299

Clinica Chimica Acta, 101 (1980) 299-303

@ Elsevier / Utara-HollandBiomedical tekan

CCA 1268

PENENTUAN DARI Asam Urat DENGAN URICASEAND PEROKSIDASE

GTBSANDERS *, AJ PASMANand FJ HOEK

Departemen of Internal Medicine, Klinik Laboratorium Biokimia, Universitas Rumah Sakit

University of Amsterdam, Wilhelmina Gasthuis, Amsterdam (Belanda)
(ReceivedJune 29, 1979)

Ringkasan

Sebuah metode yang dapat diandalkan untuk penentuan asam urat dalam plasma
atau serum dijelaskan. Peroksidase hidrogen yang dikembangkan dalam reaksi uricase
digunakan, bersama dengan peroksidase, untuk kopling Dichlorophenol sulfonasi dan
4-aminoantipyine untuk pewarna merah. Perbedaan absorbansi pada 515 nm sebelum
dan sesudah penambahan uricase diukur. Komponen diuji untuk gangguan beberapa
memunculkan nilai-nilai palsu diturunkan.
Reagen yang murah dan koefisien penyerapan molekul tinggi dari pewarna merah
mengijinkan penggunaan volume sampel kecil.

pengantar

Sejumlah penentuan asam urat berdasarkan enzimatik Transforma-tion oleh uricase

telah dijelaskan. konversi yang dihasilkan dari asam urat menjadi allantoin baik dapat
dipantau secara langsung dengan mengukur perbedaan absor-Bance di 293 nm [l], atau
tidak langsung oleh sejumlah reaksi [2-51.
Pencarian untuk reaksi sederhana yang membutuhkan sejumlah kecil plasma
membawa kami ke sebuah sistem dijelaskan oleh Barham dan Trinder [61. Dalam sistem
ini 4-aminoanti-pyrine, sulfonasi 2,4dichlorophenol dan peroksidase digunakan untuk
menghalangi-mination hidrogen peroksida diproduksi dari glukosa oleh oksidase
glukosa.
Penerapan reaksi yang sama dengan pengukuran hidrogen peroksida yang
dihasilkan dari asam urat oleh uricase diuji dan optimalisasi sistem ini dilakukan.

Bahan dan metode

Reagen
Phosphatebuffer, pH 7.5,67 mmol / l; 4-aminoantipyrine, 49.3mmol / l buf-

* Kepada siapa korespondensi harus beaddressed.

300

fer (10 g / l); lobak kuda peroksidase (ca. 100 U / mg;. Boehringer kucing No.
128.066), 7,5 mg / ml penyangga; sulfonasi 2,4-Dichlorophenol, disiapkan sesuai-ing
ke Barham dan Trinder[61; uricase dari babi hati (ca. 9 U / mg; Boehringer kucing
Nomor 127.469); asam trikloroasetat (TCA), 183,5 mmol / l aqua dest. (30 g / l).

Colourreagent
Campur 75 ml penyangga, larutan 1 ml 4-aminoantipyrine, solusi peroksidase 1
ml dan 1 ml sulfonasi solusi Dichlorophenol. Reagen ini stabil selama 1 minggu
pada suhu 4 ° C.

Standardsolutions
Sebuah standar saham yang mengandung 6 mmol / l dibuat dengan melarutkan
100,87 mg asam urat dan 60 mg lithium karbonat di sekitar 50 ml aqua bidest. pada
60 ° C. Solusi ini didinginkan dan dibuat hingga volume 100 ml dengan aqua bidest.
Dengan pengenceran dengan aqua bidest. standar kerja disusun. Saham stan-dard
stabil selama dua dan standar kerja yang stabil selama satu bulan pada suhu 4 ° C.

