Artikel Penelitian

Analisis Digoxin dan Metildigoxin di Seluruh Darah Menggunakan Ekstraksi Fase Padat dan Liquid
Chromatography Tandem Mass Spectrometry

PaulaMelo, 1, 2 RitaMachado, 3 dan HelenaM. Teixeira1, 2, 4, 5

1National Institute of Legal Medicine, Cabang Utara, 4050-167 Porto, Portugal
2 Pusat Ilmu Pengetahuan Forensik (CENCIFOR), 3000-213 Coimbra, Portugal
3 Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Coimbra, 3030-790 Coimbra, Portugal
4 Fakultas Kedokteran, Universitas Porto, 4099-002 Porto, Portugal
5 Fakultas Kedokteran, Universitas Coimbra, 3.000-548 Coimbra, Portugal

Korespondensi harus ditujukan kepada Helena M. Teixeira, helenateixeira@dcinml.mj.pt

Diterima 31 Januari 2011; Diterima 14 April 2011
Penyunting Akademis: Yoshinobu Baba

Hak Cipta © 2012 Paula Melo dkk. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah Lisensi
Pengaitan Creative Commons, yang memungkinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa
batas dalam medium apa pun, asalkan karya asli dicantumkan dengan benar.

Metode UPLC / MS / MS sederhana dan cepat telah dikembangkan dan divalidasi untuk analisis digoxin
dan metildigoxin dalam darah utuh. Sampel disiapkan oleh ekstraksi SPE dengan kolom Oasis HLB.
Pemisahan dicapai dengan kolom ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100; 1,8 μm), pada 35◦C. Fase gerak
terdiri dari asetonitril (70%) dan amonium format 5mM (30%). Total run time adalah 1,5 menit
beroperasi pada mode isokratis dengan laju alir 0,3 mL / menit. Deteksi spektrometri massa dilakukan
oleh elektrospray mode positif, pada adduct amonium dengan dua transisi untuk setiap analit dan
satu untuk IS (d3-digoxin). Metode ini terbukti spesifik dan linier selama rentang (0,3-10) ng / mL.
Teknik ini juga menunjukkan sensitivitas tinggi dengan 0,09 ng / mL LOD dan 0,28 ng / mL LOQ, untuk
kedua zat tersebut. Persentase pemulihan berkisar antara 83 hingga 100% untuk digoxin dan 62-94%
untuk metildigoxin. CV presisi intra dan interday adalah ≤10%.

1. Perkenalan
Glikosida digitalis adalah obat pilihan untuk pengobatan gagal jantung kongestif dan gangguan
tertentu pada ritme jantung, menghasilkan aktivitas inotropik positif dan peningkatan, kontraktilitas
miokard [1]. Beberapa penulis menyatakan bahwa digoxin secara klinis glikosida jantung yang paling
sering digunakan [2]. Namun demikian, di Portugal, metildigoxin juga merupakan glikosida jantung
yang umum, menjadi yang kedua lebih sering digunakan [3]. Digoxin (Gambar 1) dimetabolisme
terutama di hati [2], dengan pemindahan bertahap dari moieties gula untuk membentuk digoxigenin,
yang selanjutnya dimetabolisme menjadi metabolit tidak aktif yang dapat diekskresikan dalam bentuk
bebas atau konjugasi. Pengurangan ke dihrodrodigoxin, relatif tidak aktif, juga terjadi [4]. Namun,
digoxin dimetabolisme pada manusia dalam persentase kecil [5]. Efektif, digoxin diekskresikan
terutama tidak berubah dalam urin, dengan hingga 80% dari dosis yang diekskresikan dalam urin
dalam 7 hari menjadi 27% dari dosis yang diekskresikan dalam 24 jam pertama [4]. Digoxin dapat
ditemukan sebagai hasil dari administrasi atau karena metabolisme karena merupakan metabolit
deslanoside, digitoxin, lanatoside C dan metildigoxin [4]. Metildigoxin (Gambar 2) dimetabolisme oleh
demetilasi menjadi digoksin dan hidrolisis menjadi bis- dan monoglikosida. Sekitar 75% dari dosis
diekskresikan dalam urin selama beberapa hari, dengan sekitar 25-30% diekskresikan dalam 24 jam
pertama. Sekitar 30-50% bahan yang diekskresikan dalam urin sesuai dengan obat tidak berubah,
menjadi 15% bis terkonjugasi dan monoglikosida dan sisanya digoxin [4].

