PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN

METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA

KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID
PADA ENAM TANAMAN

NIKEN WIDYASTUTI

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
 ABSTRAK

NIKEN WIDYASTUTI. Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC,

DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam Tanaman.
Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan MOHAMAD RAFI.

Keadaan stres oksidatif merupakan keadaan ketidakseimbangan antara radikal bebas dan
antioksidan yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari tingkat sel, jaringan,
hingga ke organ tubuh. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan dari 6
tanaman obat dan menentukan hubungan antara aktivitas antioksidan dan kandungan
fenol serta flavonoidnya. Penelitian ini dilakukan menggunakan beberapa tanaman obat,
yaitu kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung.
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan 3 metode yaitu CUPRAC
(cupric ion reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), dan
FRAP (ferric reducing antioxidant power). Dari hasil penelitian diketahui bahwa semua
tanaman tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hasil pengukuran aktivitas antioksidan
dengan metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda nyata secara statistika. Walaupun
demikian metode CUPRAC dan FRAP menghasilkan urutan aktivitas antioksidan yang
sama dari 6 tanaman. Kandungan total fenol berkorelasi kuat dan searah dengan aktivitas
antioksidan tetapi tidak memiliki korelasi dengan flavonoid. Jadi, aktivitas antioksidan
tidak hanya bersumber dari golongan flavonoid.

ABSTRACT

NIKEN WIDYASTUTI. Measurement of Antioxidant Activity CUPRAC, DPPH, and

FRAP Method and their Correlation with Phenol and Flavonoids in Six Herbs. Under
direction of ELLY SURADIKUSUMAH and MOHAMAD RAFI.

Oxidative stress is the imbalance condition between free radical and antioxidants
that can cause oxidative damage in cell, tissues, organ, accelerates the aging process, and
emergence of diseases. This study aims to determine the antioxidant capacity of 6 herbs,
and the relationship between phenol and flavonoids content with their antioxidant
activity and relationship between phenol and flavonoids content in the ethanol extract of
some Indonesian herb, there are Orthosiphon stamineus, Sonchus avensis, Sida
rhombifolia, Guazuma umifolia, Andrographis paniculata, and Parkia biglobosa. The
measurement of antioxidant activity use 3 methods, that are CUPRAC (cupric ion
reducing antioxidant capacity), DPPH (2,2-diphenyl-1-pickrylhidrazyl), and FRAP
(ferric reducing antioxidant power). The research of the six herbs showed antioxidant
activity. Statistic test from three method antioxidant showed that measurement
antioxidant activity with CUPRAC, DPPH, and FRAP gave a significantly different
result, but CUPRAC and FRAP give the same response of the six herbs. The phenol has
no correlation with flavonoids content but have highly correlation with their antioxidant
activity. Flavonoids have no correlation with antioxidant activity.
PENGUKURAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN
METODE CUPRAC, DPPH, DAN FRAP SERTA
KORELASINYA DENGAN FENOL DAN FLAVONOID
PADA ENAM TANAMAN

NIKEN WIDYASTUTI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
 Judul Skripsi : Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode CUPRAC,
DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid
pada Enam Tanaman
Nama : Niken Widyastuti
NIM : G44076004

Disetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Ir. Elly Suradikusumah, MS Mohamad Rafi, S.Si, MSi

NIP 19450214 197010 2 001 NIP 19770316 200604 1 010

Mengetahui,
Ketua Departemen

Prof.Dr. Tun Tedja Irawadi, MS

NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal lulus:
 PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt atas segala karuniaNya
sehingga karya ilmiah berjudul Pengukuran Aktivitas Antioksidan dengan Metode
CUPRAC, DPPH, dan FRAP serta Korelasinya dengan Fenol dan Flavonoid pada Enam
Tanaman dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Mei sampai Agustus
2009 dan bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir. Elly Suradikusumah, MS dan
Bapak Mohamad Rafi, S.Si, MSi selaku pembimbing. Ungkapan terimakasih juga
penulis haturkan kepada Abah, Mamah, Mas Kris, Mbak Dypus, Teh Diah, dan Mas
Wahyu. Selain itu ucapan terima kasih diperuntukan kepada seluruh staf Laboratorium
Uji Pusat Studi Biofarmaka, Ibu Nunu, Ibu Salina, Ka Agung, Endi, Nio, Mbak Wiwi,
dan Pak Mul serta semua teman-teman.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2009

Niken Widyastuti
 RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 14 September 1984 sebagai anak ketiga
dari tiga bersaudara dari pasangan Iman Warsito dan Ida Mardiyah. Tahun 2002, penulis
lulus seleksi masuk Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor melalui jalur seleksi rapor.
Pada tahun 2005, penulis berkesempatan mengikuti praktik kerja lapangan di Balai
Pengujian Mutu Produk Perternakan, Bogor. Akhir tahun 2005 penulis lulus dari
Akademi Kimia Analisis dan tahun 2006 bekerja di Orang Tua group Divisi Sweet Water
Product. Tahun 2007, penulis melanjutkan pendidikan S1 kimia di IPB melalui jalur S1
Kimia Penyelenggaraan Khusus. Selama perkuliahan, penulis pernah mengajar di
bimbingan belajar BTA 8 dan bimbingan belajar Math Magic School. Agustus 2009,
Penulis juga berkesempatan untuk menjadi asisten praktikum pada program keahlian
Analisis Kimia di Diploma IPB.
 DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR TABEL ......................................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................... vii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................................. vii
PENDAHULUAN ........................................................................................................ 1
TINJAUAN PUSTAKA
Radikal Bebas dan Antioksidan .......................................................................... 1
Uji Aktivitas Antioksidan .................................................................................. 1
Fenol dan Flavonoid .......................................................................................... 2
Kumis Kucing ..................................................................................................... 2
Tempuyung ........................................................................................................ 2
Sidaguri .............................................................................................................. 2
Jati Belanda ........................................................................................................ 3
Sambiloto ............................................................................................................ 3
Kedaung ............................................................................................................. 3
Troloks ................................................................................................................ 3
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ................................................................................................... 4
Metode ............................................................................................................... 4
Analisis Data ...................................................................................................... 5
PEMBAHASAN
Ekstrak Tanaman ................................................................................................ 5
Aktivitas Antioksidan ......................................................................................... 5
Kandungan Total Fenol ...................................................................................... 7
Kandungan Total Flavonoid ............................................................................... 7
Hasil Uji Korelasi ............................................................................................... 8
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ............................................................................................................. 9
Saran ................................................................................................................... 9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................... 10
LAMPIRAN .................................................................................................................. 12

vi
 DAFTAR TABEL

Halaman
1. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC .................................................................. 5
2. Kapasitas antioksidan metode DPPH ........................................................................ 6
3. Kapasitas antioksidan metode FRAP ........................................................................ 6
4. Kandungan total fenol ............................................................................................... 7
5. Kandungan total flavonoid ........................................................................................ 7

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Stuktur dasar flavonoid ........................................................................................... 2
2. Tanaman kumis kucing ........................................................................................... 2
3. Tanaman tempuyung .............................................................................................. 2
4. Tanaman sidaguri ................................................................................................... 3
5. Tanaman jati belanda .............................................................................................. 3
6. Tanaman sambiloto ................................................................................................. 3
7. Tanaman kedaung ................................................................................................... 3
8. Stuktur troloks ........................................................................................................ 4
9. Hubungan total fenol dengan kapasitas antioksidan ............................................... 8
10. Hubungan total flavonoid dengan kapasitas antioksidan ........................................ 9
11. Hubungan total fenol dengan total flavonoid .......................................................... 9

