LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI UMUM

TEKNIK ISOLASI, PENANANAMAN (KULTIVASI), PEMURNIAN (PURIFIKASI)

DAN PENGHITUNGAN JUMLAH (ENUMERASI) MIKROBA

Dosen :

Dr. Hj. Ulfah Utami, M.Si.

Ir. Liliek Harianie, AR,. MP.

Nur Kusmiyati, M.Si.

Prilya Dewi Fitriasari, M.Sc.

Oleh :

Nama : Diah Lailil R.

NIM : 16620039

Kelas/ Kelompok : B/ 2B

Tanggal Praktikum : Jum’at, 16 Maret 2018

 LABORATORIUM MIKROBIOLOGI

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI MAULANA MALIK IBRAHIM

MALANG

2018

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang makhluk hidup yang berukuran
mikroskopis. Diantara makhluk hidup yang berukuran mikro tersebut adalah bakteri, virus,
protozoa yangmana semuanya tidak dapat dilihat dengan mata telanjang.

Mikrobia (meliputi virus, archae, bakteri, jamur, dan protozoa, dapat dikatakan sebagai
makhluk tertua dengan diversitas terbanyak di planet bumi.Mikroorganisme atau mikrobia
adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat
bantuan, mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik. Mikroba memang dapat
bertahan pada berbagai kondisi lingkungan, ekstrim panas, ekstrim dingin, lingkungan yang
berkonsentrasi garam tinggi, asam, basa, tekanan tinggi, bahkan di daerah yang mendekati
kemustahilan untuk hidup makhluk hidup lain seperti lingkungan dengan radioaktivitas tinggi
(Adam, 2001).

Al-Qur’an surah An-Nahl ayat 8 yang artinya “ Dan Allah menciptakan apa yang
tidak kamu ketahui ” (Q.S. An- Nahl: 8).
 Ayat diatas menjelaskan bahwa adanya makhluk ciptaan Allah yang tidak dapat
diketahui dengan mata telanjang, namun dapat dilihat dengan bantuan alat mikroskop.
Makhluk hidup tersebut juga membutuhkan tempat hidup dengan kondisi yang baik atau
memungkinkan dia agar tetap hidup. Tempat hidup mikroba disebut substrat atau medium,
yang mana didalamnya terdapat nutrisi yang bisa mendukung pertumbuhan mikroba tersebut.

Cara pengambilan dan penanaman (kultivasi) juga perlu diperhatikan, guna menjaga makhluk
hidup berukuran mikro (mikroba) tersebut dapat bertahan hidup saat menempati tempat
barunya. Pemurnian juga penting dilakukan dalam praktikum mikrobiologi agar mikroba atau
bakteri yang diamati tdak bias. Sehingga praktikum kali ini membahas tentang teknik
kultivasi (penanaman), pemurnian, dan perpisahan.

1.1 Rumusan Masalah

1. Bagaimana langkah-langkah dalam pengambilan sampel?
2. Bagaimana cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis?
3. Bagaimana teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba?
4. Bagaimana morfologi koloni mikroba pada media?
5. Bagaimana metode perhitungan jumlah mikroba Total Plate Count?

1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mempelajari langkah-langkah dalam pengambilan sampel

2. Untuk mempelajari cara-cara pemindahan mikroba secara aseptis
3. Untuk mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikroba
4. Untuk mempelajari morfologi koloni mikroba pada media
5. Untuk mengetahui metode perhitungan jumlah mikroba Total Plate Count.

1.3 Manfaat
Manfaat yang didapat dalam prkatikum ini yaitu praktikan mampu mengetahui teknik
dan prosedur dari isolasi mikroba secara aseptis pada beberapa media, mengetahui karakter
morfologi koloni mikroba yang diamati, serta mengetahui cara perhitungan jumlah mikroba
menggunakan metode Total Plate Count.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengenceran

Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau

memperkecil konsentran larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan, sehingga
volume berubah (Wardhaniah et.al, 2007). Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini
seringkali digunakan pengenceran. Di dalam laboratorium, pengenceran di lakukan dengan
botol pengenceran seperti lazimnya pada SPC, namun dapat pula menggunakan tabung
reaksi. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih dahulu dikocok dengan
baik sehingga kelompok sel dapat terpisah. Pengenceran sel dapat membantu untuk
memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang
terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya
relatif rendah (Hadioetomo,1996).
Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat yang mana
ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri. Sampel yang telah di
encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru kemudian di tuang ke mediumnya (metode
tuang). Kemudian setelah diinkubasi selama 24- 48 jam, amati koloni yang tumbuh dan
koloni yanng diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30- 300 koloni (Gobel, 2008).

Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi bakteri

yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah
contoh yang diduga lebih banyak menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri)
dan pada pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji
negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada
dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat
pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai maksimum dapat dihitung. Metoda pengenceran
yang paling mudah dengan melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau
5 tabung pengenceran sekali gus (Fridaz, 1992).

Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan
seterusnya, atau 1:100, 1:10000, 1:1000000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk
pengenceran dapat berupa larutan NaCl 0.9% dan bufer fosfat. Jumlah koloni dalam contoh
yang dihitung atau koloni/ml yaitu jumlah koloni per cawan dikali faktor pengenceran
(Adiprabowo,2008)

2.2 Metode-Metode Isolasi

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan

menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Isolasi
bakteri atau biakan yang terdiri dari satu jenis mikroorganisme (bakteri) dikenal sebagai
biakan murni atau biakan aksenik. Biakan yang berisi lebih dari satu macam mikroorganisme
(bakteri) dikenal sebagai biakan campuran, jika hanya terdiri dari dua jenis mikroorganisme,
yang dengan sengaja dipelihara satu sama lain dalam asosiasi, dikenal sebagai biakan dua-
jenis (Alam dkk, 2013).

Mikroorganisme tidak memerlukan banyak ruangan untuk perkembangannya, sebab

itu media buatan (agar) dapat dimasukkan ke dalam sebuah tabung percobaan labu atau
cawan Petri. Pada permulaannya tabung atau cawan Petri harus dalam keadaan steril (bebas
dari setiap mikroorganisme hidup) lalu setelah itu dimasukkan mikrobia yang diinginkan,
tabung atau cawan harus dilindungi terhadap kontaminasi dari luar. Sumber utama
pencemaran dari luar adalah udara, yang banyak mengandung mikroorganisme yang
berterbangan. Bentuk cawan petri, dengan tutup yang saling menyelubungi, dirancang untuk
mencegah pencemaran udara (Alam dkk, 2013).

Cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode
tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang
paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode
ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa
sehingga individu species dapat dipisahkan (pelczar, 1986).

Metode Isolasi Mikroba yang hidup di alam terdapat sebagai populasi campuran dari
bebagai jenis mikrobia yang berbeda prinsip dari isolasi mikrobia dalam memisahkan satu
jenis mikroba dengan mikroba lainnya dari lingkungannya dialam dan ditumbuhkan dalam
medium buatan. Pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dalam medium padat, karena dalam
medium padat sel-sel mikroba akan terbentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya, ada
beberapa teknik isolasi mikroba (Wati, 2013) antara lain:

1. Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan
agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik
ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas
dari streak jarum enten. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4
bagian.Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian
menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4
kali membentuk garis horisontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api
bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya
pada sisi cawan kedua.Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Pada
metode ini, goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan,
 sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula
selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan koloni
lain. Seluruh tahap hendaknya dilakukan secara aseptik agar tak terjadi kontaminasi
(Suriawiria, 2005).
2. Metode tuang atau pour plate dilakukan dengan 2 cara, yaitu dengan mencampur
solate bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada
petridisk atau dengan menyemprotkan solate pada dasar petridisk, kemudian menuang
medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada
tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga
terbentuk koloni tunggali,( Wati, 2013).

3. Metode sebar atau spread plate dilakukan dengan menyemprotkan solate 7 ke atas
medium agar kemudian menyebarkannya secara merata dengan trigalski. Dengan ini
diharapkan bakteri terpisah secara individual, kemudian dapat tumbuh menjadi koloni
tunggal (Wati, 2013).

2.3 Perhitungan

Koloni bakteri adalah sekumpulan dari bakteri-bakteri yang sejenis dan mengelompok
menjadi satu dan membentuk suatu koloni-koloni, untuk mengetahui pertumbuhan suatu
bakteri dapat dilakukan dengan mengjitung jumlah koloni bakteri. Metode yang biasanya
digunakan adalah metode pour plate (hitung preparat) yangmana metode ini mengasumsikan
jumlah bakteri yang ditanam pada suatu preparat sama dengan jumlah koloni pada preparat
tersebut. Untuk memudahkan menghitung koloni yang berjumlah ratusan pada metode ini
perhitungan dapat dilakukan dengan cara menghitung seperempat pada bagian preparat
dengan hasil perhitungan jumlah tersebut dikalikan empat. Peritungan pada metode ini
dibantu dengan alat Colony counter. Alat Colony counter masih mengharuskan para peneliti
pada laboratorium menghitung koloni secara manual, yakni dengan metode hiyung cawan.

Metode hitungan cawan merupakan cara yang akurat untuk menentukan jumlah
mikrob karena hanya sel yang masih hidup yang dihitung. Selain itu, beberapa jenis mikrob
dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrob. Bakteri
harus dapat tumbuh dalam medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas
(tidak menyebar) dan memerlukan persiapan waktu inkubasi relatif lama sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung (Adiprabowo, 2008)
 Prinsip dari metode hitung cawan ini adalah jika koloni tersebut masih renik atau
hidup, maka akan membentuk koloni dan dapat langsung dihitung menggunakan mata
telanjang. Metode hitung cawan dpat dibedakan menjadi dua yakni metode tuang (pour plate)
dan metode permukaan (surface/ permukaan). Dalam metode hitungan cawan, sampel dikira-
kirakan mengandung lebih dari 300 sel/ml dan memerlukan pengenceran sebelum tumbuh di
dalam cawan petri. Setelah dilakukan inkubasi biasanya akan terbentuk koloni dala cawan
tersebut dengan jumlah yang masih dapat dihitung, dimana jumlah terbaik adalah diantara 30-
300 koloni (Purwa,2012).

