LAPORAN RESMI PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZYM

MENGUKUR AKTIVITAS ENZIM α – AMILASE

OLEH :

NOVIANTI BARLIN / 31160017

PROGRAM STUDI BIOLOGI

FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
YOGYAKARTA
2018
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan memiliki peran
sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme. Katalisator
ini sendiri berfungsi untuk mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi
tersebut tidak berubah. Enzim juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Salah satu
lingkungan yang berpengaruh terhadap kerja enzim adalah pH. pH optimal enzim
adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis
enzim mengalami inaktivasi.
Enzim yang digunakan pada praktikum ini yaitu enzim α-amilase. Enzim α-
amilase merupakan salah satu jenis enzim yang banyak di gunakan pada skala
industri, dimana enzim α-amilase ini mempunyai kemampuan dalam menghidrolisis
pati pada tahap likuifasi untuk menghasilkan produk akhir berupa gula. Kemampuan
enzim dalam memproduksi gula dipengaruhi terutama oleh kemampuan enzim
sebagai katalis proses produksi, yang dapat dikuantifikasi melalui pengujian aktivitas
enzim. Pengukuran aktivitas enzim α-amilase sangat penting untuk mengetahui
kemampuan hidrolisis enzim α-amilase. Dalam hal ini terdapat banyak faktor yang
mempengaruhi aktivitas enzim. Oleh sebab itu, pengujian aktivitas enzim sebaiknya
dilakukan pada kondisi optimum sehingga hasil kuantifikasi yang didapatkan lebih
akurat. Adapun larutan yang digunakan pada praktikum ini yaitu larutan non
termostable.

B. Tujuan
1. Mengetahui aktivitas enzim α-amilase berdasarkan sisa substrat dan prosuk
glukosa yang terbentuk.
2. Mengetahui produktivitas enzim α-amilase berdasarkan derajat konversi substrat
menjadi produk.
 BAB II

LANDASAN TEORI

Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan memiliki peran sebagai
katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme. Katalisator ini sendiri
berfungsi untuk mempercepat reaksi tetapi pada hasil reaksi, substansi tersebut tidak berubah.
Enzim juga dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Salah satu lingkungan yang berpengaruh
terhadap kerja enzim adalah pH. pH optimal enzim adalah sekitar pH 7 (netral) dan jika
medium menjadi sangat asam atau sangat alkalis enzim mengalami inaktivasi (Gaman &
Sherrington, 1994).

Enzim yang banyak terdapat pada pati adalah enzim 𝛼-amilase. Enzim 𝛼-amilase
merupakan enzim yang mampu menghidrolisis glikogen dan pati melalui pemotongan
internal ikatan 𝛼-1,4-glikosida secara acak, dan kemudian akan menghasilkan maltose dan
glukosa. Konsentrasi enzim akan mempengaruhi jumlah substrat yang berhubungan dengan
enzim. Lama sakarifikasi akan mempengaruhi lama dan singkatnya suatu hubungan antara
enzim dengan substratnya (Yunianta, 2010).

Pengukuran aktivitas enzim 𝛼-amilase dan glukanase dilakukan berdasarkan pada

kemampuan enzim tersebut dalam menguraikan substrat (polisakarida) menjadi
monosakarida dalam benuk gula pereduksi pada waktu tertentu. Akurasi pengukuran dapat
dicapai bila proses deteksi gula pereduksi berlangsung dalam keadaan optimum. Sehingga,
untuk menentukan aktivitas amilase dan glukanase diperlukan reagen yang bisa menjaga
kestabilan produk hidrolisisnya. Sedangkan aktivitas enzim dipengaruhi oleh faktor
lingkungan seperti tingkat keasaman, konsentrasi substrat, suhu dan oksigen terlarut
(Mukataka et al. 1988).

Larutan buffer adalah larutan yang tahan terhadap perubahan pH dengan penambahan
asam atau basa. Larutan tersebut digunakan dalam berbagai percobaan biokimia dimana
dibutuhkan pH yang terkontrol dan tepat ( Fardiaz, 1992 ). Larutan buffer bermanfaat untuk
melarutkan kotoran yang masih ada di dalam endapan enzim tersebut serta mencegah enzim
dari denaturasi dan kehilangan fungsi biologisnya (Fox, 1991). Buffer dapat mempertahankan
kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan mencegah agar enzim tidak
mengalami inaktivasi (Winarno, 1995 ).
 DNS merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula reduksi maupun
komponen pereduksi lainnya untuk membentuk 3-amino-5-nitrosalicylic acid, suatu senyawa
yang mampu menyerap dengan kuat radiasi gelombang elektromagnetik pada 540
nm. Semakin banyak komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin
banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang terbentuk dan mengakibatkan
serapan semakin tinggi (Sazciet.al. 1986)
 BAB III