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Bagan alir penelitian .............................................................................................. 13
2. Penentuan kadar air ................................................................................................ 14
3. Rendemen ekstrak kering ....................................................................................... 15
4. Kapasitas antioksidan metode CUPRAC ............................................................... 16
5. Kapasitas antioksidan metode DPPH ..................................................................... 17
6. Kapasitas antioksidan metode FRAP ..................................................................... 18
7. Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran kapasitas antioksidan .......................... 19
8. Penentuan total fenol .............................................................................................. 22
9. Kandungan total flavonoid ..................................................................................... 23

vii
 PENDAHULUAN
Antioksidan adalah zat penghambat reaksi
oksidasi akibat radikal bebas yang dapat
menyebabkan kerusakan asam lemak tak
jenuh, membran dinding sel, pembuluh darah,
basa DNA, dan jaringan lipid sehingga
menimbulkan penyakit (Subeki 1998). Suatu
tanaman dapat memiliki aktivitas antioksidan
apabila mengandung senyawaan yang mampu
menangkal radikal bebas seperti fenol dan
flavonoid.
Beberapa penelitian telah dilakukan untuk
melihat hubungan antara kandungan fenol,
flavonoid, dan aktivitas antioksidan. Hasil
penelitian Kao et al. (2007) menunjukkan
bahwa kandungan fenol dan flavonoid dalam
blackberry berbanding lurus dengan aktivitas
antioksidan. Sementara Khamsah et al. (2006)
dalam penelitiannya menyatakan bahwa
aktivitas antioksidan tidak hanya bergantung
pada kandungan total fenol tetapi juga
dipengaruhi oleh senyawa lain, seperti asam
ursolat, asam betulinat, dan asam oleat yang
terdapat dalam Orthosiphon stamineus.
Penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan beberapa tanaman obat, yaitu
kumis kucing, tempuyung, sidaguri, jati
belanda, kedaung, dan sambiloto. Ekstrak
etanol dari tanaman tersebut diukur nilai
kandungan fenol, flavonoid, dan aktivitas
antioksidannya. Pengukuran aktivitas
antioksidan dilakukan menggunakan 3
metode, yaitu DPPH (2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil), FRAP (ferric reducing
antioxidant power) dan CUPRAC (cupric ion
reducing antioxidant capacity. Penelitian ini
bertujuan menentukan aktivitas antioksidan
dari 6 tanaman obat. Selain itu, hubungan
antara kandungan fenol, total flavonoid dan
aktivitas antioksidannya juga ditentukan.
Diduga terdapat keterkaitan hubungan antara
kandungan total fenol, total flavonoid, dan
aktivitas antioksidan pada ekstrak etanol
beberapa tanaman obat Indonesia.
TINJAUAN PUSTAKA
Radikal Bebas dan Antioksidan
Radikal bebas adalah suatu molekul atau
atom yang mempunyai 1 atau lebih elektron
tidak berpasangan. Radikal ini dapat berasal
dari atom hidrogen, molekul oksigen, atau ion
logam transisi. Senyawa radikal bebas sangat
reaktif dan selalu berusaha mencari pasangan
elektron agar kondisinya stabil (Subeki 1998).
Radikal dapat terbentuk secara endogen
dan eksogen. Radikal endogen terbentuk
dalam tubuh melalui proses metabolism
normal di dalam tubuh. Sementara radikal
eksogen berasal dari bahan pencemar yang
masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan,
pencernaan, dan penyerapan kulit (Miller
1996). Radikal bebas dalam jumlah normal
bermanfaat bagi kesehatan misalnya,
memerangi peradangan, membunuh bakteri,
dan mengendalikan tonus otot polos
pembuluh darah serta organ-organ dalam
tubuh (Yuwono 2009). Sementara dalam
jumlah berlebih mengakibatkan stress
oksidatif. Keadaan tersebut dapat
menyebabkan kerusakan oksidatif mulai dari
tingkat sel, jaringan, hingga ke organ tubuh
yang mempercepat terjadinya proses penuaan
dan munculnya penyakit (Yuwono 2009).
Oleh karena itu, antioksidan dibutuhkan untuk
dapat menunda atau menghambat reaksi
oksidasi oleh radikal bebas.
Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat
dibedakan menjadi antioksidan endogen dan
eksogen. Antioksidan endogen terdapat secara
alamiah dari dalam tubuh sedangkan
antiosidan eksogen dari luar tubuh Percival
(1998). Antioksidan eksogen sendiri
dibedakan menjadi antioksidan alami dan
sintetik (Miller 1996).
Uji Aktivitas Antioksidan
Pengukuran aktivitas antioksidan dapat
dilakukan dengan beberapa metode di
antaranya CUPRAC, DPPH, dan FRAP.
Metode CUPRAC (Apak et al. 2007)
menggunakan bis(neokuproin) tembaga(II)
(Cu(Nc)22+) sebagai pereaksi kromogenik.
Pereaksi Cu(Nc)22+ yang berwarna biru akan
mengalami reduksi menjadi Cu(Nc)2+ yang
berwarna kuning dengan reaksi:
n Cu(Nc)2 2+ + AR(OH)n → n Cu(Nc)2+ +
AR(=O)n + n H+
Metode DPPH menggunakan 2,2difenil-1-
pikrilhidrazil sebagai sumber radikal bebas.
Prinsipnya adalah reaksi penangkapan
hidrogen oleh DPPH dari zat antioksidan
dengan reaksi sebagai berikut:
 2

Metode FRAP (Benzie & Strain 1996)
menggunakan Fe(TPTZ)23+ kompleks besi-
ligan 2,4,6-tripiridil-triazin sebagai pereaksi.
Kompleks biru Fe(TPTZ)23+ akan berfungsi
sebagai zat pengoksidasi dan akan mengalami
reduksi menjadi Fe(TPTZ)22+ yang berwarna
kuning dengan reaksi berikut:
Fe(TPTZ)2 3+ + AROH → Fe(TPTZ)22+ + H+
+ AR=O
Kumis kucing mengandung saponin, kalium
(Wirakusumah & Setyowati 1994), asam
rosmarinat, diterpenoid, triterpenoid
(Matkowski 2008), asam oleat, asam ursolat,
asam betulinat, 3-hidroksi flavon, 3’,4’-
dihidroksiflavon, dan 2’,3’-dihidroksiflavon
(Khamsah et al. 2006).

Fenol dan Flavonoid

Senyawaan fenol biasanya terdapat dalam

berbagai jenis sayuran, buah-buahan dan
tanaman. Turunan senyawaan fenol
merupakan metabolit sekunder terbesar yang
diproduksi oleh tanaman. Senyawaan ini
diproduksi dalam tanaman melalui jalur Gambar 2 Tanaman kumis kucing.
sikimat dan metabolisme fenil propanoid.
Senyawaan fenol dapat memiliki aktivitas Tempuyung
antioksidan, antitumor, antiviral, dan
antibiotik (Apak et al. 2007). Diantara Tempuyung (Sonchus avensis) termasuk
senyawaan fenol alami yang telah diketahui ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi
lebih dari seribu stuktur, flavonoid merupakan Magnoliophyta (Angiospermae), kelas
golongan terbesar (Subeki 1998). Flavonoid Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa
merupakan senyawa dengan bobot melekul Asterales, suku Asteraceae, genus Sonchus,
rendah dan memiliki stuktur dasar C6C3C6, spesies avensis. Tempuyung merupakan
yaitu terdiri atas 2 buah cincin benzena yang tanaman menahun yang tumbuh liar pada
dihubungkan dengan 3 karbon (Gambar 1). tanah lembap dan cukup sinar
Flavonoid terbagi menjadi 7 kelompok, yaitu matahari (Gambar 3). Tempuyung
antosianin, proantosianin, isoflavon, flavonon, mengandung kandungan senyawa kimia
flavonol, flavanol, dan flavon. Flavonoid seperti flavonoid (kaemferol, luteolin-7-O-
memiliki aktivitas antioksidan di dalam tubuh glukosida, dan apigenin-7-O-glukosida),
sehingga disebut bioflavonoid. kumarin, dan asam fenolat bebas (Sriningsih
et al. 2002).

