College Publish. 810 p.
Haris, N., Aswidinnoor, H., Suwanto A., Suhartono, M. T., Mathius, N. T., Purwantara, A. 2005. Konstruksi
pustaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037 yang diinfeksi patogen Corynespora cassiicola. Menara
Perkebunan, No. 73 (vol. 2), hal: 44‐62
6