Halaman 1

Proc. Nat. Acad. Sci. Amerika Serikat Vol. 69, No. 6, hlm. 1408-1412, Juni 1972
Pemurnian biologis aktif globin Messenger RNA dengan kromatografi pada Oligothymidylic
asam-Selulosa (p.ly (A) -richi inRNA / kelinci globin niRN A / asites tumiior bebas sel systelml)
HAIM AVIV ANI) PHILIP LEI) ER Laboratorium Genetika Molekuler, Institut Nasional
Kesehatan Anak dan Pembangunan Manusia, Institut Kesehatan Nasional, Bethesda,
Maryland 20014 Coinnmunicatel BYE. IR. Stadtrnan, 22 Maret 1972
ABSTRAK
Teknik yang mudah digunakan untuk parsial pemurnian jumlah besar fungsional, poli
(adenylic asam) -rich mRNA dijelaskan. Metode ini tergantung anil poli (asam adenylic) -rich
mRNA ke oligothymi- kolom selulosa asam dylic dan elusi dengan buffer kekuatan
ion penerbangan. Biologis aktif kelinci globin mRNA telah dimurnikan dengan prosedur ini
dan diuji kemampuannya untuk mengarahkan sintesis globin kelinci di a ekstrak bebas
sel dari ascites tumnor. Karena beragamnya mRNA mamalia tampak kaya poli (adenylic
asam) dan dapat kemungkinan besar akan diterjemahkan dalam ascites bebas sel ekstrak,
pendekatan ini harus membuktikan umumnya berguna sebagai i -itial langkah dalam isolasi
mRNA spesifik. Berbagai pertanyaan mengenai ekspresi INFORMATION genetik
tion pada organisme yang lebih tinggi tergantung pada deteksi dan isola-
tion gen spesifik messenger RNA (mRNA). Berbeda dengan sistem bakteri, di
mana transducing fag menyederhanakan ini prosedur, isolasi dan deteksi sel hewan mRNAin
telah mengandalkan sebagian besar pada studi tentang kinetika radioaktif pelabelan RNA
polisomal dan pada teknik yang mengeksploitasi perbedaan berat molekul
mereka. Sementara teknologi ini- tehnik berguna, metode yang
mengambil keuntungan dari lainnya Sifat unik dari mRNA harus membuktikan nilai juga. MiR
putatif yang diisolasi dari sel binatang berbeda dari spesies RNA lain di bahwa mereka
mengandung relatif lama membentang dari residu asam adenylic (1-4). Peran yang tepat
poli ini (A) -rich daerah dalam metabolisme mRNA adalah tidak diketahui, tetapi
telah menyarankan bahwa mereka terlibat dalam pengangkutan mRNA dari inti
sel ke sitoplasma, di mana sintesis protein terjadi (4-5). beberapa pekerja
telah menggunakan pengikatan poli (A) -rich RNA ke oligo (dT) -cellulose (6), dengan poli (U)
-cellulose (7), Ohito nitroselulosa filter (4, 8) untuk mendeteksi poli (A)
daerah atau mRNA diduga. Karena kelinci globin mRNA mengandung poli (A) -rich daerah (1,
8, 9), tampaknya mungkin bahwa fitur ini, bersama-sama dengan alat tes yang sangat
sensitif untuk biologicalactivity dari mRNA (10), akan membuktikan
berguna dalam purifica- preparatif tion ini dan mRNA biologis aktif lainnya. Pada penelitian
ini, kami menunjukkan bahwa oligo (dT) -cellulose
kromatografi dapat beused mudah untuk globin terpisah mRNA dari sebagian besar RNA
ribosom di polysomal mentah ekstrak. Oligo (dT) -cellulose tampaknya memiliki
beberapa ad- unik vantages untuk tujuan ini. Pemurnian pesan globin dalam langkah-
langkah andsubsequent ini sangat difasilitasi oleh sensi- assay tive untuk sintesis in vitro
kelinci globin. BAHAN DAN METODE Sumber dari banyak reagen yang digunakan dalam
penelitian ini memiliki telah ditunjukkan (10). Untuk sintesis oligo (dT) -cellulose, Whatman
selulosa bubuk CC 41 diperoleh dari Reeve Malaikat; timidin-5'-monofosfat, dari Schwarz-
Mann; dan NN'-diciklohexylearbodiimide, dari Aldrich. [3H] - Leusin (aktivitas spesifik, 26 Ci /
mmol); ['4C] leusin (spesifik aktivitas, 263 Ci / mol) dan [14C] valin (aktivitas spesifik, 219 Ci /
mol), dari New England Nuclear; [14C] lisin (spesifik aktivitas, 312 Ci / mol), dari Amersham,
['4C] alanin (spesifik aktivitas, 160 Ci / mol) dari Schwarz penelitian Bio. Kelinci hati transfer
RNA (tRNA) didapati General Biochem- ical Trypsin ("chymotrypsin-free") diperoleh dari
Worthingtoii. Chromo-Beads resin pertukaran kation, jenis P, diperoleh dari Technicon.
