BAB I

PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran
serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik
dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Benda
bercahaya seperti matahari atau bohlam listrik memancarkan spektrum yang lebar terdiri atas
panjang gelombang. Panjang gelombang yang dikaitkan dengan cahaya tampak itu mampu
mempengaruhi selaput pelangi mata manusia dan karenanya menimbulkan kesan subyektif akan
ketampakan (vision). Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang
gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380 nm), daerah visible (380
– 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada
panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk.

1.2. Tujuan
a. Mengetahui pengertian Spektrofotometer
b. Mengetahui kegunaan Spektrofotometer
c. Mengetahui prinsip kerja spektrofotometer
d. Mengetahui jadwal kalibrasi dari Specktrofotometer
e. Mengetahui cara mengkalibrasi spekrofotometer
 Bab 2
Pembahasan
2.1. Pengertian

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk
menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada
interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam spektrofotometri disebut
spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan
materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai
fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan gabungan dari alat optic dan elektronika serta
sifat-sifat kimia fisiknya. Dimana detector dapat mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan secara
tidak langsung cahaya yang diabsorbsi. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang
tertentu tergantung pada senyawa atau warna yang terbentuk.

Spektrofotometri UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Alat ini
menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu sumber cahaya UV dan sumber cahaya
Visible. Larutan yang dianalisis diukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampaknya. Konsentrasi
larutan yang dianalisis akan sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terapat dalam
larutan tersebut.

Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari warna yang
teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya terdapat pada tabel berikut ini :

Panjang gelombang Warna terlihat Warna

komplementer

<400 Ultraviolet -

400-450 Violet Kuning

450-490 Biru Jingga

490-550 Hijau Merah

550-580 Kuning Ungu

580-650 Jingga Biru

650-700 Merah Hijau

 >700 Inframerah

Tabel 1 Spektrum Warna

Sinar dari sumber cahaya akan dibagi menjadi dua berkas oleh cermin yang berputar pada
bagian dalam spektrofotometer. Berkas pertama akan melewati kuvet berisi blanko, sementara berkas
kedua akan melewati kuvet berisi sampel. Blanko dan sampel akan diperiksa secara bersamaan. Adanya
blanko, berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase dari sumber cahaya.

2.2. Prinsip Kerja

Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya monokromatik

melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan diserap, sebagian dipantulkan dan
sebagian lagi akan dipancarkan.

Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri

Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenai
suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu
molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi dari setiap atom yang ada hingga
terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi),
berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi.

Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron dari keadaan
dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisi elektronik. Apabila
cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron yang ada dalam atom atau elektron ikatan
pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi
pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada gelombang radio.

Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu yang ada
dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan cahaya yang memiliki
panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel sebagian akan diserap, sebagian akan
dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.

Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai
permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur adalah It/I0 atau
I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati materi (sampel)). Proses
penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel. dari gambar terlihat bahwa zat sebelum
melewati sel sampel lebih terang atau lebih banyak di banding cahaya setelah melewati sel sampel

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai
transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi:
 “jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau
ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal
larutan”.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya
yang hamburkan:

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati
sampel.

Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A= a . b . c atau A = ε . b . c

dimana:

A = absorbansi

b atau terkadang digunakan l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)

c = konsentrasi larutan yang diukur

ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)

a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan
memenuhi kriteria-kriteria berikut:

Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang gelombang
tunggal (monokromatis).
Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh molekul yang lain
yang ada bersama dalam satu larutan.

Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.

Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang diukur harus benar-
benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau suspensi yang ada di
dalam larutan.

Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan grafik
absorbansi versus konsntrasi.

(http://catatankimia.com/catatan/spektofotometri-uv-vis.html)

3. Bagian-bagian Spektrofotometer UV-Vis

1. Sumber cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang stabil

dan intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam :

a. Lampu Tungsten (Wolfram)

Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa. Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasinya berupa garis
lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian.

b. Lampu Deuterium

Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy radiasinya lurus, dan
digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

2. Monokromator

Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya tunggal
(monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-bagian monokromator, yaitu :

a. Prisma

Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang
baik dari radiasi polikromatis.
b. Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi sinar akan disebarkan merata,
dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan
dalam seluruh jangkauan spektrum.

c. Celah optis

Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi.
Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga
diperoleh panjang gelombang yang diharapkan.

d. Filter

Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya
berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih.