metode
Campur ml plasma 0,1 dan 0,5 ml larutan TCA. Centrifuge 5 menit / 3000 rpm
(atau 2 min / 6000 rpm). Untuk sebuah cuvette mengandung 1,4 ml warna reagen
0,1 ml dari supematant deproteinized ditambahkan. Setelah pencampuran
absorbansi dibaca pada 515 nm (A,). Dalam waktu 15 menit setelah bacaan pertama
10, ul dari uricase solu-tion ditambahkan, isi kuvet yang dicampur lagi, dan setelah
30 menit inkubasi pada suhu kamar absorbansi dibaca sekali lagi di 515 nm

Uricacid + O2 + 2 H, Ow allantoin + Cqt H, O,

H 0, s
o \ cR, CH3 peroksidas
e

H, NC = C-CH,
/

\
0
Cl CH3
o\C/N\N/

saya saya
0 NC = C-CH, t 2H, O t HCI

0
H03S

Gambar. 1. Prinsip metode ini.

 301

(SEBUAH,). AA = AZ - Al. Untuk setiap seri penentuan kosong air dengan aqua bidest.
dan standar yang digunakan.
Perhitungan :

(AA penentuan - kosong air AA) X kerucut. standar = kerucut. asam

urat . (Standar AA - air AA kosong)
Pengurangan volume yang dijelaskan dalam prosedur ini adalah mungkin
memungkinkan adaptasi di mana sampel yang lebih kecil dapat digunakan.

hasil

Percobaan kami dimulai dari analogi penentuan fosfolipid oleh Takayama et al. [7].
Dalam metode mereka, fosfolipid yang dihidrolisis oleh fosfolipase D dan kolin
dibebaskan adalah kemudian oxi-dized oleh kolin oksidase untuk betaine dengan
produksi simultan hidrogen peroksida, yang oleh pasangan oksidasi 4-aminoantipyrine
dan fenol untuk menghasilkan chromogen dengan penyerapan maksimum pada X = 500
nm. reagen warna mereka juga terkandung kalsium klorida dan Triton X-100. Dalam
percobaan kami dengan asam urat dan uricase kami mencatat bahwa kalsium klorida
bisa dihilangkan tanpa efek merusak dan bahwa penambahan Triton X-100 untuk
campuran reaksi yang mengandung 4-aminoantipyrine dan peroksidase saja, sudah
menyebabkan pembentukan merah muda berwarna produk. Oleh karena itu, Triton X-
100 dihilangkan juga.

Berikutnya kita diuji sejumlah senyawa fenolik: sulfonasi 2,4-dikloro-fenol dibuat

sesuai dengan Barham dan Trinder [6] itu lebih efektif daripada fenol, untuk koefisien
kepunahan molekul produk akhir adalah 3,5 kali lebih tinggi bila dibandingkan pada
masing-masing panjang gelombang puncak. Naftol, 2-nitrofenol atau metoksifenol yang
lebih rendah, bahkan untuk fenol. Sejumlah buffer diadili tanpa perbedaan yang
signifikan. Buffer fosfat dipilih. sensitivitas tinggi ditemukan pada kisaran pH antara 7
dan 8; kesepakatan-ingly pH 7,5 digunakan. Selama percobaan dengan plasma ikterik
perlunya penghapusan bilirubin menjadi nyata, masalah yang telah dijelaskan secara
rinci oleh Witte et al. [81. deproteinasi dari sampel dengan TCA 3% menghasilkan,
supernatan non-ikterik jelas, sementara agen protein-precipi-Tating lain seperti etanol,
asam perklorat atau asam tungstic tidak memadai dalam hal ini. Selain sampel
deproteinized ke dalam campuran reaksi

TABLEI

OPTIMIZATIONOF THE REAGENTS

rentang yang optimal untuk reagen warna dan konsentrasi akhir dalam kuvet yang diberikan. Kisaran optimal untuk
uricase adalah bahwa setelah Selain kuvet tersebut.

