ANALISA KRITIS

UNTUK MEMENUHI TUGAS BIOMOLEKULER NUTRISI

FIRMAN HIDAYAT
171131045

PROGRAM KHUSUS STUDI S1-GIZI

SEKOLAH TINGGGI ILMU KESEHATAN

SURABAYA
2017/2018
I. IDENTITAS
Bibliografi : Darmo Handoyo dan Ari Rudiretna. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction (PCR). Pusat Studi Bioteknologi (Universitas Surabaya).
Vol. 9 No. 1

II. TUJUAN
Untuk mengetahui manfaat Teknik PCR pada analisis gen serta dampaknya terhadap
kemajuan sains dan teknologi.

III. FAKTA – FAKTA UNIK

 Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam
jumlah jutaan kali hanya dalam beberap jam
 Teknik PCR banyak dikembangkan melalui aplikasi praktis berupa :
a) Kloning hasil PCR
b) Sekuensing hasil PCR
c) Kajian evolusi molekuler
d) Deteksi mutasi (penyakit genetik, determinasi seks pada sel prenatal,
kajian forensik)
 Dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak terjadi 100 %, hal ini disebabkan
oleh target templat terlampau banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan
kemungkinan terjadi reannealing untai target.
 Polimerase DNA dapat digunakan untuk memperpanjang primer dengan adanya
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai.

IV. PERTANYAAN YANG DIMUNCULKAN

 Sebutkan tahapan siklus PCR ?
a) Pra-denaturasi
b) Denaturasi DNA templat
c) Penempelan primer pada templat (annealing)
d) Pemanjangan primer (extension)
e) Pemantapan (post-extension)
 Apa dampak suhu terhadap proses PCR ?
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah
satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu PCR. Suhu denaturasi templat
berkisar 93-95̊C. Bila suhu denaturasi terlalu tinggi akan menurunkan aktifitas
polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR, sedangkan suhu
terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak
sempurna.
V. KONSEP UTAMA
 Definisi dari PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara
invitro.
 Prinsip umum PCR
PCR melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai ganda DNA templat
dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga
mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel pada
daerah tertentu dari target DNA. Target DNA yang diinginkan akan meningkat
secara eksponensial setelah siklus keempat dan DNA non target akan meningkat
secara linier.
 Melakukan proses PCR diperlukan komponen- komponen sbb:
a) Templat DNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan
molekul DNA baru yang sama. Templat DNA dapat berupa DNA
kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA. Pembuatan DNA
templat dengan menggunakan metode lisis yang cepat dan sederhana
untuk pendedahan DNA kromosom ataupun DNA plasmid. Prinsip
metode lisis adalah perusakan dinding sel tanpa harus merusak DNA
yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan dinding sel umumnya
dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel menggunakan buffer
lisis. Komposisi buffer lisis digunakan tergantung dari jenis sampel.
b) Keberhasilan proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan.
Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA
target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus
hidroksi (-OH) pada ujung 3᾽ yang diperlukan untuk proses eksistensi
DNA. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database
GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju
belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil
analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui
mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat. Melakukan
perancangan primer harus terpenuhi kriteria – kriteria yaitu panjang
primer (berkisar 18-30 basa), komposisi primer (nukleotida yang sama
dihindari), melting temperature (TM primer antara 50-65̊C), interaksi
primer – primer (self-homology dan cross-homology dihindari).
c) dNTPS merupakan suatu campuran yang terdiri dari atas dATP, dTTP,
dCTP dan dGTP. Proses PCR dNTPS bertindak sebagai building block
DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.
d) Buffer PCR dab MgCl2
Reaksi PCR berlangsung pada kondisi pH tertentu sehingga diperlikan
buffer PCR yang berfungsi untuk menjamin pH medium. Diperlukan
 juga MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi
aktivitas DNA polimerase.
e) Enzim Polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi
polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim diperlukan untuk tahap
ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses
PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu
enzim ini bersifat termostabilsampai temperatur 95̊C
 Untuk hasil PCR yang optimal perlu dilakukan optimasi proses PCR yaitu :
a) Jenis polimerase DNA
terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda
dengan untuk DNA rantai pendek. Untuk panjang fragmen DNA lebih
besar dari tiga kilobasa akan memerlukan jenis polimerase dengan
aktivitas tinggi
b) Konsentrasi dNTPS, MgCl2 ; polimerase DNA
panjang target DNA kurang dari satu kilobasa biasanya digunakan
konsentrasi dNTPs sebanyak 100uM, sedangkan untuk panjang target
DNA lebih besar sari satu kilobasa diperlukan konsentrasi dNTPS
sebanyak 200 uM. Untuk panjang fragmen DNA kurang dari dua
kilobasa diperlukan 1,25 – 2 unit per uL campuran reaksi, sedangkan
untuk panjang fragmen DNA lebih besar dari dua kilobasa diperlukan 3 –
unit per 50 uL campuran reaksi
c) Suhu
Suhu denaturasi DNA templat berkisar anatra 93 - 95̊C. Bila suhu
denaturasi terlalu tinggi akan menurunkan aktifitas polimerase DNA
yang akan berdampak pada efisiensi PCR, sedangkan suhu terlalu rendah
dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna.
d) Buffer PCR
Jenis buffer PCR low-salt buffer dan high-salt buffer. Untuk panjang
DNA target antara 0-5 kilobasa biasanya diperlukan low-salt buffer
sedangkan untuk panjang DNA target lebih besar dari lima kilobasa
digunakan high-salt buffer
e) Waktu
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi
DNA templat, annealing dan ekstensi primer (selama 30 – 90 detik).
Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak templat DNA dan
sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA sedangkan waktu
denaturasi yang terlalu pendek akan menyebabkan proses denaturasi
tidak sempurna
VI. REFLEKSI DIRI
 Teknik PCR dapat didayagunakan (kadang dengan modifikasi) guna fasilitasi
analisis gen.
 PCR dapat digunakan untuk amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi
urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran
forensik, melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger print”
 Untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal harus sesuai dengan jenis, suhu,
konsentrasi, buffer PCR dan waktu.
 Penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap
kemajuan sains dan teknologi secara umum