Persiapan Oligo (dT) -Cellulose. Oligo (dT) -cellulose itu
disusun sesuai dengan Gilham, menggunakan N, N'-dicyclohexyl- Reaksi carbodiimide
untuk polimerisasi timidin-5' monofosfat pada selulosa (11). Satu gram (berat kering) dari
oligo (dr) -cellulose disiapkan dengan cara ini dipertahankan dan jenuh sekitar 160-200,
ug poli (A) di bawah menderita penyakit tersebut tions mencatat bawah. Persiapan mRNA
Rabbit Globin. Kelinci retikulosit -lolysomes diisolasi dengan prosedur yang
dijelaskan (12). RNA diekstraksi dari polysomes oleh modifikasi dari prosedur yang
dijelaskan oleh Lee, Mendecki, dan Brawerman (4). The polysomes dihentikan pada 0,1
M Tris-HCl (pH 9.0) - 0,1 M NaCl-1 mM EI) TA pada konsentrasi 20 A 260 unit / ml dan
kemudian dibuat 1% sodium dodesil sulfat (SDS). Volume yang sama dari fenol-kloroform-
isoamil alkohol 50: 50: 1 ditambahkan, campuran dikocok dengan kuat selama 10
mill pada suhu kamar dan dingin untuk 50, dan fase dipisahkan dengan
sentrifugasi pada 12.000 X g selama 10 menit. Fase air telah dihapus, diekstrak lagi seperti di
atas, dan membuat 2% di CH3COOK (pH 5,5). RNA polysomal mentah diendapkan
dengan penambahan dua volume etanol dan diizinkan untuk berdiri di - 20 °
semalam. RNA adalah kumpulkan lected dengan sentrifugasi pada 12.000 X g pada -20
° selama 20 menit. RNA pelet dicuci dua kali dengan etanol-0,2 M NaCl 2: 1 dan dilarutkan
dalam H20 atau, jika oligo (dT) -cellulose chromatog- raphy wasto beused, di 0,01 M
Tris HCl (pH 7,5) -0,5 M KCl. 1408 Singkatan: SDS, natrium dodesil sulfat.