METODOLOGI

A. Alat
- Tabung reaksi - Penangas air
- Water bath - Penjepit
- Pipet ukur - Rak tabung
- Kuvet - Kelereng
- Spectrofotometer - Tabung sentrifuse
- Kompor - Alat vortex
- Tip - Mikropipet
- Pro pipet

B. Bahan
1. Larutan enzim α-amylase non thermostable 0,25 %
2. Buffer substrat pH 7 dengan konsentrasi starch 0,4%
3. Buffer substrat pH 7 dengan konsentrasi starch 1%
4. Buffer substrat pH 7 dengan konsentrasi starch 0,005%
5. Reagen warna
6. Reagen DNSA
7. Larutan glukosa 0,01 %
8. Akuades
C. Cara Kerja
A. Menguji aktivitas enzim berdasarkan sisa substrat pati yang terdegradasi
oleh enzim α-amylase

Diambil 10 ml buffer substrat pati dengan konsentrasi 0.01 % pada pH 7

Diinkubasikan pada water bath pada suhu 37 oC selama 5 menit

Ditambahkan 1 ml enzim α-amylase non termostabil dan dihomogenkan

menggunakan vorteks

Diinkubasi pada water bath pada suhu 37 oC selama 5 menit

Ditambahkan 0.5 ml reagen warna, kemudian ditambahkan aquades sampai volume

100 ml

Dilakukan pengukuran OD menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

620 nm

Sebagai blangko : lakukan prosedur 1-6 dengan mengganti 1 ml enzim dengan 1 ml

aquades

Untuk menyetarakan spektrofotometer, digunakan larutan yang berisi 0.5 ml reagen

warna ditambah dengan 9,5 ml akuades. Larutan ini berfungsi sebagai kontrol

Dilakukan percobaan tersebut dengan digunakan 5 kali ulangan

Dicatat hasil pengamatan OD dan dihitung aktivitas enzim α-amylase dengan format
table yang telah tersedia

Aktivitas enzim α-amylase dihitung berdasarkan sisa substrat pati setelah diperlakukan
dengan enzim dengan digunakan rumus sebagai berikut :
𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑂𝐷 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡
𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚 𝛼 − 𝑎𝑚𝑦𝑙𝑎𝑠𝑒 ∶ <10 X P Unit/100 ml
𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

Ket :

A blangko : Absorbansi blangko

A Sampel : Absorbans Sampel

P : Faktor pengenceran

1 Unit Enzim : banyaknya enzim yang menghidrolisa 0.5 gr pati dalam waktu 15 menit
pada suhu 37 oC pH 7

Sampel : perlakuan substrat dengan penambahan enzim

Blangko : Perlakuan tanpa substrat dan tanpa enzim

Kontrol : Perlakuan dengan substrat tetapi tanpa penambahan enzim

B. Menguji Aktivitas Enzim Berdasarkan Produk Gula yang Terbentuk akibat

Degradasi Substrat Pati oleh Enzim α-amilase
Diambil 10 ml buffer substrat pati dengan konsentrasi 0,05 % pada pH 7

Inkubasi pada water bath pada suhu 37 ºC selama 5 menit

Tambahkan 1 ml enzim α-amilase dan homogenkan menggunakan vorteks

Inkubasi pada water bath pada suhu 37 ºC selama 15 menit

 Larutan yang telah diinkubasi diambil 2,5 ml dan ditambahkan 1 ml reagen DNSA

Dipanaskan pada suhu 100oC selama 10 menit, setelah itu di dinginkan

Dilakukan pengukuran OD menggunakan spektofotometer pada panjang gelombang

540 nm

Lakukan prosedur 1-6 sebagai blanko dengan mengganti substrat dengan aquades

Hitung jumlah gula yang terbentuk dengan cara mengkalibrasi nilai OD dengan kurva
standar glukosa dengan menggunakan persamaan regresi linear

Nyatakan aktivitas enzim α-amilase sebagai ∆P/∆r, yaitu dengan menentukan jumlah
produk glukosa dalam  mol / menit

Buat kurva standar glukosa dan carilah korelasi antara [glukosa] dalam  mol dan
nilai OD 540 nm dengan program regresi linear sehingga didapatkan persamaan Y = a
+ bX

