Konsentrasi Serum Protein yang Memodulasi Aktivitas Lipopolisakarida

pada Tuberkulosis

Nicole P. Juffermans, Annelies Verbon, Sander J. H. van Deventer, Wim A.

Buurman, Henk van Deutekom, Peter Speelman, and Tom van der Poll

Lipopolisakarida (LPS) adalah stimulator utama pada pertahanan seseorang

terhadap bakteri gram negatif. Protein pengikat LPS (LPS Binding Protein atau
LBP), protein yang meningkatkan permeabilitas bakterisida
(Bacterisidal/permeability increasing protein atau BPI), dan CD14 yang dapat larut
serum (sCD14) dapat berikatan dengan LPS dan mengatur kadar toksisitasnya.
Lipoarabinomannan, suatu komponen dinding sel Mycobacterium tuberculosis
yang menyerupai LPS, berhubungan dengan proses induksi respon inflamasi
melalui pengenalan lipoarabinomanan dengan LBP dan sCD14. LBP, BPI, dan
sCD14 diukur kadarnya dalam serum dari 124 pasien dengan tuberkulosis, pada
orang yang berhubungan dekat dengan pasien tuberkulosis paru, dan pada
kelompok kontrol yang sehat. Kadar protein pengatur toksisitas LPS meningkat
pada pasien dengan TB aktif dibandingkan dengan kelompok kontak pasien TB dan
kelompok kontrol. Kadar protein pengatur toksisitas LPS juga menurun selama
pemberian pengobatan TB. Kadar LBP dan sCD14 lebih tinggi pada pasien dengan
demam dan anoreksia. Protein pengatur toksisitas LPS dapat memainkan peran
dalam pertahanan individu pada tuberkulosis, melalui interaksinya dengan
lipoarabinomannan.

Diperkirakan, kurang lebih sepertiga penduduk dunia terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis. Di negara-negara industri, prevalensi kasus
tuberkulosis sangat sulit untuk diturunkan. Mekanisme pertahanan individu selama
tuberkulosis dan jalur di mana M. tuberculosis menginduksi respon inflamasi masih
belum sepenuhnya dipahami.

Lipopolisakarida (LPS) adalah stimulator utama pada pertahanan individu

terhadap bakteri gram negatif. Bioavaibilitas dari LPS diatur oleh sejumlah protein
serum, termasuk protein pengikat LPS (LBP), protein yang meningkatkan
permeabilitas bakterisida (BPI), dan CD14 larut serum (sCD14). LBP membantu
pengikatan LPS dengan CD14, yaitu suatu glikoprotein yang diekspresikan pada
permukaan monosit dan neutrofil yang penting untuk induksi respons peradangan.
BPI adalah protein yang disekresikan oleh butiran azurofilik neutrofil yang
mengikat dan menetralisir LPS. Aktivitas LPS selanjutnya diatur lebih lanjut oleh
sCD14, suatu domain ekstraseluler CD14 terikat sel, yang dapat memungkinkan
LPS untuk dapat mengaktifkan sel yang kekurangan membran CD14 atau
menghambat efek LPS pada sel yang mengekspresikan CD14 melalui mekanisme
kompetisi pengikatan LPS dengan CD14.

Lipoarabinomannan (LAM) adalah suatu glikoprotein yang merupakan

komponen dinding sel M. tuberculosis yang terlibat sebagai faktor utama dalam
induksi pelepasan sitokin selama tuberkulosis. LAM memiliki banyak sifat
fisiokimia yang serupa dengan LPS serta menggunakan LBP, CD14 terkait sel, dan
sCD14 dengan mekanisme yang mirip dengan LPS untuk memberikan efek
inflamasi pada sel. Dapat dibayangkan bahwa protein serum yang terlibat dalam
regulasi aktivitas LPS juga memainkan peran dalam pengaturan respon inflamasi
selama tuberkulosis melalui interferensi protein serum tersebut dengan
bioavailabilitas LAM. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menentukan
konsentrasi serum LBP, BPI, dan sCD14 pada pasien dengan tuberkulosis sebelum,
selama, dan setelah diberikan terapi antituberkulosis.

