III.

METODE PENELITIAN

3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini akan dilakukan selama lebih kurang lima bulan di Laboratorium

Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Andalas, Padang.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan untuk ekstraksi-fraksinasi yaitu seperangkat alat

soklet, rotary evaporator, blender, penangas air, erlenmeyer, timbangan, aluminium

foil, timbangan, blender, corong, gelas ukur, kolom kromatografi, pipet ukur, spatel,

pinset.

Alat untuk pengujian aktivitas antioksidan: alat gelas, pites,bola hisap, pipet ukur,

pensil, penggaris, chamber KLT, lampu UV 254 nm dan 365 nm, vortex (Heidolph®),

kuvet, spektrofotometer uv-vis (Shimadzu®).

Untuk pengujian aktivitas antimikroba: vial, tabung reaksi, pipet mikro, Erlenmeyer,

jarum Ose, lampu spritus, batang pengaduk, Laminar Air Flow (LAF), inkubator

(Memmert®), autoklaf (model 25X-2), cawan Petri, timbangan analitik, vortex, kasa,

kamera, hotplate (Cimarec®).

3.2.2. Bahan

Bahan yang digunakan ekstraksi-fraksinasi dan pemeriksaan kandungan kimia

adalah daun Garcinia cowa Roxb., n-heksana, diklorometana, etil asetat, methanol,
aquades, aluminium foil, kapas, kertas saring, silica gel 60 (Merck®), plat silika gel 60

F254 (Merck®), pereaksi Mayer, pereaksi Dragendorff, asam sulfat 2 N, asam klorida

pekat, kloroform, serbuk logam magnesium, larutan besi(III)klorida, dan asam

asetat anhidrat.

Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah

metanol (Merck®), kuesertin (Sigma®), asam galat, reagen Folin-Ciocalteu (Merck®),

aluminium klorida 5%, sodium karbonat 15%, etanol (Merck ®), dan DPPH (Merck®).

Bahan-bahan yang digunakan untuk pengujian aktivitas antimikroba adalah

metanol, larutan NaCl fisiologis, Nutrient Agar (NA), Sabouraud Dextrose Agar

(SDA), Nutrient Broth (NB), air suling, dan mikroba uji yang terdiri dari

Staphylococcus aureus ATCC 6358, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228,

Micrococcus luteus ATCC 9342, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15422,

Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 10231, Salmonella typhosa,

dan Trichophyton mentagrophytes.

3.3. Prosedur Kerja

3.3.1. Pengambilan sampel

Sampel berupa daun asam kandis atau Garcinia cowa Roxb yang diambil dari

Batu Busuk-Limau Manis, Padang, Sumatera Barat.

3.3.2. Identifikasi Tumbuhan

Sampel yang dikumpulkan kemudian diidentifikasi di herbarium ANDA

Universitas Andalas Limau Manis Padang.

3.3.3. Pemeriksaan Kandungan Kimia

Pemeriksaan kandungan metabolit sekunder dilakukan terhadap ekstrak kental

metanol daun kering G. cowa Roxb. Ekstrak kental metanol diperoleh dari 5 gram

daun kering G. cowa Roxb. Pada 5 ml ekstrak kental metanol tersebut ditambahkan

masing-masing 5-10 ml air suling dan kloroform lalu dikocok kuat dan dibiarkan

beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan air digunakan untuk uji senyawa

flavonoid, fenolik, saponin, dan alkaloid. Lapisan kloroform digunakan untuk uji

senyawa terpenoid, streroid, dan alkaloid.

Uji Flavonoid

Sekitar 1-2 tetes lapisan air pada plat tetes ditambahkan beberapa tetes asam

sulfat pekat dan sedikit serbuk logam magnesium. Terjadinya warna merah muda

sampai merah menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

Uji Fenolik

Sekitar 1-2 tetes lapisan air pada plat tetes ditamahkan 1-2 tetes larutan

besi(III)klorida 1%. Bila terbentuk warna biru, berarti terdapat senyawa fenolik.

Uji Saponin

Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok. Apabila terbentuk busa yang

bertahan hingga 15 menit, berarti positif adanya saponin.

Uji Alkaloid
 Lapisan air atau lapisan kloroform (2-3 tetes) ditambah 1 tetes asam sulfat

pekat dan 1-2 tetes pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff. Positif adanya

alkaloid bila terbentuk endapan putih dengan pereaksi Mayer atau warna jingga

dengan pereaksi Dragendorff.

Uji Terpenoid dan Steroid

Lapisan klorofom disaring melalui norit. Hasil saringan dipipet 2-3 tetes dan

dibiarkan mengering pada plat tetes. Setelah kering, ditambahkan 2 tetes asam asetat

anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah berarti positif

adanya terpenoid dan warna biru atau hijau berarti positif adanya steroid.

3.3.4. Ekstraksi dan Fraksinasi

Sampel segar bagian daun asam kandis yang telah dikumpulkan, dibersihkan

dan disortir lalu di keringkan. Kemudian daun kering tersebut dihaluskan sampai

berbentuk serbuk halus. Serbuk kering daun asam kandis (2 kg) diekstraksi dengan

metode sokletasi bertingkat dengan pelarut n-heksana dan diklorometana. Simplisia

kering daun asam kandis sebanyak 200 gram dimasukkan ke dalam alat soxhlet lalu

dibasahi dengan pelarut n-heksana yang ditampung dengan labu alas bulat dan

dipanaskan sampai pelarut n-heksana di dalam alat soxhlet jernih. Setelah semua

sampel di-defatting, dilanjutkan dengan mengekstraksi simplisia tersebut dengan

pelarut diklorometana dengan cara sokletasi yang sama seperti sebelumnya. Kemudian

sari diklorometana dipekatkan dengan rotary evaporator sampai didapatkan ekstrak

kental.
3.3.5. Uji Aktivitas Antioksidan (Williams and Cuvelier, 1995)

Pembuatan larutan DPPH

Larutan DPPH 50 ppm dibuat dengan cara menimbang DPPH sebanyak 5 mg

dilarutkan dengan 100 mL metanol absolut dalam labu ukur.