Senyawa kisaran yang optimal konsentrasi akhir

4-Aminoantipyrine 0,55-0,67 mmol / l 0,57 mmol / l

ml /
Sulfonasi solusi Dichlorophenol 8-14 l 11.3 ml / l
peroksidase A40 mg / l 89 mg / l
(Diperiksa hingga 150 saya / l)
uricase > 5 ml / l 6.62 mtgl
302

TABLEII

SENYAWA DIPERIKSA UNTUK GANGGUAN. KONSENTRASI FINAL DI PLASMA DIBERI.

Tidak gangguan konsentrasi maksimal Gangguan Konsentrasi Inhibisi

diuji (persentase)

asam asetilsalisilat 100 mg / 1 allopurinol 100 mg / 1 7

allantoin 100 mg / l p-aminobenzoat AC id 50 m &! / l 6
bilirubin 340 / Lmol / l p-aminobenzoat AC id 100 mg / 1 6
kreatinin 1000 / Lmol / l p-Aminophenol 100 mg / 1 49
AC
sistein 100 mg / l askorbat id 25 mg / l 6
AC
cystine 100 mg / 1 askorbat id 50 mg / 1 6
AC
furosemide 100 mg / l askorbat id 100 mg / 1 26
glutathione 100 mg / l L-Dopa 50 mg / 1 80
Hemoglobin 100 mg / 1 homogentisat AC id 2,5 mg / l 4
Hypoxanthinc 100 mg / 1 homogentisat AC id 5 mg / 1 9
Parasetamol 100 mg / 1 a-Methyldopa 2,5 mg / l 13
Asam salisilat 100 mg / 1 - a-Methyldopa 5 mg / 1 20
tryptophan 100 mg / 1 mercaptopurine 50 mg / 1 18
tirosin 100 mg / 1 mercaptopurine 100 mg / 1 29

memberikan pH akhir dari 7,0 di kuvet tersebut. Deproteinisasi sampel memiliki

keuntungan addi-tional bahwa kemungkinan pengaruh lipemia dicegah.
Pada Tabel I optimalisasi reagen dan konsentrasi akhir mereka di kuvet yang
dijelaskan.
reaksi, setelah penambahan uricase, selesai dalam 30 menit pada suhu kamar,
menggunakan konsentrasi asam urat dalam sampel sampai setidaknya 1,2 mmol / l.
Warnanya stabil selama setidaknya satu jam lagi.
absorbansi maksimal produk akhir berwarna ditemukan di 515 nm. Penggunaan
air kosong tampaknya diperlukan. Absorbansi A, tidak sama untuk semua
spesimen, menegakkan dua bacaan AZ dan A ,. Tidak ada perbedaan antara serum
dan plasma terlihat; metode ini linear sampai setidaknya 1,2 mmol / l; A Auntuk 1
mmol / l adalah 0,4; pemulihan asam urat ditambahkan ke plasma adalah 95,2-
102,5% (3c- + 2 SD).

rentang normal @ + 2 SD) ditemukan untuk perempuan 0,175-0,359 mmol / l dan

untuk laki-laki 0,204-0,460 mmol / l. Hari variasi hari menunjukkan koefisien
variasi 2,95% (n = 25; X = 0,45) dan dalam variasi run adalah 1,21% (n = 24; X =
0,195).

Sebuah korelasi yang baik dengan metode Kageyama [2] ditemukan: r = 0,99dan
garis regresi adalah Y = 1.05X - 0,003 (Y adalah metode ini). Tapi Kageyama-
metode adalah 3,2 kali lebih sedikit sensitif.
Sejumlah senyawa telah diperiksa gangguan. Mereka ditambahkan sebelum
deproteinisasi untuk plasma yang mengandung 0,45 mmol asam urat / l; hasil
diberikan dalam Tabel II. Tidak ada peningkatan palsu absorbansi ditemukan;
hanya penghambatan reaksi terlihat.