Metode

Kelompok Pasien TB

Serum diperoleh dari 82 pasien dengan tuberkulosis aktif dan telah

dibuktikan melalui pemeriksaan kultur. Dari pasien-pasien ini, 32% adalah
perempuan. Usia rata-rata adalah 35 tahun (berkisar antara 15–86). Di antara
mereka, 46 orang menderita tuberkulosis paru dan 36 orang menderita tuberkulosis
ekstraparu. Daerah ekstraparu yang dimaksudkan diantaranya adalah kelenjar getah
bening (n=8), pleura (n=12), tulang dan sendi (n=6), jaringan lunak (n=2),
meninges (n=3), dan saluran gastrointestinal (n=2). Pada 3 pasien, penyakit meluas
ke berbagai bagian tubuh. Sampel serum juga diperoleh dari 15 pasien dengan
tuberkulosis yang telah menerima terapi selama minimal 2 minggu tetapi belum
menyelesaikan terapi pada saat pengambilan sampel darah, dan juga dari 16 pasien
yang telah menyelesaikan terapi setidaknya 1 bulan dan tidak lebih dari 1 tahun
sebelum pengambilan sampel darah, serta dari 11 pasien yang telah menyelesaikan
terapi setidaknya setahun dan tidak lebih dari 2 tahun sebelum pengambilan sampel
darah. Karena analisis dari kedua kelompok terakhir mengungkapkan tidak ada
perbedaan (data tidak ditampilkan), sehingga hasilnya digabungkan. Dari 124
pasien ini, 66 pasien berasal dari Pusat Medis Akademik dan 58 pasien berasal dari
Dinas Kesehatan Kota di Amsterdam. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam
asal etnis antara kelompok pasien, yang mana terdiri dari ras Eropa (43%), Asia
(24%), Afrika (17%), dan Amerika Selatan (16%). Rekam medis semua pasien
dengan tuberkulosis aktif ditinjau, dan data klinis seperti demam (suhu rektal
>38°C) dan anoreksia (kehilangan nafsu makan dan penurunan berat badan) juga
ikut diberi skor. Empat belas pasien memiliki human immunodeficiency virus (HIV)
seropositif dan 67 pasien HIV-seronegatif atau tidak memiliki antibodi terhadap
HIV. Karena tidak ada perbedaan yang ditemukan antara pasien HIV-seropositif
dan seronegatif dan pasien dengan status HIV yang tidak diketahui (data tidak
ditampilkan), semua data pasien tersebut digabungkan menjadi satu.

Kelompok Kontrol

Serum diperoleh dari 16 orang yang telah melakukan kontak dekat dengan
pasien tuberkulosis paru aktif; 1 orang memiliki hasil tes kulit tuberkulin-positif
dan 15 orang tidak responsif terhadap tuberkulin. Semua subyek kontak dekat
dengan pasien TB direkrut dari layanan kesehatan kota selama pemeriksaan kontak
dan tidak dibedakan dari kelompok pasien TB dalam usia dan asal etnis. Serum juga
diperoleh dari 10 kontrol yang sehat, dan sesuai dalam jenis kelamin dan usia,
dengan hasil tes tuberkulin negatif.
Pemeriksaan

Serum dikumpulkan setelah sentrifugasi dan disimpan pada suhu -20°C

sampai dilakukan pemeriksaan. Semua tes dilakukan dalam rangkap dua. LBP
diukur dengan ELISA seperti yang dijelaskan sebelumnya, menggunakan
poliklonal kelinci anti-LBP manusia (5 mg/ mL) sebagai antibodi penangkap,
pigmen anti-manusia polikonal kelinci biodinilasi sebagai antibodi pelabel, dan
LBP rekombinan sebagai standar. BPI diukur dengan ELISA seperti yang telah
dijelaskan, menggunakan antibodi anti-monoklonal manusia (3 mg / mL) sebagai
antibodi penangkap, BPI IgG dari antibodi poliklonal dari kelinci sebagai antibodi
yang mendeteksi, dan BPI rekombinan manusia sebagai standar. sCD14 diukur
dengan ELISA sesuai dengan petunjuk dari produsen mesin ELISA yang digunakan
(Biosource Eropa, Fleurus, Belgia). Batas deteksi tes adalah 781 pg / mL (LBP),
391 pg / mL (BPI), dan 2 ng / mL (sCD14).

Analisis Statistik.

Semua nilai disajikan sebagai median (dalam rentang). Untuk mengukur

perbandingan antar kelompok dilakukan dengan menggunakan uji Wilcoxon untuk
sampel yang tidak cocok. P<0.05 dianggap signifikan.