Pembuatan larutan sampel

Dibuat larutan stok 500 ppm dengan cara menimbang fraksi diklorometana

daun G. cowa sebanyak 5 mg dan dilarutkan dengan metanol absolut sambil diaduk

dan dihomogenkan, kemudian dicukupkan volumenya hingga 10 mL. Selanjutnya

dibuat variasi konsentrasi 10, 20, 50, 100, 150, dan 200 ppm.

Pengukuran daya antioksidan blanko

Pengujian dilakukan dengan memipet 4 mL DPPH, kemudian divortex dan

diinkubasi pada 37°C pada ruangan gelap. Selanjutnya diukur absorbansinya pada

panjang gelombang 517 nm.

Pengukuran daya antioksidan fraksi diklorometana daun G. cowa

Pengujian dilakukan dengan memipet 0,5 mL larutan sampel dari berbagai

konsentrasi (10, 20, 50, 100, 150, dan 200 ppm), kemudian masing-masing

ditambahkan 3,5 mL DPPH. Selanjutnya divortex dan di inkubasi pada suhu 37°C pada

ruangan gelap dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm.

3.3.6. Analisis Data

Aktivitas antioksidan sampel ditentukan oleh besarnya hambatan serapan

radikal DPPH melalui perhitungan persentase inhibisi serapan DPPH dengan

menggunakan rumus:
 (absorbansi DPPH) − (absorbansi DPPH + ekstrak)
% Inhibisi = × 100%
absorbansi DPPH

Selanjutnya ditentukan nilai IC50 yaitu konsentrasi larutan uji yang memberikan

peredaman DPPH sebesar 50% dengan menggunakan persamaan regresi.

3.3.7. Uji Aktivitas Antimikroba

Pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi agar dengan cara sebagai

berikut (Dwidjoseputro, 1982):

Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat gelas dan kertas cakram disterilkan di dalam otoklaf pada suhu

121oC, bertekanan 15 lbs, selama 15 menit. Pinset dan jarum ose disterilkan

dengan cara flambier pada nyala lampu spiritus selama 20 detik. Lemari aseptis

dibersihkan dari debu lalu disemprot dengan etanol 70%. Laminar Air Flow

(LAF) yang telah dibersihkan disterilkan dengan menyalakan lampu UV-nya selama 5

menit.

Pembuatan Media Pembenihan

1. Sebanyak 20 gram serbuk NA (Nutrient Agar) dilarutkan dengan 1 liter air

suling dalam erlenmeyer dan dipanaskan di atas hot plate menggunakan

magnetik stirer sampai terbentuk larutan jernih. Kemudian disterilisasi di

dalam otoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

2. Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

Sebanyak 65 gram serbuk SDA dilarutkan dengan 1 liter air suling dalam

erlenmyer dan dipanaskan di atas hotplate menggunakan magnetik stirer

 sampai terbentuk larutan jernih. Kemudian disterilisasi di dalam otoklaf pada

suhu 121OC dan tekanan 15 lbs selama 15 menit.

Peremajaan Mikroba Uji

Mikroba uji dari stok kultur murni ditanam pada media agar miring dan SDA

lalu diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37OC dan 3-5 hari pada suhu kamar

(25-27OC) untuk jamur.

Pembuatan Suspensi Mikroba Uji

Koloni mikroba uji disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis dengan cara

mengencerkannya dalam tabung reaksi, kemudian dihomogenkan dengan vorteks.

Kekeruhan suspensi diukur dengan spektrofotometer UV-Vis sehingga diperoleh

suspensi bakteri dengan transmittan 25% pada panjang gelombang 580 nm dan

suspensi jamur dengan transmittan 90% pada panjang gelombang 530 nm.

Pembuatan Larutan Sampel Uji

Fraksi diklorometana daun G. cowa ditimbang sebanyak 5 mg lalu dilarutkan

dalam 0.5 ml metanol sehingga didapatkan konsentrasi 1%b/v.

Pengujian Aktivitas Antimikroba

Sebanyak 0,1 ml suspensi mikroba uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi

terpisah yang masing-masing berisi 12 ml media NA untuk bakteri dan media SDA

untuk jamur, lalu dihomogenkan. Kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril

secara terpisah. Setelah media memadat, diletakkan kertas cakram steril dan ditetesi

dengan 10 µ l larutan uji menggunakan pipet mikro. Dibiarkan beberapa lama untuk

pradifusi. Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC untuk bakteri (dalam
inkubator) dan selama 3-5 hari pada suhu kamar (25-27oC) untuk jamur. Diamati

adanya pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter daerah hambatan dengan jangka

sorong. Sebagai kontrol negatif digunakan kertas cakram steril yang telah ditetesi

dengan 10 µ l metanol.

3.4. Jadwal Pelaksanaan

No. Kegiatan Bulan ke-

1 2 3 4 5 6
1. Persiapan dan
Pelaksanaan Penelitian
2. Pengolahan Data
3. Penulisan
Skripsi/Makalah Seminar
4. Persiapan Seminar Hasil
5. Penyempurnaan Skripsi
dan Persiapan Ujian
Akhir
6. Ujian Akhir