3. Kompartemen sampel

Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet merupakan wadah yang
digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Pada spektrofotometer double beam, terdapat
dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain
digunakan untuk menaruh blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam, hanya terdapat satu
kuvet.

Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :

a. Permukaannya harus sejajar secara optis

b. Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan

c. Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia

d. Tidak rapuh

e. Bentuknya sederhana

Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada pengukuran di
daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat
mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak digunakan pada saat pengukuran di daerah UV. Oleh karena itu,
bahan kuvet dipilih berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar dapat
melewatkan daerah panjang gelombang yang digunakan.

• UV : fused silika, kuarsa

• Visible : gelas biasa, silika atau plastik

• IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion

Bahan Panjang gelombang

Silika 150-3000

Gelas 375-2000

Plastik 380-800

Tabel 2 Bahan Kuvet Sesuai Panjang Gelombang

4. Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah menjadi sinyal
listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk angka-angka pada reader
(komputer).

Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :

Jenis detector λ range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan

Phototube 150 – 1000 arus listrik UV

Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis

Solid state 350 – 3000

Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR

Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR

Tabel 3 Jenis-jenis detektor berdasarkan panjang gelombang

Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :

- Mempunyai kepekaan tinggi

- Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

- Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi

- Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

5. Visual display

Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk %
Transmitan maupun Absorbansi.

4. Prosedur Kerja

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis di teruskan
melalui lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer.
Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal).
Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap
(diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh
detektor. Detektor kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang
diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam
sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.

5. Faktor-Faktor Penyebab Kesalahan Spektrofotometer

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam

mengukur konsentrasi suatu analit:

Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi
selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.

Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa
memiliki kualitas yang lebih baik.

Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal
ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang
digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

(http://wanibesak.wordpress.com/2011/07/04/pengertian-dasar-spektrofotometer-vis-uv-uv-vis/)

6. Cara Perawatan dan Penyimpanan Alat

1. Sebelum digunakan, biarkan mesin warming-up selama 15-20 menit.

2. Spektrofotometer sebisa mungkin tidak terpapar sinar matahari langsung, karena cahaya dari
matahari akan dapat mengganggu pengukuran.
3. Simpan spektrofotometer di dalam ruangan yang suhunya stabil dan diatas meja yang permanen.

4. Pastikan kompartemen sampel bersih dari bekas sampel.

5. Saat memasukkan kuvet, pastikan kuvet kering.

6. Lakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban secara teratur.

7. Hal-hal yang harus diperhatikan

1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna

Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut
harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan
menggunakan lampu UV.

2. Panjang gelombang maksimum

Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada
panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling
besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar
sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.

3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban

Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang
diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media
akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.
Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar
pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.

8. Kelebihan Spektrofotometer

1. Penggunaannya luas. Dapat digunakan untuk senyawa organic, anorganik dan biokimia yang
diabsorbsi pada daerah ultraviolet maupun daerah tampak

2. Sensitivitasnya tinggi. Batas deteksi untuk mengabsorbsi dapat diperpanjang menjadi 10-6 sampai
10-7 M

3. Selektivitasnya tinggi

4. Ketelitiannya baik
5. Pengukurannya mudah, dengan kinerja yang cepat

(http://pangestu-ayupangestu.blogspot.com/2011/12/spektrofotometer-uv-vis-dan.html)

9. Kalibrasi Spektrofotometer UV-Vis

Yang perlu dikalibrasi adalah panjang gelombang dan absorbansi

Kalibrasi Panjang gelombang

menggunakan filter gelas helium oksida yang memupnyai panjang gelombang acuan (nm) :

pasang filter gelas holium oksida pada kompartemen sampel dan kompartemen pembanding dibiarkan
kosong (udara)

Scan spektrum serapan holium oksida, bandingkan panjang gelombang spektrum yang diperoleh dengan
data panjang gelombang acuan.

Kalibrasi Absorbans

Buat larutan kalium dikromat 50 + 0,5 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam sulfat (larutan A)

Buat larutan kalium dikromat 100 + 1 mg dalam 1 liter 0,005 mol/L asam sulfat (larutan B)

buat larutan 0,005 mol/L asam sulfat sebagai pembanding dan bandingkan hasilnya dengan data acuan
(+ 2%)