Halaman 2

Oligo (dT) -Cellulose Chromatography 1409 Oligo (dT) -Cellulose

Chromatography. Semua operasi yang dilakukan suhu atroom dengan gelas dan reagen
[mantan kecuali bahwa untuk oligo (dT) -cellulose] yang telah diautoklaf. 100 A260 unit
kelinci kasar retikulosit polisomal RNA dis- dipecahkan dalam buffer aplikasi yang
mengandung 0,01 1 \ I Tris-HCl (pH 7,5) -0,5 M KCl diterapkan pada 2-ml (sekitar 0,5 g, berat
kering) oligo (dT) kolom -cellulose sebelumnya dicuci dengan aplikasi penyangga. Bahan
Selebihnya, dielusi dengan terus cuci dengan penyangga aplikasi Materi yang dipertahankan
oleh kolom dielusi dalam dua langkah dengan buffer berkurang kekuatan ionik (13). Elusi
penyangga pertama berisi 0,01 1 \ I Tris-HCl (pH 7.5) -0,1 M KCl; yang kedua, 0,01 M Tris
HC1 (pH 7.5). Bahan yang dielusi dengan cara ini segera diendapkan dengan penambahan
CH3COOK dan dua volume etanol seperti disebutkan di atas, atau, jika
cukup terkonsentrasi, itu beku langsung dan disimpan dalam nitrogen cair. lrocedure The
dapat ditingkatkan 20 kali lipat untuk mengakomodasi 2000 A260 Unitsof
RNA polysomal tanpa kesulitan, dan oligo (dT) -cellulose
dapat diregenerasi untuk digunakan berulang-ulang oleh elutionwith 0,1 M KOH. Sel-Free
Protein mensintesis Sistem dan Tes. Sebuah sel- sistem protein sintesis bebas (S30) yang
tRNA depen- penyok dibuat dari Krebs II sel ascites tumor (10). Globin mRNA diuji dalam
campuran reaksi 0,06 ml yang terkandung 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 3,5 mMmagnesium
asetat, 100 mM KCl, 7 mM 2-mereaptoethanol, 1 mM ATP, 0,1 mM GTP, 0,6 mM CTP, 10
mM kreatin fosfat, 8 jig creatine kinase, 40 Jim (masing-masing)
dari 19 amino nonradioactive asam, 5 Jim asam amino radioaktif dari diindikasikan spesifik
yang tinggi Kegiatan ([3H] leusin atau [I4C] leusin, [14C] valin, [14C] lisin, dan [ '4C]
alanin seperti yang ditunjukkan), 0,29 A260 Unit tRNArabbit, 15 jil dari sebelumnya
diinkubasi ekstrak sel aseites tumor con taining 14 mg / ml protein, dan mRNA, seperti
yang ditunjukkan. Di- cubation berada di 370 selama 60 menit. Reaksi dihentikan oleh
Selain dari 0,2 ml of0.1 M KOH. Inkubasi dilanjutkan selama 20 menit,
dan 1 ml 10% Cl3CCOOH dingin ditambahkan. Jika campuran itu tidak digunakan untuk
analisis, itu akan didinginkan 0 ° for5 menit, endapan andthe dikumpulkan selama 0,45-jim
pori-size Millipore filter, dicuci tiga kali dengan 3 ml (masing-masing) dari 5% Cl3CCOOH,
kering, dan dihitung dalam cairan kilau counter di efisiensi 20-25% untuk 3H dan 50% untuk
14C. Semua penentuan dilakukan dalam rangkap dua. Kelinci globin label dengan [14C]
leusin, usedas standar untuk tryptic analisis peptida, disintesis ina kelinci retikulosit lysate
dengan globin kelinci endogen mRNA (9). PROSEDUR ANALYTIC Sodium Dodecyl
Sulfate (SDS) -2-Mercaptoethanol-Poly akrilamida Gel Elektroforesis. Produk-produk dari
mix- reaksi membangun struktur sel tumor asites mengandung [14C] leusin, [I4C] -
valin, [14C] lisin, dan [I4C] alanin disiapkan dan sub menolaknya untuk elektroforesis pada
200 V selama 5 jam dalam slab mengandung a 7-28% gradien linier dari poliakrilamida
dengan prosedur (14) hampir identik dengan Maizel (15). Lempengan kering terkena Film x-
ray selama 36 jam dan dikembangkan. Analisis Peptida Tryptic. Produk campuran reaksi-
mendatang disutradarai oleh kelinci globin mRNA mengandung [3H] leusin dibuat 0,1 M
dalam asam tetraacetic ethylenediamine (EDTA), diobati dengan 0,1 mg
/ ml RNase pankreas sapi, dan di- cubated di 370 selama 10 menit. Produk tersebut
kemudian diendapkan di 10%. C13COOH, dan dicuci dua kali witha solusi contain- ing 5%
CIICOOH, dua kali dengan aseton yang mengandung 0,035 M HCO dan 3,5% (b / v) asam
oksalat, dan dua kali dengan aseton (9). Itu pelet (sekitar 1 mg protein) dihentikan dalam 1
ml 0,1 MI NH4HCO3 (pH S.0), 40 jig / ml tripsin ditambahkan, dan
Campuran diinkubasi pada 370 selama 16 jam. Tripsin tambahan, 40 jig /
ml, ditambahkan dan inkubasi dilanjutkan selama 5 jam.