Senyawa-senyawa ini memiliki kisaran terapeutik yang sempit, sehingga mereka sering dapat
menyebabkan keracunan, yang melibatkan bunuh diri, pembunuhan, dan kasus keracunan yang tidak
disengaja [2]. Ketika keracunan ini mematikan, prosedur hukum yang terlibat, dan laboratorium
forensik harus mengkonfirmasi keberadaan glikosida jantung dalam sampel yang dikumpulkan untuk
membantu menentukan apakah intoksikasi digitalis, pada kenyataannya, penyebab kematian. Oleh
karena itu, sangat penting bahwa laboratorium toksikologi mampu mendeteksi dan mengukur
kelompok zat ini dalam contoh postmortems. Dalam studi ini, kami telah mengembangkan metode
sensitif dan cepat untuk identifikasi dan kuantifikasi digoxin dan metildigoxin dalam darah utuh oleh
UPLC-MS / MS, setelah teknik ekstraksi SPE.

2. Percobaan
2.1. Instrumentasi.
Pemisahan kromatografi dilakukan pada sistem ACQUITY UPLC (Waters) dengan ACQUITY TQDMass
Detector (Waters). Ekstraksi fase padat dilakukan pada ekstraktor otomatis Aspec XL (Gilson).
2.2. Bahan, Standar, dan Bahan Kimia.
Digoxin murni, metildigoxin, dan d3-digoxin (standar internal) dibeli dari Chemos (Jerman). Setiap
senyawa standar dilarutkan dalam metanol (1mg / mL untuk digoxin dan 0,5 mg / mL untuk
metildigoxin dan d3-digoxin) dan disimpan pada -20◦C. Solusi kerja juga disiapkan dalam metanol.
Amonium format dibeli dari Sigma- Aldrich (USA). Amonium asetat dibeli dari Merck (Darmstadt,
Jerman). Semua pelarut lainnya adalah kelas analitis atau HPLC dan dibeli dari E.Merck (Darmstadt,
Jerman). Air dimurnikan dengan sistem Milli-Q yang diperoleh dari Millipore (Molsheim, Prancis). Fase
gerak disaring dengan 0,20 μmSchleicher & Schuell filter dan di-degassed dalam ultrasonic bath
selama 15 menit sebelum digunakan. Kolom ekstraksi fase padat Oasis HLB (3 cc; 60 mg) diperoleh
dariWaters (Via Athena, Portugal).
2.3. Kondisi UPLC-MS / MS.
Pemisahan kromatografi dilakukan dengan kolom ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 × 100; 1,8 μm ukuran
partikel), pada 35◦ C. Fase gerak terdiri dari asetonitril (70%) dan amonium format 5mM (30%). Total
run time adalah 1,5 menit beroperasi pada mode isokratis dengan laju alir 0,3 mL / menit. Volume
injeksi adalah 10 μL (loop penuh), dan suhu manajer sampel adalah 10◦C. Deteksi spektrometri massa
