III.

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental menggunakan post test only

control group design yang menggunakan evaluasi secara histopatologi.

Penelitian ini menggunakan penilaian histopatologi Salked score (Winanto et

al., 2013).

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober‒Desember 2015 dengan tempat

penelitian di animal house Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.

Pembuatan dan pengawetan bahan jaringan ALS‒R dilakukan oleh Bank

Jaringan Riset Batan (BJRB), Pasar Jumat, Jakarta. Pembuatan dan pengamatan

preparat secara mikroskopis dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi

Fakultas Kedokteran Universitas Lampung.

3.3 Identifikasi Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

3.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah ORIF dan ALS‒R.

 30

3.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat pada penelitian ini adalah penyatuan (union) fraktur femur

tikus Sprague Dawley

3.3.3 Definisi Operasional

Definisi operasional pada penelitian ini terdiri dari fraktur femur, ALS‒R,

ORIF, penilaian histopatologi seperti yang dijelaskan pada tabel 3.

Tabel 3. Definisi operasional

No Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Hasil Ukur Skala
Ukur
1. Fraktur Femur Tulang femur pada Tidak ada Tidak ada Kategorik
tikus Sprague
Dawley yang dibuat
fraktur transversal
dengan gergaji kecil
2. ALS‒R Selaput amnion yang Tidak ada Tidak ada Kategorik
diperoses secara
liofilisasi kemudian
disterilkan dengan
radiasi sinar γ yang
didapat dari Bank
Jaringan Riset Batan
3. ORIF Metode fiksasi Tidak ada Tidak ada Kategorik
interna dengan
pemasangan
intramedullary wire
pada fraktur femur
yang dibuat pada
tikus putih oleh
Spesialis Orthopedi
4. Penilaian Penilaian secara Menggunakan Nilai 0‒8 Ordinal
Histopatologi histolopatologi Salked score
proses penyembuhan
fraktur
 31

3.4 Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi penelitian ini adalah tikus putih jantan (Rattus novergicus) galur

Sprague Dawley yang telah dewasa berumur 2‒3 bulan, berat badan 200‒300

gram yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Coba Pusat Biomedis dan

Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes.

3.4.1 Kriteria Inklusi

a Tikus jantan

b Sehat

c Berumur 2‒3 bulan

d Berat badan 200‒300 gram

3.4.2 Kriteria Eksklusi

a Mati

b Tampak sakit (gerakan tidak aktif, tidak mau makan, rambut kusam atau

rontok)

3.4.3 Besar Sampel

Sampel penelitian sebanyak 30 ekor dipilih secara acak dan dibagi ke dalam

3 kelompok perlakuan sesuai dengan rumus Frederer. Rumus Federer yaitu :

(t − 1)(n − 1) > 15

Dengan t adalah jumlah kelompok perlakuan dan n adalah besar sampel tiap

kelompok, sehingga didapatkan jumlah sampel dengan rumus Frederer

sebagai berikut :
 32

(3‒1) (n‒1) > 15

2n ‒2 > 15

n > 8,5

sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 9 ekor (n>8,5)

dan jumlah kelompok yang akan digunakan adalah 3 kelompok. Penambahan

sampel untuk mencegah drop out sebesar 10%. Sehingga penelitian ini akan

menggunakan 30 ekor tikus Sprague Dawley dari populasi yang ada.

Pada penelitian ini sampel dibagi dalam tiga kelompok, yakni kelompok K,

P1, dan P2. Pada kelompok kontrol (K) tikus akan diberikan pakan standar

dan dibuat fraktur tanpa perlakuan khusus. Pada kelompok kedua (P1) tikus

diberikan pakan standar, dibuat fraktur dan diberikan perlakuan khusus

dengan dilakukan ORIF tanpa ALS‒R. Pada kelompok ketiga (P2) tikus

diberikan pakan standar, dibuat fraktur dan diberikan perlakuan khusus

dengan dilakukan ORIF dengan ALS‒R.

3.5 Alat dan Bahan Penelitian

3.5.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

a. Kandang hewan

b. Tempat pakan hewan

c. Tempat minum hewan

d. Alat tulis
 33

e. Handscoen

f. Spuit

g. Gergaji kecil (small saw)

h. Alat bedah minor

i. Mikroskop

j. Object glass

3.5.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

a. Hewan coba berupa tikus Sprague Dawley dengan berat badan 200‒300

g, berumur 2‒3 bulan. Hewan coba diberi pakan standar dan minum

secara ad libitum

b. Bahan Perlakuan

i. ORIF

ii. ALS‒R

c. Bahan untuk tindakan anasthesia berupa :

i. Ketamine 75 mg/kgBB

ii. Xylaxine 5 mg/kgBB

d. Bahan pembuatan preparat

i. Formalin 10%

ii. Paraffin block

iii. Hematoxyillin Eosin

 34

3.6 Prosedur Penelitian

3.6.1 Persiapan

Persiapan sebelum penelitian dilakukan pemilihan sampel tikus Sprague

Dawley yang didapatkan dari Laboratorium Hewan Coba Pusat Biomedis

dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes. Pembuatan ALS‒R

dilakukan di Bank Jaringan Riset Batan (BRJB), Pasar Jumat, Jakarta.