Protein dicerna diliofilisasi, dilarutkan dalam piridin asetat (278 ml asam asetat, 16,1 ml
piridin, 705,9 ml H20; pH 3.1), dan diterapkan, bersama-sama dengan sama diperlakukan
kelinci globin diberi label dengan leusin ['4C], ke kolom 1 X 20 cm yang mengandung Jenis
Technicon resin P tukar kation sebelumnya equili- brated dalam buffer yang sama. Produk
dielusi dengan gradien yang terdiri dari 180 ml piridin asetat (pH 3.1) dan 180 ml piridin
asetat (139 ml asam asetat, 161 ml piridin, 700 ml H20; pH 5.0) (16). Sampel sekitar 1,8 ml
adalah col- putaran dan banyaknya getaran I4C dan 3H radioaktivitas ditentukan oleh scin-
tillation penghitungan. Sedimentasi Gradient Sukrosa. Sampel RNA dilapisi pada gradien
sukrosa 5-20% yang mengandung 0,01 MI Tris HCI (pH 7.5) -0.1 KCl-0.001 MI EDTA dalam
rotor SW 27 rotor ember 1044 adaptor dan disentrifugasi pada 27.000 rpm selama 17
jam Sekitar 40 fraksi dikumpulkan, dan A260 mereka bertekad. Kemampuan aliquot 0,005
ml untuk mengarahkan lroteil sintesis dalam sistem bebas sel tumor ascites itu determilled
seperti disebutkan di atas. Poliakrilamida Gel Elektroforesis RNA. Elektroforesis dalam gel
slab polyacrylamide-0,5% 4% dilakukan pada 75 V selama 240 menit (17). Contoh 3-
jig diaplikasikan gel dan terdeteksi oleh teknik "noda semua" yang sensitif (17). HASIL Oligo
(dT) -Cellulose Chromatography of Recticulocyte Poly- RNA somal. Seperti ditunjukkan
dalam Gambar. 1, lebih dari 90% dari total poli- somal RNA diterapkan pada oligo
(dT) kolom -cellulose adalah dielusi dengan bagian depan aplikasi dan tidak dipertahankan
oleh kolom (puncak A). Subseqt nf 'tudies, menggunakan lebih luas dicuci
kolom, iindicatf bahwa jumlah RNA dipertahankan Seringkali kurang dari 3% dari total RNA
yang diterapkan. Kapan Konsentrasi pelepasan elusi KCI berkurang " 20 ED O ~~~~% .2. B 0 8
16 24 32 40 48 PECAHAN 56 64 ARA. 1. Oligo (dt) kromatografi -cellulose dari retikulosit
RNA polysomal. Puncak A, material yang tidak dipertahankan oleh kolom; puncak B, bahan
dielusi dengan buffer ditunjukkan dari in- kekuatan ion terminasi; puncak C, bahan yang
dielusi dengan in- dicor buffer kekuatan ion rendah. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69 (1972)

Halaman 3

1410 Biokimia: Aviv dan Leder vD : 0 3 w 0 0. 0 o 2- 0 z -J 0,02 0,04 0,06 RABBIT

RETICULOCYTE RNA TAMBAHKAN (A260 / 0.06mI) ARA. 2. Sintesis protein yang diarahkan
oleh RNA retikulosit di sistem sel tumor bebas asites. (@ 0), RNA dimurnikan pada oligo (dT)
-cellulose (peakC, Gambar 1.); (OO), reticulo- mentah cyte polysomal RNA; (SEBUAH/
A), RNA retikulosit tidak dipertahankan oleh oligo (dT) -cellulose (puncak A, Gambar. 1). 0,5-
0,1 M, sejumlah kecil UV menyerap materi adalah dielusi (peak B), tetapi ketika kekuatan
ionik dari elusi buffer kemudian dikurangi oleh kelalaian KCl, tambahan dan puncak yang
lebih besar muncul (puncak C). Dua puncak yang lebih besar yang terkonsentrasi,
dan kemampuan mereka untuk mengarahkan syn protein bebas sel tesis dalam sistem
bebas sel tumor ascites ditentukan. mRNA actvity dari Oligo (dT) -Cellulose Pecahan dan
Karakterisasi Produk mereka. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, kecil
jumlah retikulosit mentah RNA dirangsang penggabungan [3H] leusin menjadi protein
dalam tumor ascites sistematis bebas sel tem. Materi yang awalnya tidak dipertahankan
oleh oligo (dT) -cellulose (puncak A) relatif tidak aktif dalam merangsang penggabungan [3H]
leusin menjadi protein. Sebaliknya, itu Bahan ditahan oleh oligo (dT) -cellulose dan
dielusi pada termurah kekuatan ionik (puncak C) paling aktif sebagai mRNA di sel- sistem
bebas Jumlah bahan yang sangat terbatas dielusi pada menengah kekuatan ion (peak
B) wasnot diuji untuk ini tujuan. Protein disintesis dalam menanggapi dua RNA aktif fraksi