Gunakan persamaan tersebut dan masukin nilai OD dari sampel yang diuji sehingga
didapatkan nilai produk gula yang terbentuk
 Hitung aktivitas enzim dalam  mol / menit

Catatan:

1. Kurva standar yang baik memiliki nilai korelasi atau R = 0,99. Nilai R yang baik
menunjukan hubungan yang valid antara nilai OD dan konsentrasi glukosa. Hasil
perhitungan persamaan kurva standar glukosa:

Y = a + bX

2. Berdasarkan persamaan tersebut, dilakukan perhitungan jumlah produk glukosa

yang terbentuk (dinyatakan sebagai X) dengan perhitungan sebagai berikut:

....................  ....................
X (  mol glukosa)   ................. (faktor pengencera n)
..............................
 .............  mol Glukosa yang terbentuk dalam waktu
........... menit pada suhu 37 C

3. Hasil perhitungan aktivitas enzim berdasarkan jumlah produk glukosa persatuan

waktu (∆P/∆t) adalah:

Aktivitas enzim (  mol / menit)  .................

Pembuatan Kurva Standar

Disiapkan 10 tabung reaksi

Dilakukan pengenceran larutan glukosa 1 – 10 ml pada 10 tabung reaksi dan

ditambhakan aquades

Dari tiap tabung kemudian diambil masing-masing 2,5 ml

 Ditambahkan reagen DNSA 0,2 ml = 200 μm lalu di vortex

Dipanaskan di penangas air selama 10 menit

Didinginkan

OD diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm

Nilai OD yang didapat, di masukkan ke dalam kurva standar untuk mendapatkan

persamaan Y = a + bX.

E. Menghitung jumlah produk glukosa hasil degradasi pati oleh enzim α-

amylase

Dimasukin 10 ml larutan pati 1% ke dalam 2 tabung reaksi

Ditambahkan 1 ml larutan enzim amylase

Dimasukin 10 ml larutan pati 1% ke dalam 2 tabung reaksi

Diinkubasi pada waterbath pada suhu 60oC selama 15 menit

Diambil 5 ml larutan diatas dan ditambahkan 2 ml larutan DNSA

 Dipanaskan pada penangas air yang mendidih selama 5 menit

Didinginkan larutan tersebut, kemudian diamatti pada spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm

Untuk standarisasi spektrofotometer, digunakan larutan blanko yang berisi 5 ml

akuades ditambah dengan dengan 2 ml DNSA

Dipanaskan mendidih selama 5 menit

Dilakukan pengenceran : diambil masing-masing 2 ml dan ditambahkan 8 ml akuades

Dihitung kadar glukosa hasil hidrolisa pati oleh enzim α-amylase dengan menggunakan
kurva standar

Y = 0,004 + 2,1568 X

Y (OD)−0,004
X ( % glukosa ) = x 𝑃 (𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛)
2,1568

= %Glukosa
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Menguji aktivitas enzim berdasarkan sisa substrat pati yang terdegradasi oleh
enzim α-amylase

Tabung OD Kontrol OD Sampel Aktifitas enzim α- amylase

1 0,477 0,001
0,477 − 0,001
= 𝟗, 𝟗𝟕
0,477
2 0,477 -0,002
0,477 + 0,002
= 𝟏𝟎, 𝟎𝟒𝟏
0,477

Pada praktikum in dilakukan percobaan dan 1 kali pengulangan dengan

menggunakan 2 perlakuan, yaitu kontrol dan blanko. Pada kontrol perlakuan dengan
substrat tanpa enzim, sedangkan pada blanko yaitu perlakuan tanpa penambahan
substrat dan enzim. Reagen yang digunakan yaitu reagen warna. Berdasarkan hasil
data yang telah diperoleh, hasil OD sampel tersebut menunjukan nilai yang lebih kecil
di banding dengan nilai pada OD kontrol.

Dari hasil nilai OD yang diperoleh, maka aktivitas enzimnya dapat diukur
dalam hal mendegradasi pati. Aktivitas enzim α- amylase pada tabung 1 yaitu 9,97
U/100 ml, dan pada tabung pengulangan di dapat hasil sebesar 1,0041 U/100 ml. Sisa
substrat pati menunjukkan bahwa sisa pati tidak terdegradasi oleh enzim α- amylase.
Apabila aktivitas enzim ini bekerja dengan baik maka larutan akan semakin bening,
karena telah terhidrolisis secara sempurna, sedangkan apabila enzim ini kurang
bekerja secara maksimal, maka larutan akan berwarna lebih gelap, karena tidak dapat
terhidrolisis secara sempurna.