Gambar 1 Stuktur dasar flavonoid (Apak et

al. 2007).
Gambar 3 Tanaman tempuyung.
Kumis Kucing
Sidaguri
Kumis kucing (Orthosiphon stamineus)
merupakan tanaman obat yang berasal dari Sidaguri (Sida rhombifolia) merupakan
wilayah Afrika tropis dan kemudian menyebar tanaman liar yang tersebar di seluruh daerah
ke Asia dan Australia. Kumis kucing masuk tropis. Tanaman ini dapat mencapai tinggi 2
ke dalam divisi Spermatophyta, subdivisi m (Gambar 4). Sidaguri masuk ke dalam
Magnoliophyta (Angiospermae), kelas divisi Spermatophyta, subdivisi
Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo Magnoliophyta (Angiospermae), kelas
Lamiales, suku Lamiaceae, genus Magnoliopsida (Dicotyledonae), ordo
Orthosiphon, spesies stamieus. Malvaves, suku Malvaceae, genus Sida,
Kumis kucing merupakan tanaman spesies rhombifolia. Daun tanaman ini
tahunan dengan tinggi 50-100 cm (Gambar 2). mengandung alkaloid, steroid, kalsium

oksalat, saponin, fenol dan asam amino
(Khalil et al. 2006).
Gambar 4 Tanaman sidaguri.
Jati Belanda
Jati belanda (Guazuma umifolia) termasuk
dalam divisi Spermatophyta, subdivisi
Magnoliophyta (Angiospermae), kelas
Magnoliopsida (Dicotyledonae), bangsa
Malvaves, suku Stercuiaceae, genus
Guazuma, spesies ulmifolia. Jati belanda
merupakan tanaman liar yang tingginya dapat
mencapai 2,2 m (Gambar 5). Kulit batang
tanaman ini mengandung glukosa dan asam
damar (Wirakusumah & Setyowati 1994).
Daunnya mengandung flavonoid, steroid,
triterpenoid, saponin, dan tanin (Umar 2008).
Gambar 5 Tanaman jati belanda.
Sambiloto
Sambiloto (Andrographis paniculata)
merupakan tanaman liar yang tingginya dapat
mencapai 80 cm (Gambar 6). Tanaman ini
banyak mengandung kalium dan garam
natrium (Wirakusumah & Setyowati 1994).
Gambar 6 Tanaman sambiloto.
3
Sambiloto termasuk dalam divisi
Spermatophyta, subdivisi Magnoliophyta
(Angiospermae), kelas Magnoliopsida
(Dicotyledonae), bangsa Scrophulariales, suku
Acanthaceae, marga Andrographis, spesies
paniculata.
Kedaung
Kedaung (Parkia biglobosa) merupakan
tanaman liar yang tingginya dapat mencapai
45 m (Gambar 7). Biji tanaman ini
mengandung glukosida, damar, tanin, dan
garam-garam alkali (Wirakusumah &
Setyowati 1994). Daun kedaung mengandung
asam oksalat dan asam hidroksinamat (Alabi
et al. 2005). Tanaman ini termasuk dalam
divisi Spermatophyta, subdivisi
Magnoliophyta (Angiospermae), kelas
Magnoliopsida (Dicotyledonae) bangsa
Fabales, suku Fabaceae, genus Parkia, spesies
biglobosa.
Gambar 7 Tanaman kedaung.
Troloks
Troloks atau senyawa 6-hidroksi-2,5,7,8-
tetrametilkroman-2-asam karboksilat dengan
bobot molekul 250,32 g/mol merupakan
antioksidan sintetik (Gambar 8). Secara
stuktur troloks serupa dengan α-tokoferol
kecuali penggantian rantai samping
hidrokarbon dengan gugus COOH. Troloks
berupa bubuk berwarna putih sampai kuning
dan memiliki titik leleh 189-195 °C. Senyawa
ini stabil selama 2 bulan pada suhu 22-45 °C
dan mempunyai aktivitas antioksidan yang
lebih tinggi dibandingkan α-tokoferol, BHA,
serta BHT (Belitz 1999). Troloks sering
dipergunakan sebagai standar dalam
pengukuran antioksidan. Koefisien TEAC
(troloks equivalent antioxidant capacity)
adalah konsentrasi troloks yang memiliki
kapasitas antioksidan yang ekuivalen dengan
sampel yang dianalisis. Kapasitas antioksidan
dari setiap metode dinyatakan dalam µmol
troloks/g ekstrak etanol tanaman.

Gambar 8 Stuktur troloks®.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah daun dan
batang dari 6 jenis tanaman obat, yaitu kumis
kucing, tempuyung, sidaguri, jati belanda,
sambiloto, dan kedaung, DPPH, Neokuproin
alkoholik, TPTZ , kuersetin, asam galat, dan
troloks produksi Aldrich, CuCl2·2H2O,
FeCl3·6H2O, Folin-Ciocalteu, dan AlCl3
produksi Merck. Peralatan yang digunakan
adalah spektrofotometer Shimadzu UV 2700.
Metode
Diagram alir penelitian ditunjukkan pada
Lampiran 1. Analisis dilakukan pada ekstrak
etanol dari daun kumis kucing, tempuyung,
sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung
yang meliputi analisis kuantitatif total fenol,
analisis kuantitatif total flavonoid, dan uji
aktivitas antioksidan menggunakan 3 metode,
yaitu CUPRAC, DPPH, dan FRAP.
Preparasi Sampel
Daun dan batang tanaman dikeringkan
kemudian dihancurkan dan diayak dengan
ukuran 100 mesh. Bahan ini kemudian
dipergunakan untuk pengujian selanjutnya.
Penentuan Kadar Air
(AOAC No 934.01 1998)
Sebanyak 1 g serbuk tanaman dimasukkan
dalam cawan porselen yang telah dikeringkan
dalam oven pada suhu 105 °C selama 30
menit. Cawan porselen yang telah berisi
simplisia tersebut dikeringkan dalam oven
pada suhu 105 °C selama 3 jam, didinginkan
dalam eksikator, lalu ditimbang bobotnya.
Penimbangan dilakukan sampai diperoleh
bobot tetap.
Ekstraksi Etanol (Macari et al. 2006)
Serbuk tanaman dimaserasi dalam etanol
70% selama 3 x 24 jam dengan nisbah serbuk
kering-etanol 1:13 (g/ml). Ekstrak dipekatkan
dengan penguap putar dan dikeringkan
dengan pengering beku kemudian ditimbang
untuk menentukan rendemen.
Analisis Kuantitatif Total Fenol (Slinkard &
Singleton 1977)
Sebanyak 0,1 ml ekstrak etanol tanaman
ditambahkan 3,9 ml akuades dan 0,5 ml
pereaksi Folin-Ciocalteu (1:10 dalam
akuades). Larutan tersebut didiamkan selama
3 menit kemudian ditambahkan 2 ml Na2CO3
20% dan diukur nilai absorbansnya pada
756,5 nm. Larutan asam galat digunakan
sebagai zat untuk membuat kurva kalibrasi.
Kandungan total fenol dalam ekstrak etanol
diekspresikan sebagai mg asam galat
ekuivalen/g serbuk kering.
Analisis Kuantitatif Total Flavonoid
(Pourmorad et al. 2006)
Sebanyak 0,5 ml ekstrak yang telah
diencerkan (1:10 g/ml etanol) ditambahkan
1,5 ml etanol; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml
natrium asetat 1 M; dan 2,8 ml akuades.
Campuran larutan tersebut dibiarkan selama
30 menit dan diukur absorbansnya pada 417
nm. Kuersetin digunakan untuk membuat
kurva kalibrasi. Kandungan total flavonoid
dalam ekstrak etanol diekspresikan sebagai
mg kuersetin /g serbuk kering.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode
CUPRAC (Apak et al. 2007)
Sebanyak 1 ml ekstrak dilarutkan dalam
etanol 96% ditambahkan 1 ml CuCl2·2H2O
0,01 M; 1 ml neokuproin etanolik 0,0075 M;
1 ml bufer amonium asetat pH 7 1M; dan 0.1
ml akuades. Larutan didiamkan selama 30
menit dan diukur absorbansnya pada 453,4
nm. Sebagai blangko digunakan campuran
larutan tanpa ekstrak. Kurva kalibrasi dibuat
menggunakan larutan troloks dengan berbagai
konsentrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan
dalam µmol troloks/g serbuk kering.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode
DPPH (Blois 1958 diacu dalam Hanani et al.
2005)
Sebanyak 1 ml larutan DPPH 1 mM
(dalam metanol) dimasukkan ke dalam tabung
reaksi. Ekstrak etanol tanaman dilarutkan
dalam metanol lalu dimasukkan ke dalam
tabung reaksi hingga volume larutan tepat 5
ml. Larutan tersebut didiamkan selama 30
menit dan diukur absorbansnya pada 515,5
nm. Larutan troloks dengan berbagai
konsentrasi digunakan untuk membuat kurva
kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan
dalam µmol troloks/g serbuk kering.
Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode
FRAP (Benzie & Strain 1996)
Pereaksi FRAP dibuat dengan campuran
bufer asetat 300 mM pH 3,6; TPTZ 10 mM
dalam 40 mM HCl; dan 20 mM FeCl3·6H2O
dengan nisbah 10:1:1. Sebanyak 150 µl
ekstrak ditambahkan 4,5 ml pereaksi FRAP
kemudian didiamkan selama 30 menit pada
suhu 30 °C dan diukur absorbansnya pada 598
nm. Larutan troloks dengan berbagai
konsentrasi digunakan untuk membuat kurva
kalibrasi. Kapasitas antioksidan dinyatakan
dalam µmol troloks/g serbuk kering.
Analisis Data
Data hasil penelitian diolah untuk melihat
korelasi total fenol, flavonoid dan aktivitas
antioksidan dengan CUPRAC, DPPH, dan
FRAP. Data kemudian diolah dengan
rancangan acak lengkap untuk melihat
pengaruh metode pengukuran terhadap nilai
aktivitas antioksidan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstrak Tanaman
Semua serbuk tanaman terlebih dahulu
ditentukan kadar airnya. Pengukuran kadar air
dilakukan untuk mengetahui daya simpan
suatu bahan. Kadar air kedaung, kumis
kucing, jati belanda, tempuyung, sambiloto,
dan sidaguri secara berurut adalah 8,35;
11,34; 8,32; 10,31; 11,13; dan 6,93% (b/b)
(Lampiran 2). Ekstraksi dilakukan dengan
etanol karena merupakan pelarut yang aman
digunakan dalam obat-obatan, sesuai dengan
lisensi Badan POM. Sementara penggunaan
etanol 70% didasarkan hasil penelitian Macari
et al. (2006), yaitu pengujian antioksidan
tanaman obat dalam etanol 70% menunjukkan
aktivitas yang tinggi dibandingkan dengan
dalam konsentrasi ataupun beberapa pelarut
lainnya. Sementara maserasi atau perendaman
dalam pelarut tanpa adanya pemanasan
bertujuan agar senyawaan yang terkandung
dalam contoh tidak rusak. Proses ini
dilakukan selama 3 hari kemudian dilanjutkan
dengan pemekatan dan pengeringan ekstrak.
Pengeringan ekstrak dilakukan dengan
pengering beku pada suhu -70 °C.
Rendemen hasil ekstraksi untuk kedaung,
kumis kucing, jati belanda, tempuyung,
sambiloto dan sidaguri secara berurut adalah
15,13; 15,44; 14,87; 11,57; 7,11; dan 7,16%
(Lampiran 3). Nilai rendemen ini berbeda
untuk setiap jenis tanaman bergantung pada
kandungan senyawa setiap tanaman itu
sendiri.
Aktivitas Antioksidan
Metode CUPRAC
Pada metode CUPRAC (cupric ion
reducing antioxidant capacity), kompleks bis-
neokuproin-tembaga(II) akan mengoksidasi
senyawaan antioksidan dalam ekstrak
tanaman dan mengalami reduksi membentuk
kompleks bis-neokuproin-tembaga(I). Secara
visual hal ini dapat dilihat dari perubahan
warna kompleks larutan dari biru toska
menjadi kuning. Pereaksi CUPRAC
merupakan pereaksi yang selektif karena
memiliki nilai potensial reduksi yang rendah,
yaitu sebesar 0,17 V (Apak et al. 2007). Hasil
pengukuran kapasitas antioksidan dengan
metode CUPRAC ditunjukkan pada Tabel 1.
Data selengkapnya dapat dilihat pada
Lampiran 4.
Tabel 1 Kapasitas antioksidan metode
CUPRAC
Kapasitas Antioksidan
Jenis Tanaman (μmol troloks/g serbuk
kering)
Sidaguri 11,8879
Sambiloto 17,2824
Tempuyung 45,8327
Jati belanda 194,9299
Kumis kucing 209,4936
Kedaung 548,9904
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis
kucing > jati belanda > tempuyung >
sambiloto > sidaguri. Kedaung dari data di
atas memiliki aktivitas antioksidan paling