telah ditandai dengan gel SDS-poliakrilamid elektroforesis dan dengan analisis peptida
tryptic mereka. Itu produk utama disintesis dalam menanggapi retikulosit mentah RNA
polysomal dan RNA dimurnikan pada oligo (dT) -cellulose (peak C) adalah polipeptida dari
sekitar 17.000 dalton bahwa co- bermigrasi dengan kelinci globin pada elektro SDS-
poliakrilamida phoresis (Gambar. 3). Selain itu, sejumlah kecil peptida lebih ringan dari
kelinci globin muncul di hadapan kedua poli- somal RNA dan RNA dimurnikan pada oligo
(dT) -cellulose. Ini merupakan sekitar 4% dari total jumlah pada setiap gel. Tidak produk
berlabel dibentuk dengan tidak adanya mRNA (Gambar. 3). Produk disintesis di
bawah arahan RNA dimurnikan pada oligo (dT) -cellulose diperlakukan dengan tripsin, dan
peptida yang diberi label dengan [3H] leusin dibandingkan dengan kation
kromatografi pertukaran untuk peptida diberi label dengan [14C] - leucine
berasal dari globin yang dibentuk secara endogen di kelinci STANDAR Myosin y-globulin
Rantai berat Y-giobulin Rantai ringan - _ kelinci 0_ Oleh-- Globin mRNA Ditambahkan Tidak
ada Mentah (dT) .Cellulose Polysomnai Dimurnikan ARA. 3. Sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electro- phoresis produk disintesis dalam tumor ascites bebas sel
sistem. RANA digunakan untuk membuat setiap produk ditunjukkan. Bersama- migrasi dari
protein berlabel ditunjukkan pada margin angka. lisat retikulosit (Gambar 4). Profil elusi
adalah comi- cident sehubungan dengan 22 puncak. Semua retikulosit-diturunkan
puncak memiliki mitra di profil dari tumor ascites produk bebas sel. Tiga puncak (pecahan
41, 81, dan 84) Berasal dari produk sel bebas tumor asites, memang begitu tidak muncul
dalam profil reticulocyte. Asal mula ini adalah tidak jelas, tetapi mereka mungkin
berhubungan dengan inisiasi diproses peptida. Secara teoritis 17 peptida
tryptic mengandung leusin bisa berasal dari a dan, subunit kelinci globin. Kromatografi dari
globin tripsin-diperlakukan berasal Dari lisat reticulocyte kelinci menghasilkan 23 puncak,
termasuk 4-6 yang kecil. Tingkat variasi antara theo- produk dan hasil yang diharapkan
secara retik konsisten dengan tindakan tripsin yang berkepanjangan, diduga terkontaminasi
sejumlah kecil aktivitas chymotryptic, pada relatif kecil jumlah substrat Karakterisasi mRNA
dimurnikan Globin. RNA dielusi dari oligo (dT) kolom -cellulose di terendah ionik kekuatan
(peak C) dianalisis dengan sukrosa gradien centrifu- gation (Gambar 5). Ini memecahkan
materi menjadi empat UV- menyerap puncak dengan St ,, 20 nilai-nilai yang sesuai dengan
sekitar 9, 12, 18, dan 28. ini fraksi gradien diuji karena mereka kemampuan untuk
mengarahkan penggabungan [3H] leusin menjadi protein pada sistem sel-
bebas tumor ascites. Kegiatan utama tinggal dalam fraksi 9S, tapi bahu kecil dan tambahan
puncak aktivitas mRNA muncul di bawah, tapi tidak tepat sesuai dengan, yang 12S dan
18S daerah juga. Keduanya fraksi atas puncak 9S dikumpulkan, terkonsentrasi, dan,
bersama-sama dengan fraksi RNA retikulosit lainnya, dikenakan
poliakrilamida gel elektroforesis (Gbr. 6). Reticulocyte polysomal RNA, sebelum pemurnian,
(Gambar. 6, gel 2) terdiri sebagian besar RNA ribosom. 9S RNA tidak muncul sebagai Band
patri dalam materi ini, mungkin karena fakta bahwa globin mRNA
merupakan tetapi sebagian kecil dari total Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69 (1972)

Halaman 4

Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69 (1972) 500 400 Saya 300 E 0 _ - 200 -fi RI mak ~ Oligo (dT) -
Cellulose Chromatography 1411 500 400 _ 300; B 200 3 saya o 70 80 90 100 110 120 130
140 150 160 FRAKSI NOMOR ARA. 4. kromatografi kation-tukar protein yang berasal dari
peptida tryptic disintesis in vitro. (0 0), [3H] leusin di pro duct disintesis
dalam menanggapi RNA dimurnikan pada oligo (dT) -cellulose (peak C, Gambar 1.)