3.6.2 Adaptasi Tikus

Adaptasi tikus dilakukan bertujuan untuk memgurangi stres dan kematian.

Tikus sebanyak 30 ekor dibagi kedalam 3 kandang dan diadaptasi selama

3 hari sebelum perlakuan dimulai di animal house Fakultas Kedokteran

Universitas Lampung. Selama masa adaptasi tikus diberi makan berupa

pelet dan air secara ad libitum.

3.6.3 Prosedur Frakturisasi

Mengacu pada penelitian sebelumnya, proses frakturisasi tikus dengan

menggunakan gergaji kecil (small saw). Tikus di anastesi subkutan

dengan ketamin 75 mg/kgBB dan xylazine 5 mg/kgBB. Selanjutnya

dilakukan fraktur transversal pada mid diafisis os femur hingga

menunjukkan garis patahan pada periosteum.

3.6.4 Pembedahan

Setelah dilakukan frakturisasi, dilakukan fiksasi interna dengan

menggunakan ORIF. Pada kelompok K3 dilakukan pemasangan ALS‒R

 35

dengan implantasi pada bagian fraktur femur dengan ukuran 15x5 mm.

Pembedahan ini dilakukan dengan alat bedah minor steril.

3.6.5 Perawatan Pasca Pembedahan

Tikus diberikan gentamicin salep setelah pembedahan untuk

meminimalisir infeksi. Selama 5 hari pasca operasi tikus diberikan asam

mefenamat dan amoksisilin peroral. Luka operasi diobati dengan

menggunakan larutan betadine.

3.6.6 Pengambilan Jaringan dan Pembuatan Preparat

Proses penyembuhan fraktur terjadi selama 28 hari, selanjutnya dilakukan

euthanasia untuk diambil jaringan tulang femur. Pengambilan jaringan

dilakukan dengan menggunakan alat bedah minor steril. Jaringan

kemudian dimasukkan ke dalam pot sampel yang berisi formalin 10%.

Jaringan dikirimkan ke tempat pembuatan preparat di bagian Departemen

Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitass Lampung.

3.6.7 Pembuatan Preparat

Pembuatan preparat dilakukan dengan menggunakan paraffin block

selanjutnya dilakukan pewarnaan Hematoxyillin Eosin. Pembuatan

preparat dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Lampung.

 36

3.6.8 Pengamatan Preparat

Pengamatan preparat dilakukan dengan melihat jaringan tulang, fibrosis,

kalus, kartilago tulang dan bone union. Pengamatan dilakukan dengan

menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100x dan 400x di

Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas

Lampung.

3.6.9 Penilaian Histopatologi

Berdasarkan Salked score penilaian histopatologi proses penyembuhan

tulang yang telah dimodifikasi dapat dilihat pada tabel 4.

Tabel 4. Penilaian Salked score pada fraktur healing yang telah dimodifikasi
Kualitas dari penyatuan (union) Skor
Tidak ada tanda‒tanda fibrosis atau penyatuan lainnya 0
Penyatuan fibosis 1
Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago <25% 2
Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago 26‒50% 3
Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago 51‒75% 4
Fibrokartilaginosa atau penyatuan kartilago >75% 5
Kartilago termineralisasi dan penyatuan tulang 6
Woven bone (tulang anyaman) 7
Tulang matur 8
(Sumber: Winanto et al., 2013)
 37

3.7 Alur Penelitian

Pengajuan izin ke komisi etik

penelitian hewan coba

Adaptasi tikus selama 3 hari

Pengelompokkan tikus menjadi 3 kelompok,

masing‒masing berisi 10 tikus

Kelompok K Kelompok P1 Kelompok P2

Fraktur Femur dengan Fraktur Femur dengan Fraktur Femur dengan

gergaji kecil pada mid gergaji kecil pada mid gergaji kecil pada mid
diafisis os femur diafisis os femur diafisis os femur

Dilakukan ORIF Dilakukan ORIF

dengan intramedullary dengan intramedullary
nails nails dan diberikan
ALS‒R

Pada minggu keempat, tikus dieuthanasia menggunakan katemine 75‒100 mg/kgBB

xylazine 25‒50 mg/kgBB secara intraperitoneal dan terminasi

Pengambilan jaringan dan pembuatan preparat

Pengamatan dan penilaian secara histopatologi

 38

3.8 Analisis Data

Data dianalisis dengan menggunakan uji statistik dengan program komputer.

Uji normalitas dilakukan dengan uji Shapiro‒Wilk dan uji homogenitas

dilakukan dengan uji levene. Selanjutnya dilakukan, uji analisis non‒parametrik

Kruskal‒Wallis dan post hoc Mann‒Whitney.

3.9 Etika Penelitian

Penelitian ini telah dilakukan kaji etik dan disetujui oleh komite etik penelitian

Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dengan nomor

2476/UN26/8/DT/2015.