Dari hasil yang di dapatkan dimana aktivitas enzim amilase meningkat, bisa
dimungkinkan karena struktur molekul enzim tidak mengalami denaturasi, sisi aktif
 enzim sesuai dengan substratnya. Selain itu struktur molekul dari substratpun tidak
mengalami hambatan untuk mencapai lokasi aktif enzim.

Fungsi dari penambahan larutan buffer yaitu untuk melarutkan kotoran yang
masih terikut dala endapan enzim serta mencegah enzim dari denaturasi. Serta buffer
dapat mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan
mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi. Enzim amylase yang diinkubasi
pada waterbath dengan suhu 37oC akan mengalami perubahan warna. Hal ini
disebabkan karena enzim memiliki suhu optimal, sehingga pada suhu ini aktivitas
enzim berjalan maksimal yang mengakibatkan terhidrolisisnya amilum. Rata-rata
aktivitas enzim yang didapati dari kedua percobaan adalah sebesar 10,0055 U/100 ml.

B. Menguji Aktivitas Enzim Berdasarkan Produk Gula yang Terbentuk akibat

Degradasi Substrat Pati oleh Enzim α-amilase
1. Kurva Standar
Konsentrasi OD
glukosa (ml) 540 nm (Y)

0 0Å

0,01 0,205 Å

0,02 0,465 Å

0,04 1,254 Å

0,05 1,584 Å

0,06 1,961 Å

0,07 2,195 Å

0,1 3,376 Å
 Kurva Standar
4
3.5 y = 34.2369x - 0,1179
3 R² = 0,9959
2.5
Nilai OD

2
1.5
1
0.5
0
-0.5 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
Konsentrasi Glukosa

Berdasarkan kurva standar glukosa di atas terlihat bahwa nilai persamaan y =

34.2369x - 0,1179, R² = 0,9959 hampir membentuk grafik yang linear. Data
absorbansi glukosa yang terbentuk yang dihasilkan dari hidrolisis pati oleh enzim 𝛼-
amilase, data terlihat bahwa semakin tinggi konsentarsi glikosa maka semakin besar
juga nilai OD yag di dapatkan.

Produk Glukosa (µ
Tabung Nilai OD 540 nm mol) Aktivitas enzim

1 1,683 0,0526 = 5,26 % 0,00351

2 1,555 0,0488 = 4,88 % 0,00325

Pada percobaan ini dilakukan untuk menguji aktivitas enzim berdasarkan

produk gula yang terbentuk akibat degradasi substrat protein oleh enzim 𝛼-amilase.
Penambahan larutan buffer ini berfungsi untuk melarutkan kotoran yang masih terikut
dala endapan enzim serta mencegah enzim dari denaturasi. Serta buffer dapat
mempertahankan kondisi enzim presipitat agar tidak terjadi perubahan pH dan
mencegah agar enzim tidak mengalami inaktivasi. Kemudian dilakukan inkubasi pada
suhu 37oC, dimana suhu tersebut merupakan suhu optimum enzim amilase selama
kurun waktu 15 menit. Karena pengukuran aktivitas enzim dilakukan dalam rentang
waktu paling awal pada maa inkubasi optimum. Sehingga jika masa inkubasi terlalu
lama maka sebagian gula pereduksi tersebut berubah menjadi senyawa asam dan tidak
dapat terdeteksi. Akibatnya hasil hidrolisis enzim yang terbentuk tidak dapat terukur
 dengan jelas. Suhu yang digunakan untuk mendidihkan hasil inkubasi dengan
penambhan reagen DNSA yaitu pada suhu 100oC. Sesuai dengan teori (Miller, 1959),
agar proses reduksi DNS terhadap gula pereduksi berjalan cepat dan sempurna maka
diperlukan pemanasan dengan suhu 100oC selama 15 menit, sehingga di peroleh
pembentukan warna yang lebih intensif.
Dalam percobaan ini mengalami hasil penurunan aktivitas enzim Penurunan
aktivitas pada suhu tinggi terjadi karena struktur molekul enzim tersebut mengalami
proses denaturasi. Akibatnya sisi aktif enzim tidak sesuai lagi dengan substratnya.
Selain itu, struktur molekul dari substrat pun dapat mengalami perubahan konformasi,
sehingga mengalami hambatan untuk mencapai lokasi aktif enzim (Lehninger, 1993).
Hal lain yang menyebabkan penurunan aktivitas diduga karena ekskresi enzim
protease yang dapat menyebabkan autolisis protein enzim, sehingga afinitasnya
terhadap substrat mengalami penurunan dan mungkin pada akhirnya hilang. Niali
rata-rat aktivitas enzim pada percobaan ini yaitu sebesar 0,00676.