tinggi yang diduga mengandung asam
hidroksinamat (Alabi et al. 2005). Asam
hidrosinamat termasuk golongan polifenol
dan dapat berperan sebagai zat antioksidan
karena memiliki atom hidrogen dari gugus
hidroksil yang dapat disumbangkan pada
radikal bebas.
Metode DPPH
Metode DPPH (2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil) merupakan senyawa radikal
nitrogen. DPPH akan mengambil atom
hidrogen yang terdapat dalam suatu senyawa,
misalnya senyawaan fenol. Mekanisme
terjadinya reaksi DPPH ini berlangsung
melalui transfer elektron. Larutan DPPH yang
berwarna ungu memberikan serapan
absorbans maksimum pada 515,5 nm.
Larutan DPPH ini akan mengoksidasi
senyawa dalam ekstrak tanaman. Proses ini
ditandai dengan memudarnya warna larutan
dari ungu menjadi kuning. Hasil uji aktivitas
antioksidan dengan metode DPPH dapat
dilihat pada Tabel 2 sementara data
selengkapnya ditunjukkan pada Lampiran 5.
Tabel 2 Kapasitas antioksidan metode DPPH
Kapasitas Antioksidan
Jenis Tanaman (μmol troloks/g serbuk
kering)
Sidaguri 17,9414
Sambiloto 16,1915
Tempuyung 71,4714
Jati belanda 126,5693
Kumis kucing 192,3260
Kedaung 450,5449
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis
kucing > jati belanda > tempuyung > sidaguri
> sambiloto. Hasil pengukuran ini berbeda
dengan pengukuran metode CUPRAC, yang
diduga karena perbedaan pelarut dan
sensitivitas metode. DPPH menggunakan
pelarut metanol sehingga kemungkinan
senyawa hidrofilik yang terekstrak dalam
metanol lebih banyak dibandingkan dalam
pelarut etanol. Metode DPPH ini mudah
digunakan, cepat, cukup teliti (Prakash 2001),
dan baik digunakan dalam pelarut organik,
khususnya alkohol (Apak et al. 2007). Metode
ini juga sensitif untuk menguji aktivitas
antioksidan dalam ekstrak tanaman
(Pourmorad et al. 2006). Akan tetapi, metode
DPPH kurang sensitif untuk mengukur
6
aktivitas antioksidan selain dari senyawaan
fenol (Apak et al. 2007)
Metode FRAP
Pengujian aktivitas antioksidan dengan
metode FRAP (ferric reducing antioxidant
power) didasarkan atas kemampuan senyawa
antioksidan dalam mereduksi senyawa
besi(III)-tripiridil-triazin menjadi besi(II)-
tripiridil triazin pada pH 3,6. Hasil pengujian
dengan FRAP ditunjukkan pada Tabel 3
sedangkan data selengkapnya di Lampiran 6.
Tabel 3 Kapasitas antioksidan metode FRAP
Kapasitas Antioksidan
Jenis Tanaman (μmol Troloks/g serbuk
kering)
Sidaguri 3,8515
Sambiloto 5,4021
Tempuyung 10,2304
Jati belanda 14,3581
Kumis kucing 23,7300
Kedaung 90,1591
Kapasitas antioksidan kedaung > kumis
kucing > jati belanda > tempuyung >
sambiloto > sidaguri. Pengukuran FRAP
memberikan urutan respons yang sama
dengan metode CUPRAC. Namun hasilnya
menunjukkan aktivitas yang lebih kecil
dibandingkan dengan data pengujian
CUPRAC ataupun DPPH. Hal ini diduga
karena larutan FRAP bersifat kurang stabil
sehingga harus dibuat secara in time dan harus
segera dipergunakan (Then et al. 2003).
Menurut Ou et al. (2002), pengukuran
antioksidan dengan metode FRAP dapat
berjalan akurat apabila dilakukan pada
senyawaan antioksidan yang bisa mereduksi
Fe(III)TPTZ pada kodisi reaksi secara
termodinamika dan memiliki laju reaksi yang
cukup cepat. Selain itu, antioksidan yang
teroksidasi dan semua produk reaksi
sekundernya harus tidak memiliki serapan
maksimum pada absorbansi 598 nm atau
serapan Fe(II)TPTZ.
Pada kenyataannya kondisi ini sulit
ditemui dan tidak realistis (Apak et al. 2007),
Menurut Ou et al. (2002), hal ini disebabkan
oleh beberapa faktor, yaitu karena nilai
potensial reduksi standar dari Fe (III)/Fe(II)
adalah 0.77 V sehingga senyawa apapun
dengan nilai potensial reduksi dibawah 0.77 V
dapat mereduksi Fe(III) menjadi Fe(II) dan
memberikan kontribusi pada pengukuran
 7