dilakukan menggunakan ionisasi elektrospray yang beroperasi pada mode positif. Pengaturan
instrumental utama lainnya adalah tegangan kapiler 2 KV; tegangan kerucut 30V; extractor 1V; ion
energy1 1; Ion energy2 3; suhu sumber 120◦C; suhu desolvasi 300◦C; laju alir gas cone 0 L / jam, laju
aliran gas desolvasi 500 L / jam. Multiple reaction monitoring (MRM) digunakan untuk mendeteksi
digoxin dan metildigoxin, dengan dua transisi adduct ammonium dari masing-masing analit, satu
untuk kuantisasi dan yang lainnya untuk konfirmasi. Transisi MRM yang sesuai, tegangan dan tabrakan
cone energi dijelaskan pada Tabel 1. d3-digoxin digunakan sebagai standar internal. Kontrol
instrumen, akuisisi data, dan proses dicapai dengan menggunakan perangkat lunak Waters Massynx
(Milford, Mass).
2.4. Preparasi Sampel dan Ekstraksi SPE.
Sampel kontrol dan kalibrasi disiapkan dengan spiking sampel darah postmortem bebas obat dengan
larutan standar. Satu mililiter sampel darah bebas obat terlarang pertama kali dibubuhi zat pada
konsentrasi mulai 0,3 hingga 10 ng / mL. Deuterated internal standard (IS), d3-Digoxin, digunakan
dengan menambahkan 50 μL larutan 100 ng / mL ke semua sampel yang diperiksa. Lima ratus
mikroliter larutan amonium asetat 2M (pH = 9,5) dan 3,5 mL air Mili-Q ditambahkan dan dialirkan oleh
agitasi pada mixer vortex. Sampel kemudian disentrifugasi selama 15 menit pada 3200 rpm sebelum
ekstraksi, dan supernatan dituang ke tabung lain. Teknik ekstraksi fase padat (SPE) dilakukan untuk
mengisolasi analit, menggunakan kolom Oasis HLB (3 cc, 60 mg). Kolom SPE dikondisikan secara
berurutan dengan menambahkan 1mL metanol, 1mL air, dan 3mL dari 0,1M larutan ammonium asetat
(pH = 9,5). Sampel yang disiapkan dituangkan ke kolom yang dikondisikan dan dibiarkan mengalir.
Setiap kolom kemudian dicuci dengan 2 mL larutan 0,1 M amonium asetat (pH = 9,5) dan dikeringkan
di bawah vakum maksimum selama 2 menit. Glikosida jantung kemudian dielusi dengan 3 mL
kloroform: 2- propanol (95: 5). Pelarut diuapkan hingga kering pada suhu 25◦C di bawah aliran
nitrogen yang lembut. Residu dilarutkan kembali dengan 100 μL asetonitril / air (60: 40) dan vortex
untuk meningkatkan pemulihan dari dinding tabung. Sepuluh mikroliter dari solusi akhir kemudian
disuntikkan ke dalam sistem UPLC-MS / MS