C. Menghitung Jumlah Produk Glukosa Hasil Degradasi pati oleh Enzim α-amylase

Kadar Glukosa
Tabung OD Sampel (x = % glukosa)

1 1,432 A 4,53 %
2 1,456 A 4,597 %

Percobaan terakhir yang diakukan yaiut dengan menghitung jumlah produk

glikosa hasil degradasi pati oleh enzim α-amylase. Pada percobaan ini hasil kadar
glukosa yang di dapatkan pada tabung 1 4,53% kadar glukosa dan meningkat pada
tabung pengulangan menjadi 4,597% kadar glukosa. Reagen yang digunakan pada
praktikum ini adalah reagen DNSA. Reagen DNS merupakan senyawa yang mampu
menyerap pada gelombang elektromagnetik 540 nm. Berdasarkan data absorbansi
glukosa yang terbentuk yang dihasilkan dari hidrolisis pati oleh enzim α-amylase.

Reaksi dengan DNS yang terjadi merupakan reaksi redoks pada gugus
aldehid gula dan teroksidasi menjadi gugus karboksil. Sementara itu DNS sebagai
oksidator akan tereduksi membentuk 3-amino dan 5- nitrosalicylic acid. Reaksi ini
berjalan dalam suasana basa. Bila terdapat gula reduksi pada sampel, maka larutan
DNS yang awalnya berwarna kuning akan bereaksi dengan gula reduksi sehingga
menimbulkan warna jingga kemerahan (Sastrohamidjojo, 2005).

Berdasarkan data, semua larutan sampel (kecuali blanko) berwarna cokelat

kemerahan dan nilai absorbansinya besar. Hal ini dapat sisimpulkan bahwa hampir
semua pati yang terkandung dalam lautan belum sepenuhnyaterhidrolisis oleh enzim
α-amylase menjadi produk glukosa.

Perbedaan pengukuran aktivitas enzim berdasarkan sisa substrat pati dengan

pengukuran aktivitas enzim berdasarkan produk glukosa yang terbentuk adalah hasil
dari sisa substrat pati merupakan hasil yang belum terdegradasi oleh enzim,
sedangakan aktivitas enzim berdasar produk glukosa yang terbentuk adalah jumlah
produk menentukan jumlah enzim yang aktif bekerja mendegradasi substrat pati.
 BAB V
KESIMPULAN

Dari hasil praktikum yang telah didapati, aktivitas enzim 𝛼-amilase dapat diamati dari
sisa substrat pati yang belum terdegradasi ataupun dari hasil produk degradasi yang
terbentuk. Produktivitas enzim untuk membentuk produk dapat diukur dengan derajat
konversi berdasarkan hasil yang didapati oleh aktivitas enzim tersebut. Dari percobaan
tersebut, didapati kemampuan amilolitik enzim 𝛼-amilase sebesar 10,0055 U/100 ml,
0,00676.
 DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka

Utama
Fox, P.F. 1991. Food Anzymology. Elsevier Applied Science. London. Vol : 2.
Gaman, P.M & K.B. Sherrington. 1994. Pengantar Ilmu Pangan, Nutrisi dan
Mikrobiologi. Universitas Gadjah Mada press. Yogyakarta.
Lehninger AL, 1993. Dasar-Dasar Biokimia. Ed. ke-3. Terjemahan. Maggy
Thenawidjaja. Erlangga, Jakarta.
Miller GL, 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing
sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.
Mukataka SN, Kobayashi, Sato S and Takashi J, 1988. Variation in cellulose
constituting componen from Tricoderma reesei with agitation intensity. J.
Biotech. Bioeng. 32: 760-763.
Sastrohamidjojo, Hardjono. 2005. Kimia Organic, Sterokimia, Lemak, dan
Protein. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Sazci A. Radforda A. & Erenler K. 1986. Detection of Cellulolytic Fungi by Using
Congo red as an Indicator: a Comparative Study with The
Dinitrosalicyclic Acid Reagent Method. Journal of Applied Bacteriology
61. 559-562.
Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia: Protein, Enzim, dan Asam Nukleat.
InstitutTeknologi Bandung. Bandung.
Winarno, F.G. 1995. Enzim Pangan. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.