antioksidan dengan metode FRAP. Selain itu,
tidak semua antioksidan dapat mereduksi
Fe(III) dengan waktu yang sesuai dengan
waktu inkubasi. Menurut Pulido et al. (2000),
absorbans dari beberapa senyawaan fenol
seperti asam kafeat, asam ferulat, kuersetin,
dan tanin tidak stabil dalam pengukuran
FRAP karena waktu inkubasi yang
dibutuhkan lebih lama dibandingkan dengan
waktu inkubasi FRAP. Senyawaan
antioksidan tipe-S seperti glutation juga
membutuhkan waktu reaksi yang lebih lama
sehingga tidak dapat diukur dengan metode
FRAP (Ou et al. 2002). Penyebab lainnya,
senyawaan pengganggu dapat memiliki
serapan absorbans maksimum pada daerah
pengukuran FRAP. Hal ini berlaku untuk
contoh bahan alam yang memiliki banyak
senyawa pengganggu sehingga FRAP tidak
cocok untuk diaplikasikan pada contoh
biologis.
Uji-F dan Uji-t
Pengukuran aktivitas antioksidan metode
CUPRAC, DPPH dan FRAP pada enam
tanaman obat memberikan hasil yang berbeda
sehingga perlukan uji-F dan uji-t.
Berdasarkan perhitungan nilai uji-F
didapatkan nilai Fhitung untuk setiap jenis
tanaman lebih besar dari F0,05(2,6) artinya
minimal ada sepasang metode yang
memberikan hasil berbeda nyata. Oleh karena
itu, dilakukan uji lanjutan, yaitu uji-t yang
menunjukkan bahwa setiap tanaman pada
ketiga metode memberikan hasil yang berbeda
nyata (Lampiran 7).
Tabel 4 Kandungan Total Fenol
Jenis Total fenol
Tanaman (mg as galat/
g serbuk kering)
Sidaguri 4,9318
Sambiloto 5,2348
Tempuyung 12,0633
Jati belanda 20,2204
Kumis kucing 24,5345
Kedaung 57,2686
Data kandungan total fenol selengkapnya
dapat dilihat pada Lampiran 8. Dari hasil
percobaan diketahui kandungan total fenol
kedaung > kumis kucing > jati belanda >
tempuyung > sambiloto > sidaguri. Kedaung
memiliki kandungan total fenol yang paling
besar di antara 5 tanaman herbal lainnya
Kandungan Total Flavonoid
Kandungan total flavonoid diukur
berdasarkan keberadaan kuersetin di dalam
ekstrak tanaman. Analisis kandungan
flavonoid dilakukan dengan penambahan
pereaksi AlCl3. Sebagai asam lewis, AlCl3
akan membentuk ikatan kompleks dengan
gugus hidroksil dari senyawaan flavonoid.
Perubahan ini diidentifikasi melalui absorbans
pada daerah sinar tampak melalui alat
spektofotometer. Semakin banyak kandungan
senyawa flavonoid dalam suatu ekstrak maka
secara visual warna kuning yang terbentuk
akan semakin pekat. Kandungan total
flavonoid dari setiap tanaman ditunjukkan
pada Tabel 5. Data kandungan total flavonoid
selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 9.

Kandungan Total Fenol Tabel 5 Kandungan Total Flavonoid

Total flavonoid
Pengukuran kandungan total fenol Jenis Tanaman (mg kuersetin/g serbuk
dilakukan dengan penambahan pereaksi kering)
Folin-Ciocalteau. Folin-Ciocalteau adalah Sidaguri 0,4153
pereaksi anorganik yang dapat membentuk
larutan kompleks dengan senyawaan fenol. Sambiloto 0,4598
Warna yang terbentuk dapat dideteksi oleh Kumis kucing 0,6600
sinar tampak pada panjang gelombang 756,5 Tempuyung 0,7537
nm. Senyawa fenol sebagai metabolit Kedaung 2,0835
sekunder dalam tanaman berpotensi sebagai Jati belanda 3,0480
zat antioksidan. Hal ini disebabkan oleh
keberadaan gugus hidroksil dalam senyawaan
Berdasarkan data tersebut kandungan total
fenol. Gugus hidroksil dapat berfungsi
flavonoid jati belanda > kedaung >
sebagai penyumbang atom hidrogen ketika
tempuyung > kumis kucing > sambiloto >
bereaksi dengan senyawa radikal melalui
sidaguri. Urutan ini tidak sama dengan urutan
mekanisme transfer elektron sehingga proses
kandungan total fenol, berarti tingginya
oksidasi dihambat. Hasil pengukuran total
kandungan total fenol tidak hanya disebabkan
fenol ditunjukkan pada Tabel 4.
oleh golongan flavonoid. Perbedaan ini
 8

kemungkinan disebabkan oleh ketidak-

sensitifan metode ini dalam menguji semua (b)
golongan flavonoid. Menurut Apak et al.
(2007), metode pengujian dengan
y = 8,353x – 27,15
menggunakan AlCl3 memiliki kekurangan. r = 0,998
AlCl3 juga dapat mengkompleks beberapa R2= 0,996
kelompok dari flavonoid seperti flavon
(krisin, apigenin, dan luteolin) dan flavonol
(kuersetin, mirisetin, morin, dan rutin) tetapi
tidak dapat mengkompleks golongan flavanon
dan flavanonol.

Hasil Uji Korelasi

Total Fenol dengan Aktivitas Antioksidan

Senyawaan fenol adalah senyawaan kimia

yang berpotensi sebagai antioksidan, tetapi
(c)
aktivitas antioksidan tidak hanya disebabkan
oleh senyawaan fenol. Senyawaan triterpena
pentasiklik, vitamin C, zat warna seperti y = 1,643x – 9,418
r = 0,978
klorofil, senyawaan sulfur, ataupun nitrogen R2= 0,956
dapat berperan sebagai zat antioksidan
(Khamsah et al. 2006). Analisis korelasi
antara total fenol dan aktivitas antioksidan
menggunakan metode CUPRAC, DPPH, serta
FRAP bertujuan untuk menentukan kedekatan
hubungan antara total fenol dan aktivitas
antioksidan.
Hasil analisis korelasi ditunjukkan pada
Gambar 9. Dari analisis korelasi tersebut
Keterangan:
didapatkan nilai korelasi untuk kandungan 1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung,
total fenol terhadap aktivitas antioksidan 4) jati belanda, 5) kumis kucing, dan 6) kedaung.
metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP adalah
sebesar 0,995; 0,998; dan 0,978. Hal ini Gambar 9 Hubungan total fenol dengan
berarti terlihat hubungan korelasi yang positif aktivitas antioksidan (a)
dan kuat antara total fenol dan aktivitas metode CUPRAC, (b) metode
antioksidan dengan ketiga metode tersebut. DPPH, dan (c) metode FRAP.
Dari hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa
aktivitas antioksidan disebabkan oleh
kandungan total fenol dari suatu tanaman. Total Flavonoid dengan Aktivitas
Antioksidan

Senyawaan flavonoid dapat memiliki

(a) aktivitas antioksidan sehingga dilakukan uji
korelasi. Hasil korelasi ditunjukkan pada
y = 10,40x – 44,12 Gambar 10. Hasil uji korelasi (r) total
r = 0,995
R2= 0,989
flavonoid dengan aktivitas antioksidan
metode CUPRAC, DPPH dan FRAP masing-
masing sebesar 0,589; 0,495; dan 0,430. Nilai
(r) ini mendekati nol sehingga dapat
dinyatakan bahwa total flavonoid tidak
berkorelasi dengan aktivitas antioksidan
 memiliki hubungan yang linear dengan total
(a) y = 111,5x + 33,42 flavonoid karena nilai r mendekati nol
r = 0,589 (Mattjik dan Sumertajaya 2006). Hal ini
R2= 0,347
menunjukkan bahwa untuk setiap jenis
tanaman tingginya kandungan fenol dari
setiap tanaman tidak selalu bersumber pada
golongan flavonoid.

y = 0,029x + 0,619
r = 0,539
R2= 0,290

y = 74,97x + 53,11
(b) r = 0,495
R2= 0,244

keterangan:
1) sidaguri, 2) sambiloto, 3) tempuyung,
4) jati belanda, 5)kumis kucing, dan 6) kedaung.