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Pengembangan Metode.
Ada berbagai studi dalam literatur yang melaporkan pengembangan metode penentuan digoxin
dalam plasma manusia, serum, dan urine dengan spektrometri cair-spektrometri massa LC-MS [6-12],
dan beberapa menggambarkan penentuan digoxin dalam urin tikus atau plasma [13, 14]. Namun,
hanya sedikit data yang telah dipublikasikan tentang analisis digoxin dalam sampel darah utuh [15-
17]. Selanjutnya, sepengetahuan kami, penelitian ini adalah yang pertama untuk melaporkan metode
yang divalidasi untuk analisis metildigoxin, glikosida jantung kedua yang lebih sering digunakan di
Portugal, di seluruh darah manusia. Di sisi lain, hanya satu publikasi melaporkan analisis digoxin oleh
UPLC, tetapi penelitian dilakukan dalam urin tikus [13]. Dengan demikian, penting untuk
mengembangkan metode baru mengenai analisis glikosida digitalis ini dalam sampel darah utuh,
matriks yang paling sering dianalisis dalam kasus postmortem.
Dalam penelitian ini, metode UPLC-MS / MS yang sensitif dan cepat untuk penentuan digoxin
danmetildigoxin dalam sampel darah post mortem dikembangkan dan divalidasi, dengan pemisahan
kromatografi yang cukup (Gambar 3) dan kuantifikasi yang tepat dari substansi yang diteliti. Selain itu,
penggunaan teknik UPLC baru ini dengan spektrometri massa tandem membuat metode yang
dikembangkan merupakan teknik yang sederhana dan cocok untuk analisis forensik rutin, dengan
analisis yang memakan waktu lebih sedikit dan lebih sensitif dan spesifisitas.
Dengan demikian, studi validasi dilakukan secara terpisah untuk masing-masing substansi, di seluruh
sampel darah. Metode kromatografi yang dijelaskan memiliki waktu proses hanya 1,5 menit, dengan
deteksi digoxin pada waktu retensi 0,78 dan 0,92 menit untuk metildigoxin (Gambar 3). Ionisasi
glikosida jantung yang diteliti dengan ionisasi elektrospray (ESI) dalam mode positif mencapai hasil
terbaik, karena spektrum massa full-scan ion positif dari kedua senyawa menunjukkan bahwa ion adisi
amonium dalam mode positif menunjukkan intensitas yang sangat kuat dibandingkan dengan [MH] -
dalam mode negatif. Akibatnya, adisi amonium dari kedua senyawa dipilih sebagai ion prekursor. Ion-
ion produk diperoleh oleh fragmentasi prekursor adisi amonium dalam sel bertabrakan. Senyawa
dikuantifikasi menggunakan mode MRM menggunakan transisi 798,5> 651,5 untuk digoxin dan 812,6>
651,5 untuk metildigoxin, dan transisi untuk konfirmasi, 798,5> 781,5 untuk digoxin, dan 812,6> 795,6
untuk metildigoxin (Tabel 1). Angka 4 dan 5 mewakili spektrum massa ion produk digoxin dan
metildigoxin, masing-masing.
3.2. Validasi Metode UPLC-MS / MS.
Metode yang dikembangkan divalidasi sesuai dengan pedoman Konferensi Internasional tentang
Harmonisasi (ICH) untuk validasi parameter berikut: selektivitas / spesifisitas, linearitas, batas deteksi
dan kuantifikasi, pemulihan, dan presisi intra dan interday [18]
3.2.1. Kekhususan.
Untuk mengevaluasi kemurnian dan selektivitas puncak, 10 sampel kosong yang berbeda (tidak ada
analit atau standar internal ditambahkan) dianalisis untuk memeriksa puncak yang mungkin
mengganggu deteksi analit atau standar internal (IS). Juga, sampel negatif (sampel darah kosong + IS)
dianalisis, untuk memverifikasi tidak adanya analit asli dalam solusi IS. Selain itu, sepuluh sampel darah
melonjak dengan 2 analit tetapi tanpa IS dianalisis, untuk memverifikasi tidak ada gangguan dari analit
pada waktu retensi IS. Untuk menilai kemungkinan gangguan, 10 sampel yang berbeda dibubuhi
campuran berbagai benzodiazepin (bromazepam, nordiazepam, 7-aminoflunitrazepam,
flunitrazepam, oxazepam, diazepam, clonazepam, temazepam dan midazolam) pada konsentrasi 25
ng / mL dan dengan digoxin dan metildigoxin. pada 5 ng / mL. Semua 10 sampel bebas dari puncak
coeluting pada waktu retensi zat yang dipelajari dan IS yang dideuterasi masing-masing. Analisis