dalam sistem sel-bebas tumor asites; (0-O), [14C] leusin dalam produk disintesis secara
endogen pada polysomes kelinci retikulosit. RNA. Sebaliknya, RNA ditahan oleh kolom dan
dielusi pada termurah kekuatan ion (peak C) mengandung komponen utama yang sesuai
dengan RNA 9S (Gambar 6, gel 4). RNA yang tidak ditahan oleh oligo yang (dT) kolom -
cellulose (Gambar 6, gel 3) terdiri dari 18 dan 28S, yang terakhir
hampir memasuki fraksi 4% poliakrilamida gel.Two dari RNA
diserap yang sukrosa fractionatedby lanjut sentrifugasi gradien (Gambar.
5) ditunjukkan pada Gambar. 6, gel 1 dan 5. Bahan 9S (gel 5) bermigrasi sebagai satu homo-
komponen geneous dan dapat dibandingkan dengan bahan 18S (gel
1). Bahan 9S digunakan sebagai template dalam penelitian lain diarahkan sintesis DNA
complementaryto kelinci globin mRNA (18). DISKUSI Dua kesulitan utama telah rumit isolasi
gen spesifik mRNAin organisme yang lebih tinggi. Yang pertama dari ini
telah kurangnya cukup sensitif, assay fungsional untuk 9S 12S 18S 2BS R saya ZLI LO 9 ' 5.0 0
0 z 1 0 ' 2.5 : 0 ~~~~~~ 0,50 0,25 mRNA spesifik Kedua telah menjadi kesulitan yang terlibat
dalam membebaskan sebagian kecil RNA yang merupakan Pesan gen spesifik dari sebagian
besar utuh dan sebagian RNA ribosom
terdegradasi. Untuk mengatasi kesulitan pertama, kita telah menggunakan sistem sel-
bebas protein sintesis berasal dari ascites sel-sel tumor (10). Di bawah kondisi kami
menjelaskan, sistem ini baik alat sensitif dan nyaman
untuk mendeteksi sesedikit 0,25 pmol dari dimurnikan mRNA (Gambar. 5)
dan pameran sejumlah diabaikan asam amino endogen penggabungan
(Gambar. 3). Selanjutnya, sistem tampaknya menerjemahkan baik virus dan tuan rumah
mRNA, menghasilkan otentik produk translation (10, 14, 19-23), (Gambar. 3 dan 4). Masalah
isolasi sejumlah kecil tertentu mRNA dari sebagian besar RNA selular kurang mudah diatasi.