Diskusi
 Hidrogen peroksida diproduksi oleh konversi enzimatik dari sejumlah senyawa
yang signifikan secara klinis. Salah satu metode untuk memonitor formasi
 303
a men
k ggu
u naka da
hidrogen peroksida s itu n ri 4aminoantipyrine dan fenolik yang com-
un
meme tu membentuk
pound, di san k berwarna kondensasi produk di hadapan
ak
u Digunak
peroksidase. Ini reaksi prinsip s an dalam itu penentuan glukosa [ 61,
AC
kolesterol [91, urat id atau fosfolipid
[Lo] [71.
da unt
Selama pembangunan ri ini prosedur uk urat AC id, sulfonasi 2,4-
seperti yang dijelaskan oleh Barham dan Trinder [6] ditemukan untuk
Dichlorophenol menjadi
kebanyakan senyawa fenolik sesuai. Absorbansi yang chromogen terbentuk tinggi, dibandingkan
dengan data yang diterbitkan oleh Kabasakalian et al. [Lo], yang digunakan
tribromophenol. TheuseofTritonX-100, sebagai inthesystemof Takayama
et al.
[7], inourhandsgaverisetounwanted
colourformation intheblanks.In
ictericseratheBarhamandTrinder-reaksi [6]
toolowuricacid resultedin
nilai-nilai, kemungkinan besar karena penghancuran reaksi peroksida antar-menengahi dengan
bilirubin [8].

Deproteinisasi karena itu diperlukan, dan setelah memeriksa sejumlah agen seperti etanol,
asam perklorat dan asam tungstic kami menemukan TCA 3% untuk
givetheclearestsupernatant. Removalof
bilirubinandproteinsin thisway
melakukan
tidak mengakibatkan kerugian asam urat oleh oklusi atau (co) curah hujan, karena pemulihan
yang baik ditambahkan asam urat ditemukan. Klein dan Lucas [ll] mencapai kesimpulan yang
sama.

Gangguan oleh beberapa senyawa dapat dilihat sebagai suatu kelemahan, tapi tes lain
menderita kelemahan ini juga [12,13]. Mungkin campur com-
pon whichshowsubstantial protein pengikat
areremoved oleh precipita-
tion dari protein, terutama albumin. Hasil kami menunjukkan korelasi yang baik dengan metode
Kageyama [2], tetapi metode yang dijelaskan di sini adalah lebih
peka. Prosedur ini dapat miniatur, membuat penggunaan volume sampel yang lebih kecil
mungkin; reagen yang murah.

Referensi

1 Praetorius. E. dan Paulsen, J. (1953) Berdiri. J. Clin. Laboratorium. Menginvestasikan. 5, 273-280

 2 Kageyama, N. (1971) Clin. Chin Acta 31, 421.426
3 Haeckel, R. (1976) Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 14. 101-107
4 Kamoun, P., Lafourcade, G. dan Jerome, H. (1976) Clin. Chem. 22. 964-967
5 Rehak, NN, Janes, G. dan Young, DS (1977) Clin. Chem. 23. 195-199
6 Barham, D. dan Trinder. P. (1972) Analyst 97. 142-145
7 Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T. dan Tanimizu, I. (1977) Clin. Chim. Acta 79, 9348
8 Witte, DL. Coklat. LF dan Feld, RD (1978) Clin. Chem. 24. 1778-1782
9 R & chlau, P., Bemt. E. dan Gruber. W. (1975) 9 Int. Kongres pada Kimia Klinik. Toronto,

10 Kabasakalian, P., Kalliney, S. dan Westcott, A. (1973) Clin. Chem. 19. 522-524
11 Klein, B. dan Lucas. LB (1973) Clin. Chem. 19, 67-75
12 Salway, JG (1978) Ann. Clin. Biochem. 15, 4448
13 Muda. DS, Pestaner, LC dan Gibbermsn, V. (1975) Clin. Chem. 21, lD432D