2.1. Bahan Kimia dan Reagen. Standar yang digunakan adalah Naringin (99,18%) diperoleh dari Sigma-Aldrich, AS. Potasium dihidrogen fosfat dan asam orthophosphoric kelas AR dari Merck India Pvt. Ltd (Mumbai, Maharashtra, India). Pelarut HPLC seperti asetonitril dan metanol dari Ranchem Ltd, (Mumbai, Maharashtra, India). Air murni diproduksi di laboratorium dari sistem purifikasi.
2.2 Peralatan dan Kondisi Kromatografi.
Analisis dilakukan menggunakan metode pemisahan HPLC Shimadzu dengan konfigurasi pompa biner LC-20AD dengan degasser DGU-20A5, SPD-20a UV detector. Kontrol sistem, akuisisi data, dan pemrosesan dilakukan dengan perangkat lunak kromatografi Solusi LC (Versi 1.24 SP1). Bahan standar ditimbang menggunakan timbangan analit Sartorius CP 225D. Peralatan penyaringan vakum kaca (Alltech Associates) digunakan untuk penyaringan larutan buffer menggunakan filter 0,22 𝜇m yang diperoleh dari Pall Pvt. Ltd (Ban- galore, India). Degassing fase gerak dilakukan dengan ultrasonik di Oscar Micro clean-103 Ultrasonic bath. Kolom GraceSmart RP C18 (250,0 × 4,6 mm, 5 𝜇m) digunakan sebagai fase diam. Fase gerak isokratik yang digunakan adalah asetonitril dan potasium fosfat (25,0 mM; pH 3,5 ± 0,1, mengandung 0,2% trietilamina; pH disesuaikan menggunakan asam ortofosfat encer) dalam rasio 25: 75% v / v. Fase gerak dipompa dengan laju alir 1,0 mL / menit. Kolom dipertahankan pada suhu 25∘C dan eluen dipantau pada 282.0nm. Semua larutan disuntikkan menggunakan asetonitril: air ultra murni (1: 1) sebagai pengencer. Volume injeksi adalah 20𝜇L dengan total waktu berjalan 10,0 menit.
2.3 Optimasi Metode
2.3.1. Pengaruh pH. Untuk penelitian ini, pemisahan dilakukan pada kolom GraceSmart RP C18 (250,0 × 4,6 mm, 5 𝜇m). Buffer dalam fase gerak dioptimalkan menggunakan 25,0 mM kalium dihidrogen fosfat yang mengandung 0,2% trietilamina (pH yang disesuaikan dari 3,5 atau 7,0) dan amonia asetat (pH 5,0). Analisis NAR dilakukan menggunakan 75% dari buffer dalam asetonitril. Faktor kromatografi seperti faktor kapasitas dan faktor asimetri 10% dihitung menggunakan perangkat lunak kromatografi data LC Solusi 1,24 SP1. 2.3.2. Efek Fase Stasioner. Larutan standar NAR dengan konsentrasi 10.0𝜇g / mL disuntikkan pada berbagai kolom seperti Water Symmetry C18 (250.0 × 4.6 mm, 5 𝜇m), Merck Hibar C18 (250.0 × 4.6 mm, 5 𝜇m), Kromasil C18 (250.0 × 4,6 mm, 5 𝜇m), dan GraceSmart RP C18 (250,0 × 4,6 mm, 5 𝜇m) dan kromatogramnya dicatat. Faktor kromatografi seperti asimetri (10%), faktor kapasitas, dan teoritis plate NAR diamati. 2.3.3. Pengaruh modifikasi Puncak. Solusi standar 10.0𝜇g / mL NAR digunakan untuk evaluasi efek pengubah puncak dalam fase gerak. Kromatogram dicatat dengan dan tanpa pemodifikasi puncak, yaitu 0,2% trietilamin dalam dapar fosfat (25 mM buffer disesuaikan dengan pH 3,5 ± 0,1 dengan asam ortofosfat encer). Faktor kromatografi seperti faktor kapasitas, teoritis plate, dan faktor asimetri 10% diamati.
2.4. Validasi Metode.
Metode ini dikembangkan dan divalidasi sesuai dengan pedoman ICH Q2 (R1) untuk memenuhi kriteria yang ditetapkan oleh pedoman peraturan. 2.4.1 Spesifisitas NAR digunakan untuk nanoformulasi. Obat diekstraksi denganmetode sonikasi dalam metanol selama 5 menit kemudian difiltrasi menggunakan 0,22 𝜇m filter jarum suntik. Larutan yang tersaring diencerkan untuk diperoleh solusi 10,0 𝜇g / mL NAR dan disuntikkan ke HPLC. Formulasi plasebo diproses secara terpisah sebagaimana disebutkan di atas dan disuntikkan ke dalam sistem HPLC diikuti oleh larutan standar NAR (10,0 𝜇g / mL). Formulasi yang dikembangkan juga dianalisis dengan detektor HPLC-PDA untuk memeriksa integritas puncak sebagai kemurnian puncak. Kromatogram dari formulasi plasebo dan standar NAR dibandingkan untuk mengamati gangguan dari eksipien pada waktu retensi NAR.