2.4 Bentuk Morfologi

Bakteri merupakan salah satu jenis mikroorganisme yang tidak bisa dilihat oleh mata
telanjang. Bakteri memiliki bentuk bermacam-macam yaitu, bulat, batang dan spiral (Pelczar,
1986). Menurut Pelczar pembagian bentuk koloni bakteri antara lain

a. Bakteri bentuk bulat

Bakteri berbentuk bulat dikenal sebagai basil. Kata basil berasal dari bacillus yang berarti
batang. Bentuk basil dapat pula dibedakan atas:

1. Basil tunggal yaitu bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal, misalnya
Salmonella typhi, penyebab penyakit tipus.
2. Diplobasil yaitu bakteri berbentuk batang yag bergandengan dua-dua.
3. Streptobasil yaitu bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang
membentuk rantai misalnya Bacillus anthracis penyebab penyakit antraks.

b. Bakteri bentuk bola

Bakteri berbentuk bola dikenal sebagai coccus, bakteri ini juga dapat dibedakan atas:

1. Monokokus, yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misalnya Neisseria gonorrhoeae,

penyebab penyakit kencing nanah.
2. Diplokokus, yaitu bakeri berbentuk bola yang bergandengan dua-dua, misalnya
Diplococcus pneumonia penyebab penyakit pneumonia atau radang paru-paru.
3. Sarkina, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat sehngga
bentuknya mirip kubus.
 4. Streptokokus, yaitu bakteri bentuk bola yang berkelompok memanjang membentuk
rantai.
5. Stafilokokus, yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelopok sel
tidak teratur sehingga bentuknya mirip dompolan buah anggur.

c. Bakteri bentuk spiral

Ada tiga mcam bentuk spiral (Pelczar, 1986)

1. Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral misalnya Spirillum.
2. Vibrio, ini dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna, misalnya Vibrio cholera
penyebab penyakit kolera.
3. Spiroseta yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang besifat lentur. Pada saat
bergerak, tubuhnya dapa memanjang dan mengerut.

Bakteri berbentuk spiral terutama dijumpai sebagai individu-individu sel yang tidak
saling melekat.Tercakup di dalam kelompok morfologis ini adalah spiroketa, beberapa
diantaranya menyebabkan penyakit yang berbahaya bagi manusia.Individu-individu sel dari
spesies yang berbeda-beda menunjukkan perbedaan-perbedaan yang mencolok dalam hal
panjang, jumlah, dan amplitudo spiralnya serta kekakuan dinding selnya. Sebagai contoh,
beberapa spirilum berukuran pendek, spiralnya berpilin ketat; yang lain sangat panjang dan
menunjukkan sederetan pelintiran dan lengkungan. Spiral yang pendek dan tidak lengkap
disebut sebagai bakteri koma, atau vibrio (Holt dan Bergey, 1994).
 BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum mikrobiologi Umum dengan tema “ Teknik Isolasi, Penanaman
(Kultivasi), Pemurnian (Purifikasi), dan Perhitungan jumlah (Enumerasi) Mikroba” telah
selesai dilaksanakan pada tanggal 9 dan 16 Maret 2018 yang bertempat di Laboratorium
Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam negeri
Maulana Malik Ibrahim Malang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah cawan petridan tabung reaksi
sebagai tempat isolasi pertumbuhan bakteri. Hot plate sebagai tempat pemasakan media.
Stirer sebagai alat pembantuk pengadukan saat pembuatan media.Vortex sebagai tempat
homogenkan bahan pengenceran. Inkubator alat isolasi bakteri agar bertumbuh kembang
dengan baik. Bunsen sebagai adal atat pemindah isolate bakteri dari media satu ke media
lain.Pipet tetes sebagai pembantu pengambilan barang yang bersifat cair. Spreader sebagai
alat pemindah isolasi bakteri dengan teknik spreader. Jarum ose sebagai alai pemindahan
isolasi bakteri. Spidol sebagai alat pembantu dalam perkembang biakan bakteri. Timbangan
analitik sebagai pembantu dalam proses penghitungan bahan. Spatula sebagai pembantu
proses pengambilan bahan. Mistar sebagai pengukur morfologi bakteri.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalalah Larutan NaCl 0,85% sebagai
larutan dalam proses pengenceran media bakteri. Alumunium foil sebagai alat penutup yang
digunakan dalam proses pembuatan mikroba. Tanah adalah sebagai media pembuatan bakteri
pada saat pengenceran Alkohol 70% sebagai bahan sterilisasi semua alat. Media PDA
sebagai awal penumbuhan bakteri dan NA sebagai media penumbuhan bakteri yang sudah di
cairkan. Suspensi mikroba sebagai bahan utama.
3.3 Cara Kerja

3.3.1 Teknik Serial Dilution

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

 1. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran
pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparassuspensi). Perbandingan
berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1: 9 (jika memakai teknik
pencucian dan pengolesan maka akuades/larutannya sudah termasuk pengencer
10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya sampai
homogeny atau menggunakan vortex.

2. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke

tabung 10-2 secara aseptis kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer.
Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang
sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu
diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang
berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan
cairan dari sumber yang sama.

3.3.2. Spread Plate Metode

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1.Pindahkan 0,1 mL suspensi berAlat

2.bakteri secara aseptis kepermukaan media yang telah memadat dalam cawan petri
menggunakan pipet.

3. Disterilisasi spreader/batang bengkok/batang Drigalsky dengan cara dicelupkan

dalam alkohol 70% kemudian dibakar dengan dilewatkan diatas api, biarkan
spreader dingin.

4. Ditebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan dibiarkan

sampai permukaan agar mengering.