Gambar 11 Hubungan total fenol dengan total

flavonoid.
(c) y = 13,07x + 8,456
r = 0,430 SIMPULAN DAN SARAN
R2= 0,184
Simpulan

Dari ekstrak etanol 70% 6 jenis tanaman

Keterangan:
1)sidaguri, 2) sambiloto, 3) kumis kucing,
4)tempuyung, 5)kedaung, dan 6) jati belanda.
Gambar 10 Hubungan total flavonoid dengan
aktivitas antioksidan (a) metode
CUPRAC, (b) metode DPPH, dan
(c) metode FRAP.
Total Fenol dengan Total Flavonoid
obat, yaitu, kumis kucing, tempuyung,
sidaguri, jati belanda, sambiloto, dan kedaung
diketahui bahwa semua tanaman tersebut
memiliki aktivitas antioksidan. Hasil
pengukuran aktivitas antioksidan dengan
metode CUPRAC, DPPH, dan FRAP berbeda
nyata secara statistika. Walaupun demikian
metode CUPRAC dan FRAP memberikan
urutan aktivitas antioksidan yang sama dari
enam tanaman. Kandungan total fenol tidak
memiliki memiliki korelasi dengan total
flavonoidnya tetapi memiliki korelasi yang
kuat dan searah dengan aktivitas
antioksidannya. Kandungan total flavonoid
tidak memiki korelasi dengan aktivitas
antioksidan berarti aktivitas antioksidan tidak
hanya bersumber dari golongan flavonoid.

Diketahui bahwa flavonoid merupakan Saran

golongan terbesar senyawaan fenol (Subeki
1998). Dengan menghubungkan kandungan
total fenol dengan kandungan flavonoid
didapatkan nilai korelasi (r) sebesar 0,539
(Gambar 11). Hal ini berarti total fenol tidak
Sebaiknya dilakukan penelitian lanjutan
dengan memperbanyak jumlah sampel dan
populasi dari berbagai jenis tanaman obat
Indonesia lainnya.
 DAFTAR PUSTAKA
Alabi DA, Akinsulire OR, Sanyaolu MA.
2005. Qualitative determination of
chemical and nutritional compotition of
Parkia Biglobosa (Jacq) Benth. Afr J
Biotechnol 4:812-815.
Apak R et al. 2007. Comparative evaluation
of various total antioxidant capacity assay
applied to phenolic compounds with the
CUPRAC assay. Molecules 12:1496-1547.
[AOAC] Association of Official Analytical
Chemistry. 1998. Official Methods of
Analysis of AOAC International. Ed-16.
Volume ke-2. Maryland: AOAC
International.
Belitz HD, Grosch W. 1999. Food Chemistry.
Jerman: Springer.
Benzie IFF, Strain JJ. 1996. The ferric
reducing ability of plasma (FRAP) as a
measurement of ‘antioxidant power’ : the
FRAP assay. Anal Biochem 239:70-76.
Femi-Ola TO, Ajibade VA, Avolabi A. 2008.
Chemical composition and termicidal
properties of Parkia Biglobosa (Jacq)
Benth. J Bio Sci 8:494-497.
Hanani E, Mun’im A, Sekarini R. 2005.
Identifikasi senyawa antioksidan dalam
spons Callispongia sp dari Kepulauan
Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian 2:127-
133.
Kamiloglu O et al. 2009. Total Phenolic and
antioxidant activity of jujube (Zyziphus
Jujube Mill.) genotypes selected from
turkey. Afr J Biotechol 8:302-307.
Kao MS et al. 2007. Phenolic content and
antioxidant capacities of Alabama-Grown
thornless blackberries. Int J Fruit Sci 7:33-
46.
Khalil NM, Sperotto JS, Manfron MP. 2006.
Anti-inflmmatory of the hydroalcoholyc
extracts of leaves of Sida rhombifolia L
(Malvaceae). Act Farm Bon 25:260-261.
Khamsah SM, Akowah G, Zhari I. 2006.
Antioxidant activity and phenolic content
of orhosiphon stamineus Benth from
different geofraphical origin. J Sust Sci
Management 1:14-20.
Macari PdAT, Portela CN, Polhit AM. 2006.
Antioxidant, cycotoxic, and UVB-
absorbing activity of Maytenus
guyanensisi Klotzch (celastaceae) bark
extracts. Acta Amazonica 36:513-518.
Matkowski A. 2008. Antioxidant activity of
extracts and different solvent of Glechoma
hederacea L and Orhosiphon stamineus
(Benth) Kudo. Adv Clin Exp Med 17:615-
624.
Miller AL. 1996. Antioxidant flavonoid:
structure, function and clinical usage.
[terhubung berkala]
http://public.carnet.hr/acphee/42305.pdf
[ 24 Feb 09]
Ou B, et al. 2002. Analysis of antioxidant
activities of common vegetables
employing oxygen radical absorbance
(ORAC) and ferric reducing antioxidant
power (FRAP) assay: A comparative
study. J Agric Food Chem 50:3122-3128.
Percival.M.1998.Antioxidants. [terhubung
berkala] http://acudoc.com/Antioxidants
.pdf [19 Feb 09].
Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd
N. 2006. Antioxidant activity, phenol, and
flavonoid contents of some selected
Iranian medicinal plants. Afr J Biotechnol
5:1142-1145.
Pulido R, Bravo L, Saura-Calixo F. 2000.
Antioxidant Activity of dietary
polyphenols as determined by modified
ferric reducing antioxidant power assay. J
Agric Food Chem 48:3396-3402.
Prakash A. 2001. Antioxidant activity.
Analitical progress 19:2.
Slinkard, K dan Singleton VL. 1977. Total
phenol analysis: automation and
comparison with manual methods. Am J
Enol Victic 28:49-55.
Sriningsih et al. 2002. Analisa senyawa
golongan flavonoid herba tempuyung
(Soncus Arvensis L). Pusat Teknologi
Farmasi BPPT.
Subeki. 1998. Pengaruh cara pemasakan
terhadap kandungan antioksidan beberapa
macam sayuran serta daya serap dan
retensinya pada tikus percobaan [tesis].
Bogor: Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogor

Then M, Szentmihalyi K, Sarkőzi A, Varga
IS. 2003. Examination on antioxidant
activity in greater celadine (Celidonium
majus L) extracts by FRAP method. Acta
Bio szegediensis 47:115-117.
Umar F. 2008. Optimasi ekstraksi flavonoid
total daun jati belanda [skripsi]. Bogor:
Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
11
Wirakusumah ES, Setyowati RN. 1994.
Cantik dan Bugar dengan Ramuan Nabati.
Jakarta: Penebar Swadaya.
Yuwono A. 2009. Antioxidant and health
disease. [terhubung berkala]
http://farmacology.org/specialistmedic/inte
rnist [ 2 Maret 2009]
LAMPIRAN
 13
Lampiran 1 Bagan alir penelitian

Sampel daun atau batang

tanaman

Kadar Air Preparasi Sampel

Ekstrak Etanol

Uji Antioksidan
• Metode CUPRAC
• Metode DPPH
Uji Total Uji Total
Fenol Flavonoid • Metode FRAP

Analisis Korelasi Total Fenol, Flavonoid dan Aktivitas

Antioksidan
 14
Lampiran 2 Penentuan kadar air

Bobot Awal Bobot Akhir Kadar Air Rerata SBR

Jenis Tanaman Ulangan
(g) (g) (% [b/b]) (% [b/b]) (%)
Kedaung 1 0,9991 0,9153 8,39
2 0,9980 0,9156 8,26 8,35 0,95
3 0,9988 0,9149 8,40
Sambiloto 1 0,9999 0,8874 11,25
2 0,9994 0,8886 11,09 11,13 0,97
3 1,0001 0,8896 11,05
Tempuyung 1 0,9956 0,8916 10,45
2 0,9968 0,8940 10,31 10,31 1,36
3 0,9985 0,8970 10,17
Sidaguri 1 0,9934 0,9248 6,91
2 0,9978 0,9292 6,88 6,93 0,93
3 0,9988 0,9289 7,00
Kumis Kucing 1 0,9965 0,8824 11,45
2 0,9976 0,8845 11,34 11,34 1,00
3 0,9970 0,8851 11,22
Jati Belanda 1 1,0054 0,9220 8,30
2 0,9968 0,9144 8,27 8,32 0,93
3 0,9961 0,9123 8,41

# Kadar Air (%) = bobot awal – bobot akhir x 100%

bobot awal

Kadar Air (%) = 0,9991- 0,9153 x 100% = 8,39%

0,9991

# Simpangan Baku Rerata (%SBR)

n
## Rerata (x) = ∑xi = (8,39 + 8,26 + 8,40) = 8,35%
i=1 3
n
n
## Standar Deviasi (s2) = ∑ (xi – x)2
i=1
n-1
s2 = (8,39 – 8,35)2 + (8,26 – 8,35)2 + (8,40 – 8,35)2 = 0,0781
3-1
## %SBR = s2 x 100% = 0,0781 x 100% = 0,95%
X 8,35
 15