Hasil

LBP

Konsentrasi LBP serum tidak berbeda antara pasien dengan TB paru dan
TB ekstra paru (85,1 mg / mL [berkisar antara 12,3–411,0] dan 71,5 mg/ mL
[berkisar antara 25,4–334,0], dimana keduanya tidak signifikan). Pasien dengan
tuberkulosis aktif memiliki kadar yang lebih tinggi (78,6 mg/ mL [kisaran, 12,3-
3340,0]) dibandingkan pasien yang sedang mendapatkan terapi tuberkulosis (32,7
mg / mL [berkisar 8,8–188,0]; P=0,001), pasien yang telah menyelesaikan terapi
(29,0 mg / mL [berkisar antara 10,6-268,0]; P <0,05), kontak dekat pasien TB (40,4
mg / mL [berkisar antara 12,2-150,0], P <0,005), dan kontrol yang sehat (12,6 mg
/ mL [kisaran, 6,4– 60.4]; P <.001) (gambar 1). Pada pasien dengan tuberkulosis
aktif yang mengalami demam atau anoreksia, LBP meningkat secara signifikan
dibandingkan dengan kadar LBP pada pada pasien dengan suhu normal atau tanpa
anoreksia (tabel 1).

BPI

Konsentrasi serum BPI tidak berbeda antara pasien dengan TB paru dan TB
ekstra paru (5,9 ng / mL [berkisar antara 0,4-5,5,5] dan 8,3 ng / mL [berkisar antara
0,4–123,0], dimana keduanya tidak signifikan). Pasien dengan tuberkulosis aktif
memiliki kadar BPI yang lebih tinggi (6,7 ng / mL [berkisar antara <0,4–123,0])
daripada kelompok kontak dekat pasien TB (3,9 ng / mL [berkisar antara <0,4-0,5];
P< 0,05) dan kelompok kontrol yang sehat (1,8 ng) / mL [berkisar antara, 0,5–8,0];
P<0,005). Tingkat serum rata-rata BPI pada pasien yang telah menyelesaikan terapi
(4,8 ng / mL [berkisar antara <0,4-32,9]) dan dalam kelompok kontak dekat lebih
meningkat dibandingkan dengan kelompok kontrol (P <0,05 dan P = 0,05, masing-
masing). Tidak ada perbedaan dalam BPI antara pasien dengan dan tanpa gejala
klinis (tabel 1).

sCD14

Serum sCD14 lebih tinggi secara signifikan pada pasien TB ekstra paru
dibandingkan pada pasien TB paru (7,2 mg / mL [berkisar antara 3,2-16,2] dan 5,8
mg / mL [berkisar antara 2,1-13,6], dengan masing-masing; P <0,05). Semua
kelompok pasien memiliki kadar sCD14 yang lebih tinggi secara signifikan
daripada kelompok kontak dekat pasien TB, tetapi kadar sCD14 pasien selama
terapi tidak berbeda dari kelompok kontrol. Konsentrasi nilai tengah serum sCD14
pada pasien dengan tuberkulosis aktif (paru atau ekstraparu) adalah 6,0 mg/ mL
(berkisar antara 2,1-16,2), yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan pada
pasien dalam terapi antituberkulosis (4,8 mg / mL [berkisar antara <2,0-9,0]; P =
.01), pada pasien yang telah menyelesaikan terapi (3,4 mg / mL [berkisar antara
<2,0-9,4]; P <0,001), dalam kelompok kontak dekat (2,6 mg / mL [berkisar antara
<2,0-4,0]; P <.001), dan dalam kelompok kontrol yang sehat (3,5 mg / mL [berkisar
antara <2,0–6,4]; P <0,001). Kadar nilai tengah serum sCD14 pada pasien dengan
tuberkulosis aktif yang mengalami demam meningkat secara signifikan
dibandingkan dengan pasien dengan suhu normal (tabel 1).

Gambar 1. Konsentrasi serum protein pengikat lipopolisakarida (LBP), protein

bakterisidal (BPI), dan CD14 larut serum (sCD14) pada pasien dengan
tuberkulosis aktif (TB; n 5 82), pada pasien selama (n=15) dan setelah pengobatan
(n=26), pada orang yang telah kontak dekat dengan tuberkulosis menular (n=16),
dan dalam kontrol yang sehat (n= 10). Garis horizontal mewakili median.
Tabel 1. Hubungan antara kadar protein pengikat lipopolisakarida (LBP), protein
yang meningkatkan permeabilitas bakterisidal (BPI), dan CD14 larut serum
(sCD14) dengan gejala klinis selama tuberkulosis aktif.