5.Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya diinkubasikan secara terbalik

selama 24 jam pada suhu kamar ataupun inkubator dan diamati pertumbuhannya.

3.3.3 Pour Plate Methode

Langkah - langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1. Diteteskan 1 ml suspensi sel kedalam cawan petri kosong yang telah steril secara
aseptis.
 2. Dituangkan media agar yang hangat (suhu 45 – 50 °C) ke cawan yang telah berisi
suspensi bakteri tersebut dan ditutup.

3. Dihomogenkan campuran media dan suspensi dengan cara digoyangkan atau

diputar cawan petri secara perlahan membentuk angka delapan (8) di atas meja
yang rata dalam kondisi aseptis (Gambar 3).

4. Setelah agar memadat cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu
kamar ataupun inkubator selama 24 jam. diamati pertumbuhannya.

3.3.4 Streak Plate Methode

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1. Diperhatikan teknik transfer aseptis / dipindahkan biakan mikroba secara

aseptis. dipanaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian diberi
jarak dari bunsen dan diamkan hingga dingin.

2. Digunakan ose yang telah dingin untuk mengambil kultur murni bakteri (ambil
sebanyak 1 ose).

3. Digoreskan pada permukaan medium-agar dimulai dari satu ujung (Perhatikan

teknik / tipe penggoresan). Hati-hati saat menggores, jangan sampai medium
rusak, Ose yang disentuhkan pada permukaan medium sebaiknya tidak ditekan
terlalu dalam.

4. Setiap kali digoreskan ose untuk kuadran berikutnya, dipijarkan ose terlebih
dahulu dan biarkan dingin.

5. Diinkubasikan cawan petri berisi mikroba dengan posisi terbalik pada suhu
ruang atau pada suhu tertentu dalam incubator selama 24-48 jam dan amati
pertumbuhannya.

3.3.5. Goresan Sinambung

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah disentuhkan ujung
ose pada koloni dan digores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar. Diputar
cawan 1800 dandilanjutkan digoresan sampai habis.

3.3.6. Goresan T
 Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah ditandai bagian
luar-bawah cawan petri dengan dibagi cawan menjadi 3 bagian menggunakan spidol
marker, diinokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag. Dipanaskan jarum ose dan ditunggu
sampai dingin, kemudian dilanjutkan streak zig-zag pada daerah 2. Cawan diputar
untukmemperoleh goresan yang sempurna.

3.3.7. Goresan kuadran

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah ditandai bagian
luar-bawah cawan petri dengan dibagi cawan menjadi 4 bagian menggunakan spidol
marker, dinokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag/terputus. Dipanaskan jarum ose dan
tunggu dingin, kemudian dilanjutkan streak pada daerah 2. Cawan diputar untuk
memperoleh goresan yang sempurna. Dilakukan hal yang sama pada daerah 3 dan 4.

3.3.8. Cara Perhitungan Langsung

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1. Dibersihkan haemocytometer dan gelas penutupnya (coverslip) dengan digunakan

larutan deterjen, dibilas dengan akuades lalu bersihkan lagi dengan alkohol, dikeringkan
dengandianginkan atau ditempelkan lap atau pengering berbahan lembut (jangan
menggunakan tissue dengan serat yang kasar karena akan menggores kotak-kotak
haemocytometer).

2. Diletakkan haemocytometer beserta gelas penutupnya pada mikroskop, cari kotak-

kotak (ruang pengamatan) yang ada di haemocutometer dengan menggunakan
perbesaran lemah terlebih dahulu, jika sudah berhasil menemukan, dilanjutkan
perbesaran yang lebih kuat. Tentukan 5 kotak pengamatan yang akan dihitung
(umumnya dipilih kotak ukuran sedang pada pojok kanan atas, kanan bawah, kiri atas,
kiri bawah dan tengah)

3. Dihomogenkan suspensi mikroba (bakteri/yeast) yang akan dihitung jumlah selnya

dengan cara digojog menggunakan vortex.

4. Diambil sampel mikroba pipet steril dari media cair secukupnya (0,1 - 0,5 ml) lalu
dimasukkan ke dalam parit-parit pada haemocytometer (jangan sampai berlebihan).
Dipdierhatikan / dicari kembali kotak-kotak pengamatan.

5. Dihiitunglah jumlah sel mikroba dengan rumus

Jumlah sel/mL = Jumlah sel rata-rata tiap petak x 1000 x faktor pengenceran

Luas petak (mm2) x kedalaman petak (mm)

3.3.9 Penghitungan tidak langsung : hitung cawan / Angka Lempeng Total / Total
Plate

Count untuk bakteri / Angka Kapang Khamir (AKK) untuk jamur

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini ada alah

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 –
300

2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni
yang besar dimana jumlah koloni diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.

3. Dihitung Suatu deretan (rantai) yang terlihat sebagai suatu garis tebal sebagai satu
koloni.

4. Dilaporkan Data yang mengikuti peraturan yaitu hanya terdiri dari dua angka, yaitu
angka pertama di depan koma danangka ke dua dibelakang koma.

5. Dihitung Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni atau
yang terendah. Jikasemua pengenceran menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan
Petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung.

6. Dihitung nilai rata-ratanya Jika terdapat lebih dari satu cawan yang mempunyai
jumlah koloni yang memenuhi syarat, maka.