Lampiran 3 Rendemen ekstrak kering

Rendemen Rerata
Jenis Tanaman Ulangan Bobot Awal (g) Bobot Akhir(g)
(% [b/b]) (% [b/b])
1 38,4550 5,6136 15,93
Kedaung 2 38,4562 5,1951 14,74 15,13
3 38,4591 5,1893 14,72
1 38,4556 2,4870 7,28
Sambiloto 2 38,4535 2,1817 6,38 7,11
3 38,4602 2,6176 7,66
1 38,4820 4,1194 11,94
Tempuyung 2 38,3928 3,8977 11,32 11,57
3 38,4671 3,9503 11,45
1 14,9920 0,9235 6,62
Sidaguri 2 14,9915 1,0795 7,74 7,16
3 14,9967 0,9946 7,13
1 38,4565 5,3340 15,64
Kumis Kucing 2 38,4656 5,1490 15,10 15,44
3 38,4668 5,3107 15,57
1 38,4563 5,2043 14,76
Jati Belanda 2 38,4460 5,3240 15,11 14,87
3 38,4603 5,1988 14,74

# Rendemen (%) = bobot akhir x 100% = 5,6136 x 100% = 15,13%

bobot awal x(1-kadar air) 38,4550 (1-0,0835)
 16

Lampiran 4 Kapasitas antioksidan metode CUPRAC

# Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans

25 0,049
50 0,166
75 0,276
100 0,416
150 0,692
200 1,044

Gambar Kurva standar troloks

# Pengukuran Kapasitas Antioksidan

Kapasitas Kapasitas Rerata

Bobot V- C-contoh Antioksidan Antioksidan (μmol
Jenis %
Contoh fp contoh Abs (μM (μmol (μmol troloks/g
Tanaman SBR
(mg) (ml) troloks) troloks/g troloks/g serbuk
ekstrak kering) serbuk kering) kering)
Kedaung 24,8 20 25 0,91 183,0541 3690,6071 558,3889
25,2 20 25 0,893 180,0468 3572,3577 540,4977 548,9904 1,64
24,9 20 25 0,895 180,4006 3622,5025 548,0846
25,4 20 25 0,266 69,1311 1360,8487 210,1150
Kumis
25,3 20 25 0,263 68,6004 1355,7394 209,3262 209,4936 0,31
Kucing
25,4 20 25 0,264 68,7773 1353,8841 209,0397
24,3 20 25 0,237 64,0010 1316,8938 195,8221
Jati
24,5 20 25 0,236 63,8241 1302,5335 193,6867 194,9299 0,59
Belanda
24,3 20 25 0,236 63,8241 1313,2539 195,2809
Tempuyung 25,4 2 25 1,01 200,7440 395,1654 45,7206
25,7 2 25 1,013 201,2747 391,5851 45,3064 45,8327 1,29
25,1 2 25 1,015 201,6285 401,6504 46,4710
Sambiloto 25,2 5 25 0,156 49,6722 246,3900 17,5183
25,2 5 25 0,156 49,6722 246,3900 17,5183 17,2824 2,36
25,7 5 25 0,150 48,6108 236,4340 16,8105
Sidaguri 24,4 - 25 0,799 163,4183 167,4368 11,9885
24,4 - 25 0,795 162,7107 166,7118 11,9366 11,8879 1,11
25 - 25 0,802 163,9490 163,9490 11,7387
 17

Lampiran 5 Kapasitas antioksidan metode DPPH

# Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans Δ Absorbans
Blanko 1,218 0,000
2,5 1,186 0,032
5 1,136 0,082
7,5 1,093 0,125
10 1,061 0,157
12,5 1,041 0,177
15 0,983 0,235
20 0,785 0,433
25 0,749 0,469
50 0,337 0,881
Gambar Kurva Standar troloks
100 0,050 1,168

# Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Kapasitas Kapasitas
Rerata
Antioksidan Antioksidan
Bobot Volume C-contoh (μmol
Jenis (μmol (μmol %
Contoh fp contoh Abs Δ Abs (μM troloks/g
Tanaman troloks/g troloks/g SBR
(mg) (ml) troloks) serbuk
ekstrak serbuk
kering)
kering) kering)
Blanko 1,218
Kedaung 25,0 50 25 0,420 0,798 59,4470 2972,3503 449,7166
25,2 50 25 0,417 0,801 59,6936 2960,9925 447,9982 450,5449 0,68
24,7 50 25 0,422 0,796 59,2826 3000,1317 453,9199
Kumis 25,0 50 25 0,835 0,383 25,3336 1266,6813 195,5756
Kucing
24,7 50 25 0,845 0,373 24,5116 1240,4665 191,5280 192,3260 1,53
25,5 50 25 0,838 0,380 25,0870 1229,7561 189,8743
Jati 24,7 40 25 0,880 0,338 21,6346 875,8941 130,2455
Belanda
25,6 40 25 0,882 0,336 21,4702 838,6790 124,7116 126,5693 2,52
25,2 40 25 0,886 0,332 21,1414 838,9436 124,7509
Tempuyu 24,4 10 25 0,411 0,807 60,1868 616,6682 71,3485
ng
24,6 10 25 0,406 0,812 60,5978 615,8315 71,2517 71,4714 0,42
25,5 10 25 0,373 0,845 63,3104 620,6907 71,8139
Sambiloto 25,3 40 25 1,071 0,147 5,9342 234,5538 16,6768
24,6 40 25 1,078 0,140 5,3588 217,8376 15,4883 16,1915 3,85
25,0 40 25 1,073 0,145 5,7698 230,7924 16,4093
Sidaguri 25,5 10 25 0,834 0,384 25,4158 249,1748 17,8409
25,7 10 25 0,829 0,389 25,8268 251,2338 17,9883 17,9414 0,49
25,2 10 25 0,835 0,383 25,3336 251,3257 17,9949
 18

Lampiran 6 Kapsitas antioksidan metode FRAP

# Pembuatan Kurva kalibrasi

Larutan troloks (μM) Absorbans

25 0,016
50 0,067
75 0,079 y = 0,002x – 0,066
100 0,097 R2= 0,979
150 0,264
200 0,403
300 0,596

Gambar kurva kalibrasi troloks

# Pengukuran Aktivitas Antioksidan

Kapasitas Kapasitas Rerata

Bobot V- C-contoh Antioksidan Antioksidan (μmol
Jenis %
Contoh fp contoh Abs (μM (μmol (μmol troloks/g
Tanaman SBR
(mg) (ml) Troloks) troloks/g troloks/g serbuk
ekstrak kering) serbuk kering) kering)
Kedaung 24,8 2 25 0,59 297,0818 598,9553 90,6219
25,2 2 25 0,589 296,6294 588,5505 89,0477 90,1591 1,07
24,9 2 25 0,594 298,8913 600,1833 90,8077
Kumis 25,7 - 25 0,279 155,6323 151,3933 23,3751
Kucing
25,5 - 25 0,281 156,7716 153,6976 23,7309 23,7300 1,49
25,4 - 25 0,284 158,4805 155,9847 24,0840
Jati 24,3 - 25 0,169 92,9720 95,6502 14,2232
Belanda 14,3581 0,91
24,5 - 25 0,172 94,6809 96,6132 14,3664
24,3 - 25 0,172 94,6809 97,4084 14,4846
Tempuyung 25,3 - 25 0,156 85,5667 84,5521 9,7827
24,8 - 25 0,162 88,9846 89,7022 10,3785 10,2304 3,86
24,6 - 25 0,163 89,5542 91,0104 10,5299
Sambiloto 24,2 - 25 0,134 73,0347 75,4490 5,3644
24,8 - 25 0,142 77,5918 78,2175 5,5613 5,4021 2,67
24,2 - 25 0,132 71,8954 74,2721 5,2807
Sidaguri 24,4 - 25 0,05 52,8029 54,1014 3,8737
24,4 - 25 0,049 52,3506 53,6379 3,8405 3,8515 0,50
24,4 - 25 0,049 52,3506 53,6379 3,8405
 19

Lampiran 7 Uji F dan Uji t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan

1. Kedaung
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 668083749,86 334041874,93 5780,02 5,143
Galat 6 346755,28 57792,55
Total 8 668430505,14
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √57792,55/3 = 138,80
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 138,80 = 480,23
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 138,80 = 496,90

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC
μmolTroloks/ g serbuk kering 3938,5087 19681,5917 23982,0828
Kesimpulan A B C

2. Kumis Kucing
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 111254206,26 55627103,13 10491,97 5,143
Galat 6 31811,25 5301,88
Total 8 111286017,51
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √5301,88/ 3 = 42,04
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 42,04 = 145,46
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 42,04 = 150,50

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC
μmolTroloks/ g serbuk kering 995,4138 8067,5817 8787,7207
Kesimpulan A B C
 20

Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan)

3. Jati Belanda
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 102000375,64 51000187,82 6570,36 5,143
Galat 6 46572,95 7762,16
Total 8 102046948,58
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √7762,16/ 3 = 50,87
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,87= 176,00
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,87 = 182,12

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC
μmolTroloks/ g serbuk kering 649,3428 5724,0906 8815,6943
Kesimpulan A B C

4. Tempuyung
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 31670683,70 15835341,85 14311,01 5,143
Galat 6 6639,09 1106,51
Total 8 31677322,79
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √6639,09/ 3 = 47,04
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 47,04 = 162,77
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 47,04 = 168,40

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP CUPRAC DPPH
μmolTroloks/ g serbuk kering 764,2311 3423,7997 5339,0675
Kesimpulan A B C
Lampiran 7 Uji-F dan Uji-t untuk metode pengukuran aktivitas antioksidan (lanjutan)
 21

5. Sambiloto
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 10124730,02 5062365,01 673,19 5,143
Galat 6 45119,55 7519,92
Total 8 10169849,57
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √7519,92/ 3 = 50,07
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,46 x 50,07 = 173,23
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 50,07 = 179,25

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP DPPH CUPRAC
μmolTroloks/ g serbuk kering 1068,6293 3202,9242 3418,7241
Kesimpulan A B B

6. Sidaguri
Hipotesis:
H0 : μi =μ1=μ2=μ3=0
H1: minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

Tabel analisis Ragam

Sumber Derajat bebas Jumlah Kuadrat F hitung F 0,05 (2,6)
Keragaman Kuadrat Tengah
Perlakuan 2 11405391,02 5702695,51 17761,89 5,143
Galat 6 1926,38 321,06
Total 8 11407317,40
F hitung> F 0,05 (2,6) maka tolak H0, artinya minimal ada sepasang μ dimana μi≠μi’

# Uji-t (Duncan) pada setiap jenis tumbuhan obat

Hipotesis:
H0 : μi =μi’
H1: μi≠μi’
Nilai kritis Duncan :
SY = √KTG/r = √1926,38/ 3 = 25,34
Rp = r0,05 (2,6) x SY = 3,,46 x 25,34 = 87,68
Rp = r0,05 (3,6) x SY = 3,58 x 25,34 = 90,72

Tabel Analisis Ragam

Jenis FRAP CUPRAC DPPH
μmolTroloks/ g serbuk kering 751,2899 2318,8902 3499,6937
Kesimpulan A B C
 22

Lampiran 8 Penentuan total fenol 1.2

Larutan asam galat (mg/L) Absorbans 1

0.8
12,5 0,058

Absorbansi
25 0,127 0.6

50 0,262 0.4 yy
== 0,0052x
0.0052x + 0,0037
+ 0.0037

75 0,417 0.2
R2=R20,9985
= 0.9985

100 0,535 0
150 0,801 0 50 100 150 200 250

200 1,033 m g/L asam galat

Gambar Kurva Standar Asam Galat
Kandungan Total Fenol
Total fenol
Rerata (mg
Total fenol (mg (mg
Bobot ekuivalen as
Jenis V-contoh C-contoh ekuivalen as ekuivalen as %
Contoh fp Abs galat/g
Tanaman (ml) (mg/L) galat/g ekstrak galat/g SBR
(mg) serbuk
kering) serbuk
kering)
kering)
Kedaung 25,2 10 25 0,211 39,5936 392,7940 59,4297
24,8 10 25 0,199 37,3020 376,0280 56,8930 57,2686 3,49
25,3 10 25 0,198 37,1110 366,7096 55,4832
Kumis 24,8 - 25 0,826 157,0406 158,3071 24,4426
Kucing 26,0 - 25 0,873 166,0163 159,6310 24,6470 24,5345 0,42
25,6 - 25 0,855 162,5788 158,7684 24,5138
Jati 24,8 - 25 0,711 135,0790 136,1684 20,2482
Belanda 25,1 - 25 0,720 136,7977 136,2527 20,2608 20,2204 0,29
25,2 - 25 0,719 136,6068 135,5226 20,1522
Tempuyung 24,9 - 25 0,549 104,1417 104,5600 12,0976
24,8 - 25 0,543 102,9959 103,8265 12,0127 12,0633 0,37
24,8 - 25 0,546 103,5688 104,4041 12,0796
Sambiloto 24,7 - 25 0,380 71,8677 72,7406 5,1719
24,7 - 25 0,387 73,2045 74,0936 5,2681 5,2348 1,04
26,2 - 25 0,410 77,5968 74,0428 5,2644
Sidaguri 25,6 - 25 0,369 69,7670 68,1318 4,8782
24,9 - 25 0,364 68,8122 69,0885 4,9467 4,9318 0,97
25,4 - 25 0,373 70,5309 69,4202 4,9705

Konsentrasi contoh ekuivalen dengan asam galat

y = 0,0052x + 0,0037
0,211 = 0,0052x + 0,0037
x = 39,5936 mg/L
Total fenol = Vcontoh (l)x Ccontoh(mg/l) x fp
Bobot Contoh (g)
Total fenol = 25 ml x 39,5936 mg/l x 10 x 10¯ ³l/ml
25,2 mg x 10¯ ³ g/mg
Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering

Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat/ g ekstrak kering x rendemen

Total fenol = 392,7940 mg ekuivalen as,galat x 1g ekstrak kering
g ekstrak kering (1/0,1513) g serbuk kering
Total fenol = 59,4229 mg ekuivalen as,galat/ g serbuk kering
 23

Lampiran 9 Kandungan total flavonoid 0.9

Larutan Kuersetin 0.8

Absorbans
(mg/L) 0.7

3,125 0,022 0.6

Absorbansi
6,25 0,042 0.5

12,5 0,091 0.4

0.3 y =y0,0081x
= 0.0081x – -0,008
0.008
25 0,187 R2= 0,9997
R 2 = 0.9997
0.2
50 0,402
0.1
75 0,605 0
100 0,798 0 20 40 60 80 100 120
mg/L kuersetin
Gambar Kurva standar kuersetin
Kandungan Total Flavonoid

Total Total Rerata (mg

Bobot V-
Jenis C-contoh flavonoid (mg flavonoid (mg kuersetin/g
Contoh contoh Abs % SBR
Tanaman (mg/L) kuersetin/g kuersetin/g serbuk
(mg) (ml)
ekstrak kering) serbuk kering) kering)

Kedaung 25 25 0,103 13,6990 13,6990 2,0727

25,1 25 0,103 13,6990 13,6444 2,0644 2,0835 1,26
25,4 25 0,107 14,1926 13,9691 2,1135
Kumis
Kucing 25,8 25 0,029 4,5667 4,4251 0,6832
0,6600 3,06
24,9 25 0,026 4,1965 4,2133 0,6505
25,8 25 0,027 4,3199 4,1859 0,6463
Jati Belanda 25,6 25 0,160 20,7333 20,2474 3,0108
24,3 25 0,151 19,6227 20,1879 3,0019 3,0480 2,37
25,2 25 0,164 21,2270 21,0585 3,1314
Tempuyung 24,4 25 0,044 6,4178 6,5757 0,7608
24,6 25 0,044 6,4178 6,5222 0,7546 0,7537 1,02
24,9 25 0,044 6,4178 6,4436 0,7455
Sambiloto 24,6 25 0,044 6,4178 6,5222 0,4637
25,6 25 0,045 6,5413 6,3879 0,4542 0,4598 1,08
25,2 25 0,045 6,5413 6,4893 0,4614
Sidaguri 25,5 25 0,040 5,9242 5,8080 0,4159
25,7 25 0,041 6,0476 5,8829 0,4212 0,4153 1,50
25,4 25 0,039 5,8008 5,7094 0,4088