Namun, pengamatan yang beberapa mRNA diduga adalah 2 I @ .... 4 3 g >! * Pa ,; '' MU, r
begitu ...: S ': ::.; :; ' SEBUAH: .: '. :: .. 3 4 5 _ _ gg ........ -NEg .: g ...... . sebagai _ - <. .... 9R w
Sk. ... ... D 0 0 3 0 l 0 t 10 20 30 40 Puncak NOMOR FRACTION ARA. 5. Protein aktivitas
sintetis RINA dimurnikan pada oligo (dT) -cellulose setelah sukrosa gradien sentrifugasi. (0
0), [3H] leusin dimasukkan dalam menanggapi alikuot 0,005-ml masing-masing fraksi
dalam sistem bebas sel tumor asites; (0 0), A 260 / RNL. ARA. 6. Polyacrylamide (4% 7
,,) elektroforesis gel dari reticulo- fraksi RNA cyte. 1, 18S RNA (fraksi 21-22, Gambar 5); 2,
total retikulosit polisomal RNA; 3, RNA tidak dipertahankan oleh
globin mlRNA dimurnikan pada oligo (dT) -cellulose (peak C, Gambar 1.);
5, 9S globin mRNA (pecahan 10, 11, Gambar. 5). saya 18S

Halaman 5

1412 Biokimia: Aviv dan Leder kaya poli (A) urutan (1-4, 9) dan bahwa properti ini dapat
digunakan untuk mendeteksi mRNA semacam itu cukup alami sug- gested kegunaannya
untuk tujuan preparatif juga (4, 7, 8). Dalam hal ini, oligo (dT) -cellulose column
chromatography memiliki kelebihan tertentu. Oligodeoxynucleotide adalah chemi- stabil
dan bisa digunakan berulang kali setelah perawatan alkali. Kolom ini memiliki kapasitas dan
kemampuan yang relatif tinggi digunakan untuk mengisolasi beberapa miligram poli (A) -
mRNA dari beberapa ratus miligram RNA polisomal mentah. Dengan tindakan pencegahan
yang tepat untuk menghindari kontaminasi nuklease, Prosedur bisa dilakukan pada suhu
kamar. Selain itu, Produk yang terisolasi dalam kondisi ini tetap berfungsi aktivitas dan
mudah diterapkan pada gradien sukrosa kecil untuk langkah pemurnian lebih lanjut dan
sangat berbeda. Sementara itu tidak jelas bahwa semua mRNA mamalia mengandung poli
(A) - regionls, masuk akal untuk mengharapkan agar prosedur ini dilakukan
membuktikan umumnya berguna dalam isolasi berbagai mam- mRNA malia Kami) penelitian
reliminer telah indi- berdedikasi kegunaannya dalam penyusunan unggas dan manusia
globia mRNA. Perbaikan lebih lanjut dari kromatografi yang Prosedur yang melibatkan suhu
dan ion gradien kekuatan Elusi juga bisa bermanfaat. Selama penelitian ini, ada beberapa
pengamatan menarik muncul. Sentrifugasi sukrosa gradien oligo (dT) - I)
urified globin mRNA mengungkapkan (16-17S) puncak berat RNA dengan aktivitas
messenger (Gambar 5). Dalam pengalaman- awal meints, kita menemukan
bahwa protein disintesis dengan mRNA ini identik dengan yang disintesis di hadapan RNA
9S. Meskipun dimungkinkan bahwa bahan ini merupakan gabungan bentuk RNA 9S, juga
mungkin bahwa itu merupakan tinggi bentuk molekul dari pesan globin. Maroun,
Driscoll dan Nardone (24) baru-baru ini menunjukkan cepat label, 17S RNA spesies yang
terakumulasi selama burung kelaparan reticulocyte. Eksperimen mereka menunjukkan hal
ini RNA bukan merupakan bentuk gabungan dari 9S RNA dan bahwa, pada Kelegaan
kelaparan, spesies ini bertindak sebagai pendahulu 9S RNA. Bukti kami
untuk aktivitas biologis yang mirip RNA spesies dalam kelinci menunjukkan
bahwa globin kelinci mRNA mungkin ada dalam bentuk berat molekul tinggi yang relevan
dengan metabolisme mRNA. Selain itu, kami telah menemukan bahwa kurang
dari 5% dari produk disintesis di hadapan globin dimurnikan mRNA terdiri
dari discretepolypeptides dari berat molekul kurang dari thatof kelinci globin