3.3. 10 Isolasi Bakteri Tanah

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1. Dicarilah lahan yang akan diambil sampel tanahnya.

2. Dicabuti rumput atau tanaman lain yang mungkin tumbuh di atas bagian lahan
yang akan diambil sampel tanahnya dan dipasang sarung tangan
 3. Ditancapkan auger. Jika tidak ada auger, bisa dilakukan dengan sendok atau
spatula steril. Tanah yang diambil minimal 4 cm dari permukaan tanah.
Masukkan tanah ke dalam plastik klip steril, bawa ke laboratorium

4. Ditmbang 1 gram sampel tanah dengan prosedur aseptis

5. Disiapkan tabung reaksi sebanyak 7 tabung berisi media NaCl steril untuk
proses dilusi (sipakan tabung berlabel 10-1 – 10-7), tiap tabung berisi 9 mL
NaCl steril.

6. Diasukkan tanah yang telah ditimbang ke dalam tabung pengenceran pertama

10-1 secara aseptis (dekat api)

7. Dihomogenkan tabung pada pengenceran pertama (10-1) menggunakan vortex,

pindahkan 1 mL ke tabung kedua (10-2) dan seterusnya diambil suspensi
sebanyak 0,1 mL pada tiga pengenceran terakhir untuk ditanam pada medium
NA yang telah ditambah antifungi menggunakan metode/teknik Pour Plate.

8. Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24-48 jam.

9. Dihitung koloni yang tumbuh dengan metode hitung cawan dan diamati
karakter morfologinya .

10. Koloni yang tumbuh terpisah atau yang berbeda karakternya dipilih untuk
kemudian dipurifikasi menggunakan metode streak plate .

3.3.11. Isolasi Kapang dari Tanah

Langkah-langkah yang harus dilakukan pada praktikum ini adalah

1. Dicarilah lahan yang akan diambil sampel tanahnya

2. Dicabuti rumput atau tanaman lain yang mungkin tumbuh di atas bagian lahan yang
akan diambil sampel tanahnya

3. Dipasang sarung tangan.

4. Ditancapkan auger. Jika tidak ada auger, bisa dilakukan dengan sendok atau spatula
steril. Tanah yang diambil minimal 4 cm dari permukaan tanah.

5. Dimasukkan tanah ke dalam plastik klip steril, bawa ke laboratorium

6. Ditiimbang 1 gram sampel tanah dengan prosedur aseptis

7. Disiapkan tabung reaksi sebanyak 7 tabung berisi media NaCl steril untuk proses
dilusi (sipakan tabung berlabel 10-1 – 10-7), tiap tabung berisi 9 mL NaCl steril.

8. Disiapkan media PDA pada cawan petri (tuang PDA hangat sebanyak 10-15 mL
dalam cawan petri secara aseptis, biarkan padat).

9. Dimasukkan tanah yang telah ditimbang ke dalam tabung pengenceran pertama 10-1
secara aseptis (dekat api)

10. Dihomogenkan tabung pada pengenceran pertama (10-1) menggunakan vortex,

pindahkan 1 mL ke tabung kedua (10-2) dan seterusnya diambil suspensi sebanyak 0,1
mL pada tiga pengenceran terakhir untuk ditanam pada medium PDA yang sudah
ditambah antibakteri menggunakan metode/teknik spread plate.

11. Diinkubasi pada suhu 20-25 oC selama 5-7 hari.

12. Dihitung koloni yang tumbuh dengan metode hitung cawan untuk
kapang/jamur(Lihat prosedur hitung cawan) dan amati karakter
morfologinya.

13. Dipilih koloni yang tumbuh terpisah atau yang berbeda karakternya dipilih untuk
kemudian dipurifikasi dengan cara diambil potongan hifa menggunakan batang kawat
ujung lurus (jarum enten) dan dipindahkan ke medium baru secara aseptis.

3.3.12. Isolasi Bakteri dari Kulit

Langkah-langkah yang harus dilkukan pada praktikum ini adalah

1. Dicelupkan swab steril ke dalam larutan NaCl 0,85 %

2. Dioles permukaan kulit dengan swab

3. Dioles swab ke media agar (NA dan PDA)

4. Diinkubasi selama 24 jam

5. Dilakukan pengamatan terhadap koloni mikroba

 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1. Pengenceran Sampel Bertingkat
No Perlakuan
1. Dicari lahan yang akan diambil
sampel bahannya
2. Ditancapkan sendok, tanah yang
akan diambil, minimal 5 cm dari
permukaan
3. Dimasukkan tanah ke dalam plastic
steril.
4. Ditimbang 1 gr sampel tanah dengan
prosedur aseptis
5. Disiapkan tabung flakon berisi NaCl
steril untuk proses dilusi
6. Dimasukkan tanah yang telah
ditimbang di tabung pengenceran
pertama 10-1
7. Dihomogenkan tabung pada Pengenceran telah homogen dimulai
Hasil
Ditemukan lahan untuk sampel
bahan
Tanah didapatkan pada kedalaman
kurang lebih 6 cm dari permukaan
Tanah tersimpan dalam plastic steril
Didapatkan 1 gr sampel tanah
Sudah disiapkan NaCl dalam tabung
flakon
Tabung pengenceran pertama 10-
1
terisi tanah 1 gram, sehingga
berubah warna menjadi coklat
 pengenceran pertama (10-1) dengan
4 vortex. Pindahkan 1 ml ke tabung
. kedua (10-2) dan seterusnya, diambil
suspense 0,1 ml pada tiga
T pengenceran terakhir untuk ditanam
a pada medium NA dan PDA
b
el 2. Morfologi K4
dari 10-1 hingga 10-7 dengan vortex,
telah diambil suspense pada
pengenceran 10-5 10-6 dan 10-7
sebanyak 0,1 ml yang kemudian di
tanam pada media NA dan PDA