Demam Anoreksia
Ya Tidak Ya Tidak
LBP (ug/mL) 92.3 (18.9– 55.9 (13.0– 91.2 (18.5– 64.7 (12.3–
3340.0) 411.0) 3340.0) 670.0)
BPI (ug/mL) 6.6 (0.4– 6.8 (0.4– 5.5 (0.4– 6.94 (0.4–
123.0) 123.0) 51.5)) 123.0
sCD14 7.8 (2.1–16.2) 5.4 (2.7–8.5) 6.5 (3.1–16.2) 5.8 (2.1–
(ug/mL) 15.3)
Catatan: Data median dari 82 pasien dengan tuberkulosis aktif. Demam
didefinisikan sebagai suhu rektal >38°C; anoreksia sebagai kehilangan nafsu makan
dan penurunan berat badan

Diskusi

Respon imun pejamu terhadap tuberkulosis di awali oleh stimulasi dari sel-
sel inflamasi pada komponen dinding sel mikobakteri yaitu LAM. Protein yang
dikenali sebagai pengatur aktivitas LPS juga memiliki keterlibatan dalam respon
seluler terhadap LAM. Kami menentukan konsentrasi serum dari protein pengatur
aktivitas LPS tersebut, yaitu LBP, BPI, dan sCD14 pada pasien dengan berbagai
manifestasi tuberkulosis. Ketiga protein tersebut meningkat selama tuberkulosis
aktif dan menurun selama pengobatan.

Peningkatan konsentrasi serum LBP telah dilaporkan sebelumnya pada

pasien dengan sepsis dan subyek sehat diinjeksi dengan LPS. Penemuan kami
tentang peningkatan konsentrasi LBP pada pasien dengan tuberkulosis aktif
kemungkinan memiliki hubungan dengan adanya reaksi host terhadap infeksi
tuberkulosis. LAM menginduksi terbentuknya faktor nekrosis tumor (tumor
necrosis factor) dan interleukin-1b melalui jalur sel monosit atau makrofag THP-1
dengan mekanisme yang terkait dengan CD14, sebuah proses yang ditingkatkan
oleh LBP. Dengan demikian, peningkatan kadar LBP dapat memudahkan reaksi
inflamasi pada pasien dengan tuberkulosis. Tingkat LBP juga ditemukan lebih
tinggi pada pasien dengan demam dan/atau anoreksia. Karena LBP juga ditemukan
dalam cairan sekret lavage bronchoalveolar manusia yang sehat dan pasien dengan
kerusakan paru, ada kemungkinan bahwa LBP juga mempengaruhi bioavailabilitas
LAM di paru-paru selama tuberkulosis paru.

BPI adalah produk degranulasi neutrofil yang memberikan efek bakterisida

pada bakteri gram negatif dan menetralisir aktivitas LPS baik in vitro maupun in
vivo. Sebagaimana pada pasien dengan sepsis dan individu yang diberikan
endotoksin, konsentrasi serum BPI lebih tinggi pada pasien dengan tuberkulosis
aktif, meskipun tidak ada perbedaan yang ditemukan antara pasien dengan dan
tanpa demam ataupun anoreksia.Meskipun hal ini tampaknya berkaitan dengan
homologi urutan asam amino 140 antara LBP dan BPI dan sifat antara LPS dan
LAM yang berkaitan dengan interaksi LBP/CD14, akan tetapi penelitian lebih
lanjut masih diperlukan untuk menentukan apakah BPI dapat mempengaruhi
bioaktivitas LAM dengan cara yang mirip dengan LPS.

Penelitian sebelumnya telah membuktikan adanya peningkatan konsentrasi

serum sCD14 pada pasien dengan sepsis. Kadar sCD14 yang tinggi juga ditemukan
dalam cairan lavage bronchoalveolar pada pasien dengan gangguan paru-paru,
termasuk tuberkulosis. Penelitian kami memperluas temuan ini untuk menemukan
peningkatan konsentrasi serum sCD14 pada pasien dengan tuberkulosis aktif.
sCD14 memungkinkan respon terhadap LPS oleh sel-sel yang memiliki sedikit
ataupun tanpa membran dengan CD-14. Yang menarik adalah pasien dengan
tuberkulosis ekstraparu memiliki kadar sCD14 lebih tinggi daripada pasien dengan
tuberkulosis paru. Hal ini mungkin diakibatkan oleh penurunan kepekaan terhadap
sel dengan LAM pada daerah ekstraparu dibandingkan dengan sel sel alveolar, akan
tetapi penelitian lebih lanjut tentang regulasi bioaktivitas LAM oleh sCD14 selama
tuberkulosis masih tetap diperlukan.

Kami di sini menemukan bahwa LBP, BPI, dan sCD14 meningkat dalam
serum pasien dengan tuberkulosis aktif dan menurun selama pengobatan. Untuk
mengetahui apakah protein ini memiliki peran penting dalam respon inflamasi
selama tuberkulosis masih harus diselidiki lebih lanjut.