sampel negatif juga menunjukkan bahwa IS tidak mengandung jumlah glikosida jantung pribumi yang
relevan. Tak satu pun dari 10 senyawa yang diuji menunjukkan adanya gangguan ketika ditambahkan
ke sampel darah dengan 5 ng / mL digoxin dan metildigoxin.
3.2.2. Limit of Detection (LOD) dan Kuantitas (LOQ).
Batas deteksi (LOD) diperkirakan dari sampel yang diekstraksi dibubuhi dengan penurunan konsentrasi
senyawa yang diteliti. Batas deteksi (LOD) dan kuantisasi (LOQ) didirikan menggunakan standar deviasi
dari respon (σ) dan kemiringan regresi linier (S), sebagai LOD = 3,3 σ / S dan LOQ = 10 σ / S. Teknik ini
juga menunjukkan sensitivitas tinggi dengan 0,09 ng / mL LOD dan 0,28 ng / mL LOQ, untuk kedua zat,
digoxin dan metildigoxin.
3.2.3. Linearitas.
Analisis regresi linier sederhana dilakukan, dengan kurva kalibrasi yang dibangun dari rasio luas
puncak, spiking sampel whole blood dengan substansi yang diteliti pada 10 konsentrasi glikosida
jantung yang berbeda yang mencakup kisaran (0,3-10) ng / mL. Sepuluh kalibrator digunakan untuk
menghasilkan kurva standar, setiap kalibrator disuntikkan dalam tiga aliquot. Kurva kalibrasi
menunjukkan hubungan linier untuk digoxin dengan koefisien korelasi 0,994 dan untuk metildigoxin
dengan koefisien korelasi 0,996.
3.2.4. Presisi.
Intraday dan koefisien interday dari nilai-nilai variasi ditentukan dengan mereplikasi analisis (n = 5)
dari postmortem spiked blood aliquots, baik dalam jangka waktu yang sama (intraday) atau pada lima
hari yang terpisah (interday). Tiga tingkat konsentrasi dipilih untuk validasi (1, 3, dan 8 ng / mL). Data
presisi disajikan pada Tabel 2 dan 3. Untuk digoxin dan metildigoxin, nilai presisi yang baik diperoleh,
ditunjukkan oleh nilai persen rendah yang jelas di bawah 15%, pada tiga tingkat konsentrasi yang
dipelajari.
3.2.5. Pemulihan Ekstraksi.
Pemulihan SPE ditentukan oleh analisis berulang dari lima sampel yang dibubuhi pada tiga tingkat yang
berbeda dari digoxin dan konsentrasi gelondigoksin (1, 3, dan 8 ng / mL). Pengambilan ekstraksi
ditentukan dengan membandingkan daerah puncak representatif sampel obat bebas yang diekstraksi
yang dibubuhi sebelum ekstraksi dengan area puncak sampel bebas obat yang diperkaya setelah
ekstraksi pada tingkat konsentrasi yang sama. Tabel 2 dan 3 juga menunjukkan bahwa efisiensi
ekstraksi yang dihitung untuk digoxin berkisar antara 83 hingga 100% dan 62-94%, untuk metildigoxin.
Metode ini memberikan efisiensi ekstraksi yang baik untuk digoxin pada semua tingkat konsentrasi.
Namun, untuk metildigoxin, pemulihan yang lebih rendah (tetapi masih baik) tercapai, terutama
dalam konsentrasi yang lebih rendah. Tidak ada efek matriks signifikan yang diamati untuk analit
dalam sampel yang dianalisis. Persiapan sampel sangat penting untuk metode keseluruhan
sehubungan dengan peningkatan sensitivitas dan mengurangi kemungkinan interferensi dari matriks
sampel. Teknik ekstraksi yang digunakan memungkinkan pemulihan yang baik dan selektivitas yang
sesuai dan pada saat yang sama, sederhana dan dapat direproduksi.

4. Kesimpulan
Singkatnya, makalah ini menjelaskan prosedur UPLC-MS / MS untuk analisis kuantitatif digoxin dan
metildigoxin dalam sampel darah lengkap postmortem. Prosedur yang disajikan di sini memiliki
spesifisitas, selektivitas, dan kepekaan yang tinggi dan batas deteksi dan kuantifikasi yang sangat baik
dan dapat dianggap sebagai metode alternatif untuk mendeteksi dan mengukur tingkat terapeutik
glikosida jantung ini [5, 19], menjadi kurang menuntut dan memakan waktu. . Bahkan, metodologi ini
terbukti kurang melelahkan, mengatasi beberapa kerugian dari metodologi yang ada. Metode ini juga
terbukti selektif dan sensitif untuk volume sampel yang berkurang, meskipun tingkat terapeutiknya
sangat rendah, yang merupakan keuntungan tersendiri untuk pencapaian analisis toksikologi pada
toksikologi forensik.