.1.2 a. Isolasi Bakteri Tanah Koloni Bakteri

Media Koloni
No
Pengenceran Bentuk Tepi Tebal Warna Jumlah
-5
1. NA instan 10 Bulat smooth convex cream 6
2. NA instan 10-6 Bulat smooth Rata coklat 2
3. NA manual 10-6 Bulat Tidak Tidak coklat 1
rata rata
4. NA manual 10-7 Bulat Tidak coklat
rata
5. NA instan 10-7 Round Thread- convex putih 1
with line
scalloped
margin
6. PDA Sp1. Tidak Hilly Cream 1
Round rata
Sp 2. L. Tidak convex cream 1
form rata

4.1.2 b. Isolasi Bakteri Kapang

Tabel 3. Morfologi Koloni Kapang
No Media Karakteristik Koloni
Bentuk Tepi Permukaan Warna
1. PDA 10-7 Round Hilly hijau
2. PDA 10-7 L-Form Convex hijau

4.1.3. Isolasi bakteri kulit menggunakan teknik swab

No. Media Pengenceran Koloni
Bentuk Tepi Tebal Warna Jumlah
- - - - - -

4.1.4. Perhitungan
4.1.4.a. Perhitungan bakteri
No. Metode Pengenceran Jumlah perhitungan
1 Streak T 10-5 700 bakteri
2 Spread 10-7 10.006 . 106 bakteri
  Streak T (10-5)
Jumlah koloni: 7
7 ml= 7 x 10-3 µl
7×10−3
Jumlah bakteri: = 700
10−5
 Spread (10−7)
Jumlah koloni: 60 + 1010
6×102 107
 Jumlah bakteri tiap koloni: + 10−7 = 6 × 109 + 1014 =
10−7
10.006 × 107
4.1.4.b. Perhitungan kapang
No. Metode Pengenceran Jumlah perhitungan
1. PDA 10-5 104

4.2. Gambar hasil pengamatan

4.2.1. Isolasi bakteri tanah (media NA)
a. Pengenceran 10-5 pour plate
Foto Pengamatan
Keterangan
1. Media Agar (NA)
2. Bakteri dan Koloni

b. Pengenceran 10-6 pour plate

Foto Pengamatan Keterangan
 1. Media Agar (NA)
2. Bakteri dan Koloni

c. Pengenceran 10-7 pour plate

Foto Pengamatan Keterangan
1. Media Agar (NA)
2. Bakteri dan Koloni

4.2.2. Isolasi bakteri tanah (media PDA)

a. Pengenceran 10-5 spread plate
Foto Pengamatan Keterangan

a. koloni

a
 b. Pengenceran 10-6 spread plate
Foto Pengamatan Keterangan

c. Pengenceran 10-7 spread plate

Foto Pengamatan Keterangan

Media rusak

4.2.3. Isolasi bakteri kulit teknik swab

a. NA instan (steril)
Foto Pengamatan Keterangan
 1. Media Agar (NA)
2. Bakteri dan Koloni

b. NA instan (non-steril)
Foto Pengamatan Keterangan
1. Media Agar (NA)
2. Bakteri dan Koloni

4.2.4. Streak plate

4.2.4.1. Continous streak
a. Pengenceran 10-5
Foto Pengamatan Keterangan
Garis bersambung

b. Pengenceran 10-6
Foto Pengamatan Keterangan
 Garis bersambung

c. Pengenceran 10-7
Foto Pengamatan Keterangan
Garis bersambung

4.2.4.2. Goresan T (pengenceran 10-7)

Foto Pengamatan Gambar Literatur

(Dwyana,2012)

Keterangan: terbagi menjadi 3 wilayah

4.2.4.3. Kuadran
a. Kuadran A (pengenceran 10-5)
Foto Pengamatan Gambar Literatur

(Dwyana,2012)
Keterangan: terbagi menjadi empat wilayah, garis putus-putus
b. Kuadran B (pengenceran 10-6)
Foto Pengamatan Gambar Literatur
 (Dwyana,2012)

Keterangan: Garis bersambung zig-zag

4.3 Pembahasan
4.3.1. Pengenceran bertingkat
Berdasarkan hasil pengamatan pada praktikum ini menggunakan teknik pengenceran
bertingkat yang bertujuan agar menghasilkan bakteri yang murni dan pada saat diamati tidak
bias. Proses pengenceran tersebut dimulai dari pengeceraran 10-1 yang merupakan
pengenceran dari sampel tanah dengan volume tabung yang memiliki perbandingan 1:9.
Kemudian dilanjutkan dengan proses homogen dan pengenceran sampai 10-7. Hadioetomo
(1996) menyatakan bahwa pengenceran berfungsi agar perhitungan koloni menjadi mudah
dan benar serta menghidari bias. Adiprabowo (2008) menambahkan bahwa pengenceran
dilakukan dengan larutan NaCl 0,9% yang dimasukkan dalam tabung flakon. Pengenceran
bisa dimulai secara desimal mulai dari 10 sampai sampai 10-7.

