Total RNA disintesis menjadi cDNA melalui proses reverse transcription dengan menggunakan primer

hexamer secara random yang membentuk first-strand cDNA terlebih dahulu. Kemudian dilanjutkan
dengan sintesis second-strand dalam reaksi yang mengandung buffer, dNTP, RNAse H, dan polymerase I.
Kemudian dimurnikan dengan kit ekstraksi QIAQuixk PCR (Qiagen, Jerman), dan dielusi dengan EB buffer
untuk proses end repairing dan penambahan “A” (Adenin).

Selanjutnya, fragmen-fragmen pendek tersebut diligasikan pada adaptor sequencing Illumina . Untuk
fragmen DNA yang panjangnya berukuran 200 bp dimurnikan dengan gel-purified dan diamplifikasi
melalui PCR. Hasil amplifikasi berupa pustaka (library) disekuens melalui paired-end sequencing
menggunakan Illumina HiSeqTM 2000.

Sintesis cDNA dengan menggunakan GoScript™ Reverse Transcription System

Sintesis cDNA dengan menggunakan GoScript™ Reverse Transcription System dilakukan dalam bentuk
first-strand cDNA. Berdasarkan prosedur, 5 μg total RNA atau 500ng pada poly(A) RNA diubah menjadi
first-strand cDNA.

1. Campurkan dan sentrifus secara cepat beberapa komponen reverse transcription mix sebelum
digunakan dengan rumus sebagai berikut :
Komponen Volume
RNA Sampel (hingga 5 μg/reaksi) X μl
Primer [Oligo(dT)15] (hingga 0,5 μg/reaksi) X μl
Random Primer (0,5 μg/reaksi)
spesifik primer-Gen (10-20pmol/reaction)]
Nuclease-Free Water X μl
Volume Akhir 5 μl
2. Panaskan pada heat block pada suhu 70oC selama 5 menit. Segera dinginkan dalam air dingin
sedikitnya 5 menit. Sentrifus 10 selama detik dengan microcentrifuge. Simpan dalam es sampai
ditambahkan reverse transcription mix.
3. Siapkan pereaksi pada reverse transcription mix, sampai 15 μl untuk reaksi cDNA. Kombinasikan
dalam es dengan beberapa bahan dengan komposisi sebagai berikut :
Komponen Volume
GoScript™ 5X Reaction Buffer 4,0 μl
1
MgCl2 (dengan konsentrasi akhir 1.5–5.0mM) 1.2–6.4 μl
PCR Nucleotide Mix (dengan konsentrasi akhir 0.5mM setiap dNTP)2 1.0 μl
Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor (optional) 20 units
GoScript™ Reverse Transcriptase 1.0 μl
Nuclease-Free Water (hingga 15μl) X μl
Volume Akhir 15 μl
1 2+
Konsentrasi Mg seharusnya dioptimasi pada 1,5-5,0 mM (MgCl2 disediakan 25 mM).
2
Jika diinginkan penggabungan isotopik dan nonisotopik untuk sintesis monitoring first-strand
cDNA, α[32P]-dCTP or modifikasi nukleotida lain yang memungkinkan dilengkapi dalam PCR
Nucleotide Mix.
4. Kombinasikan 15 μl reverse transcription mix dengan 5 μl RNA dan mix primer.
5. Gunakan suhu 25 oC selama 5 menit untuk annealing.
 6. Untuk Extending (pemanjangan) gunakan suhu 42 oC selama 1 jam.
Reaksi dapat dihentikan pada poin ini untuk analisis cDNA atau mungkin dibekukan untuk waktu penyimpanan yang
lama.
7. Inaktivasi reverse transcriptase : Sebelum diproses menggunakan qPCR, inaktivasi enzim reverse
transcriptase dengan dipanaskan pada suhu 70oC selama 15 menit pada heat block.

Kuantifikasi Cdna Dengan qPCR

1. Kuantifikasi target spesifik dalam sampel yang terdilusi dan tidak terdilusi cDNA menggunakan
GoTaq®qPCR Master Mix.
2. Jika tidak, tambahkan sampel cDNA yang terdilusi sebagaimana ditentukan untuk optimalisasi
(sampai 20% pada volume reaksi atau 100 ng pada input RNA).