(Gambar. 3). Meskipun dimungkinkan bahwa protein ini
tidak terkait dengan globin, tampaknya lebih mungkin bahwa mereka repre-
mengirim produk degradasi diskrit dari protein globin atau prematur
dihentikan rantai globin yang baru lahir. Viewis ini konsisten dengan fakta
bahwa kita belum melihat protein minor dari berat molekul lebih besar
dari globin saat menggunakan
mRNA dimurnikan dari sumber mamalia atau burung. Selain itu, Gesteland (komunikasi
pribadi) sering mengamati diskrit, produk penghentian prematur selama trans- tersebut lasi
mRNA fag pada sistem bakteri. Seperti prematur penghentian mungkin timbul sebagai
akibat dari perpecahan diskrit di mRNA selama protein reaksi sintetik, atau dari
penangkapan di kodon tertentu dalam mRNA globin. Dalam setiap kasus, batas yang
sangat terbatas untuk yang ini terjadi dan diskrit sifat produk utama
terbentuk, menunjukkan bahwa tRNA- Sistem tumor asites tergantung dalam
hubungannya dengan dimurnikan globin mRNA harus berguna untuk menguji potensi tRNA
penekan dari kodon terminasi mamalia. Kami berterima kasih l) r. Peter Gilham nasihatnya
dalam persiapan oligo (dT) -cellulose, Barbara Loyd untuk bantuan yang berharga di studi
ini, dan Catherine Kunkle untuk bantuan herexpert di penyusunan naskah ini. 1. Lim, L. &
Canellakis, ES (1970) Sifat 227, 710-712. 2. D) Arnell, JE, Wall, R. & Tushinski, 1t. J. (1971)
Proc. Nat. Sebuah cad. Sci. USA 68, 1321-1325. : 3. Edmonds, MI., Vaughan, AI. H., Jr &
Nakazato, H. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 1336-1340. 4. Lee, S. Y., 'Mendecki, J. &
Brawerman, G1. (1971) Proc. Nat. Sebuah cad. Sci. USA 68, 1.331-133,5). 5. Darnell, JE,
Philipson, L., Wall, R. & Adesnik, AI. (1971) Ilmu 174, 507-510. 6. Edmonds, Al. &
Caramela, MI. G. (1969) J. Riol. Chem.244, 1314-1324. 7. Kates, J. (1970) Cold
Spring Harbor Symp. Bergalah. Biol. 35, 743-752. 8. Brawerman, GJ., Mendecki, J. & Lee, SY
(1972) Biochem- istry 11, 637-641. 9. Bnrr, H. & Lingrel, JB (1971) Nature New Biol. 233, 41-
43. 10. Aviv, H., Boime, I. & Leder, P. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 2303-2307.
11. Gilham, P. (1964) J. Amer. Cheyl. Soc. 86, 4982-4985. 12. Evans, M. J. & Lingrel, JB (1969)
Biokimia 8, 3000 3005. 13. Adler, AJ & Kaya, A. (1962) J. Amnter. Chem. Soc. 84, 3977- 3979.
14. Boime, I., Aviv, H. & Leder, P. (1971) Biochen. Biofis. Res. Komunal 45, 788-795.
15. Maizel, JV (1971) dalam Metode dalam Virologi, eds. MIaramo- Rosch, K. dan
Koprowski, H. (Academic Press, New York), 5, hal. 180-247. 16. Lane, C. D., MIarbaix, J. &
Gordon, B. (1971) J. Mol. Biol. 61, 73-91. 17. Merak, A. C. & D) Ingman, C. W. (1968)
Biokimia, 7, 668-674. 18. Ross, J., Aviv, H., Scolnick, E. & Leder, P. (1972) Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 69, 264-268. 19. MIathews, MI. B. & Korner, A. (1970)
Eur. J. Biochem. 17, 328-343. 20. Smith, AE, Marcker, KA & Mathews, MI. B. (1970) Nature
225, 184-187. 2 1. Kerr, I. MI. & AMartin, E. M. (1971) J. Viorl. 7, 438-447. 22. Housman, D.,
Pemberton, R. & Taber, R. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 2716-2719.
23. Miathews, MB, Osborn, MI. & Lingrel, JB (1971) Alam Baru Biol. 233, 206-209. 24. -
Maroun, L. E., Driscoll, BF & Nardone, R. M \. (1971) Alam Biol Baru. 231, 270-271.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69 (1972)