4.3.2. Isolasi Bakteri Tanah (NA Dan PDA)

a. Spread Plate
Berdasarkan pengamatan pada saat praktikum spread plate merupakan salah
satu cara dalam proses isolasi bakteri dengan menggunakan medium NA. Cara
perlakuan yaitu diinolulasikan atau dikultivasi bakteri terlebih dahulu pada media
pengenceran, kemudian NA dituangkan pada cawan petri, ditunggu hingga media NA
mulai mengeras dan selanjutnya bakteri tersebut diisolasi ke media NA dengan proses
penebaran dengan menggunakan spreader secara merata sebelum spreader digunakan
dilakukan proses fiksasi bakteri pada spreader dengan nyala api Bunsen dan media
harus dekat dengan api bunsen. Setelah bakteri dikultivasi maka media dikeringkan
terdahulu sebelum dilakukan inkubasi. Setelah diinkubasi selama 24 jam, maka akan
dilakukan perhitungan dengan metode cawan. Pernyataan diatas didukung oleh
 pendapat Wati (2013) yang menyatakan bahwa metode spread plate merupakan
metode dimana media dituang terlebuh dahulu pada cawan petri, kemudian
disemprotkan bakteri diatas medium dan diratakan dengan spreader atau drigalsky,
yang diharapkan bakteri dapat tersebar secara merata.

b. Pour Plate
Berdasarkan pengamatan praktikum isolasi bakteri dengan pour plate yaitu
dengan menyemprotkan bakteri terlebih dahulu pada cawan petri, kemudian
dituangkan media agar hangat ke cawan petri yang berisi bakteri tersebut. Kemudian
dihomogenkan dengan cara mnggoyangkan cawan membentuk angka delapan di atas
meja yang aseptis kemudian di keringkan dan dilakukan inkubasi. Sehingga
didapatkan koloni bakteri.
Pernyataan diatas sesuai dengan pendapat wati (2013) yang menyatakan bahwa
metode tuang dilakukan dengan menyemprotkan bakteri pada medium cawan petri.
Terdapat 2 macam cara untuk mengaplikasikan metode ini, yaitu dengan mencampur
solate bakteri dengan medium agar pada suhu 50ºC kemudian menuangkannya pada
petridisk atau dengan menyemprotkan solate pada dasar petridisk, kemudian menuang
medium agar keatasnya dan diaduk. Setelah agar mengeras, bakteri akan berada pada
tempatnya masing-masing dan diharapkan bakteri tidak mengelompok sehingga
terbentuk koloni tunggal.

4.3.3. Isolasi Bakteri Kulit Teknik Swab

a. Steril
Berdasarkan pengamatan praktikum proses isolasi bakteri kulit dengan teknik
swab yaitu pertama wajah yang akan diisolasi bakteri di semprotkan alkohol agar
kulit wajah steril dari mikroorganisme, kemudian dilanjutkan dengan pencelupan
pada larutan NaCl dengan menggunakan cotton bad untuk mengambil bakteri yang
berada dikulit. Dilanjutkan dengan pengolesan swab bakteri kulit diatas media NA,
setelah itu dinkubasi selama 24 jam. Dan hasil dari swab steril adalah tidak
ditemukan mikroba.
c. Non-steril
Berdasarkan pengamatan praktikum proses isolasi bakteri kulit dengan teknik
swab yaitu pertama kulit leher yang akan diisolasi bakteri tidak di semprotkan alkohol
 agar kulit leher terdapat mikroba kemudian cotton bud dicelupkan pada larutan NaCl
yang berfungsi sebagai pengikat mikroorganisme. Kemudian dilanjutkan dengan
pengolesan menggunakan cotton bad untuk mengambil bakteri yang berada dikulit.
Dan hasil olesan pada cotton bud dioleskan diatas media NA, setelah itu dinkubasi
selama 24 jam. Pelakuan ini akan membedakan wajah steril dan non steril Namun
setelah diinkubasi tidak didapatkan adanya koloni bakteri yang tumbuh dalam media.
.
4.3.4. Streak Plate
a. Continuous tabung reaksi (10-5, 10-6, 10-7)
Pengamatan ini dilakukan dengan cara aseptik yaitu dengan mendekatkan media
pada nyala api bunsen dan membakar ose sebelum digunakan kemudian caranya adalah.
Pengamatan ini dilakukan dengan media yang sama tetapi berbeda pengencerannya, yaitu
:
1. Pengenceran 10-5
Berdasarkan hasil pengamatan setelah proses inkubasi, pada pengenceran 10-5 dengan
media PDA terlihat adanya koloni yang tumbuh didalamnya yaitu terdapat 10.000
(104) koloni dengan warna koloni putih.
2. Pengenceran 10-7
Berdasarkan hasil pengamatan setelah proses inkubasi, terlihat pada cawan kedua
pengenceran 10-7 dengan media NA instan terdapat 56 x 104 koloni yang tumbuh dan
hanya ada satu jenis koloni bakteri di dalamnya.
3. Pengenceran 10-7
Berdasarkan hasil pengamatan pada media pengenceran 10-7 dengan media PDA
dapat diketahui terdapat 104 koloni yang tumbuh didalamnya. Di cawan ini tidak
hanya yang tumbuh koloni bakteri saja namun terdapat koloni bakteri lain yang
tumbuh dengn bentuk dan warna yang berbeda.
c. T (10-5)
Berdasarkan hasil pengamatan teknik yang di lakukan dengan cara goresan T.
teknik goresan T yaitu mengambil bakteri manggunakan jarum ose dan kemudian
dibiakkan pada cawan petri dengan media NA tabung reaksi dengan penggoresan
berbentuk huruf T (cawan dibagi menjadi 3 bagian berbentuk T. Setelah
diperkembang biakan terbentuk 700 koloni yang hidup.
d. Kuadran A cawan petri (10-5)
 Berdasarkan hasil pengamatan teknik yang digunakan dalam metode ini yaitu
goresan quadran A pada media NA dengan pengenceran 10-5. Menurut Ramesh
(2013) NA merupakan media yang digunakan sebagai tempat menumbuhkan bakteri.
Teknik goresan kuadran ini hampir sama dengan teknik goresan T perbedaannya
adalah pada quadran A cawan petri dibagi atas 4 ruang yang sama. Pembagian
ruangan ini agar mempermudah saat perhitungan. Teknik penggoresan pada quadran
harus searah agar koloni yang tumbuh tidak saling bertumpang tindih. Teknik ini
searah kearah kanan dan pada goresan yang terakhir jarak lebih lebar.
e. Kuadran B cawan petri (10-6)
Berdasarkan hasil pengamatan teknik yang digunakan adalah teknik quadran B
pada media NA dengan pengenceran 10-6. Media yang ditanami mikroba dengan
teknik ini akan melakukan 4 tahap penggoresan. Setiap goresan membentuk pola zig-
zag ke arah pusat dan setiap penggoresan harus saling berhubungan (tidak boleh
terputus), kecuali pada penggoresan keempat dimana pola zig-zag dibuat merenggang
dan semakin kedalamsemakin menyempit. Setelah dilakukan penggoresan pada
media, di inkubasi selama 24 jam. Kemudian diamati dan dihitung koloni yang
tumbuh didalamnya.
Berdasarkan pengamatan tersebut terlihat adanya koloni berwarna putih pucat
dengan bentuk koloni round. Isolasi dengan teknik penggoresan kuadran ini terlihat
adanya kontaminasi karena media yang digunakan rusak (pecah). Hal tersebut
disebabkan oleh penggoresan yang terlalu kedalam dan dilakukan pada saat media
belum benar- benar memadat.
 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan kita dapat diambil kesimpulan bahwa :

1. Langkah- langkah pengambilan sampel dapat dilakukan dengan serial delution

(pengenceran bertingkat/ berseri) dengan tujuan agar mendapatkan isolat murni dan koloni
yang diamati agar tidak bias.

2. Pemindahan bakteri dapat dilakukan dengan swab (positif dan negatif) yakni dengan
menggunakan cotton bud yang dioleskan pada kulit.

3. Isolasi dan penanaman mikroba dengan beberapa teknik yaitu : teknik spread plate, pour
plate, dan streak plate.

4. Mikroba memiliki beberapa morfologi yakni berbentuk bulat (round), round with
scalleform, dan L.form

5. Metode yang digunakan dalam perhitungan kali ini adalah metode cawan, yangmana
perhitungan dilakukan secara manual dengan menghitung koloni yang terdapat pada cawan
petri.
5.2 Saran

Saran yang dapat diberikan adalah agar pada setiap perlakuan dilakukan pengambilan
gambar dan dibuatkan laporan sementara sebagai data dari apa yang sudah dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Adam, Syamsunir. 1992. Dasar-dasar Mikrobiologi Parasitisme untuk Perawat. Jakarta:

Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Adiprabowo, H.2008.Potensi antibakteri campuran propolis trigona spp dan garam
kelapa terhadap Streptococcus mutans. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Bogor. Institut Pertanian Bogor.

Alam, M. S. 2013. Isolasi BakteriSelulolitik Termofilik Kompos Pertanian Desa Bayat,

Klaten, Jawa Tengah. Chem Info Journal, 1(1), 190-19.

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama.
Gobel, Risco, B dkk. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Makassar. Universitas
Hasanuddin.
Hadioetomo R. 1996. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.
Holt, et al. (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th. Edition. USA:
Williams and Wilkins Baltimore. Kathleen.
Pelczar. J. Michael dan Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta:
Universitas Indonesia.
Purwa,N , et al., 2012. Karakteristik bakteri Caviar nilem dalam perendaman Campuran
Larutan Asam Asetat Dengan Larutan Garam Pada Penyimpanan Suhu Rendah (5-
10℃). Jurnal Perikanan dan Kelautan, Vol. 3, No.4.
Ramesh, H. P. dan Tharanathan R. N. 2003.Carbohydrates-The Renewable Raw Materils
of High Biotechnological Value. Critical Review in Biotechnology. 23 (2) : 149-173.

Suriawiria U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Papas Sinar Sinanti.

Wati, Dwi Setiana, Rukmanasari Dwi Prasetyani. 2013. Pembuatan Biogas dari Limbah
Cair Industri Bioetanol Melalui Proses Anaerob (Fermentasi). Universitas
Diponegoro : Semarang.
Wijaya,R.C., et al., 2015. Perancangan Alat Penghitung Bakteri. Jurnal Teknologi
Informasi, Vol.10, No.29.