MAKALAH PENUGASAN

INSTRUMEN
TLM22021

(ELIZA)

Dosen Pengampu :
Anita Rachmatia Audina, S.Tr.AK
Disusun Oleh :
Nama :Muhammad Riduan
-Meydina
-Siti Aisyah Mulandari
-Laili
-Sari Ramadanti
Hidayahtika .MJM
Kelompok :1
PROGRAM STUDI DIII ANALIS KESEHATAN
POLITEKNIK UNGGULAN KALIMANTAN
BANJARMASIN
(2018)
JUDUL :pemeriksaan Eliza
TUJUAN : 1. Mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik
ELISA.
2. Memahami prinsip kerja teknik ELISA.
3. Mampu melakukan metode pemeriksaan kuantitatif
plasma dan serum darah dengan
teknik Elisa.
4. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif human
preAlbumin terhadap plasma darah
dengan teknik ELISA
5. Mampu membuat grafik dari pengenceran standar dan
memperoleh rumus persamaan
perhitungan konsentrasi sampel dengan regresi linier.
HARI/TANGGAL :JUM’AT/ 21/9/2018

I. PRINSIP KERJA
Antibodi Immunosorbent Enzyme-linked (ELISAs) adalah teknik yang
menggabungkan spesifisitas antibodi dengan sensitivitas uji enzim secara sederhana,
dengan menggunakan antibodi atau antigen yang digabungkan ke suatu enzim yang
mudah diuji. ELISA memberikan pengukuran antigen atau antibodi yang baik secara
relatif maupun kuantitatif. ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi adanya antigen
yang dikenali oleh antibodi atau dapat digunakan untuk menguji antibodi yang
mengenali antigen.
Teknik ELISA seacara umum mengikuti lima prosedur:
1) melapisi pelat microtiter dengan antigen;
2) memblokir semua situs yang tidak terikat untuk mencegah hasil positif palsu;
3) menambahkan antibodi primer (misalnya antibodi rabbit monoklonal ) ke
sumur;
4) tambahkan antibodi sekunder yang terkonjugasi ke enzim (misalnya IgG anti-
rat);
5) reaksi substrat dengan enzim untuk menghasilkan produk berwarna, sehingga
menunjukkan reaksi positif.
Berikut adalah prinsip umum ELISA yang bisa dilakukan:

A. Protokol ELISA Tidak Langsung

1) Encerkan antigen ke konsentrasi akhir 1-20 μg / ml menggunakan

penyangga lapisan PBS atau Bikarbonat / karbonat. Lambang sumur dari
 plat mikrotiter PVC dengan antigen dengan memipet 50μl pengenceran
antigen di atas sumur piring. Encerkan pelat sesuai kebutuhan. Segel
piring dan menetaskan semalaman pada 4 ° C atau 2 jam pada suhu kamar.
2) Cuci piring 3 kali dengan PBS.
3) Blok situs pengikatan protein yang tersisa di sumur terlapis dengan
menambahkan 200 μl buffer blocking, 5% susu kering tanpa lemak / PBS,
per sumur. Pereaksi pemblokiran alternatif termasuk BlockACE atau BSA.
4) Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama minimal 2 jam
pada suhu kamar atau, jika lebih nyaman, semalam pada 4 ° C.
5) Cuci piring 3 kali dengan PBS.
6) Tambahkan 100 μl antibodi primer diencerkan ke setiap sumur.
7) Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 2 jam pada suhu
kamar.
8) Cuci piring 4 kali dengan PBS.
9) Tambahkan 100 μl antibodi sekunder terkonjugasi, diencerkan pada
konsentrasi optimal (sesuai dengan produsen) dalam memblokir buffer
segera sebelum digunakan.
10) Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 1-2 jam pada
suhu kamar.
11) Cuci piring 5 kali dengan PBS.
12) Dispense 100 μl (atau 50 μl) dari solusi substrat per sumur dengan pipet
multichannel atau multipipet. 13. Setelah perkembangan warna yang
cukup (jika perlu) tambahkan 50-100μl larutan berhenti ke sumur. 14.
Catat absorbansi pada 450 nm pada pembaca pelat dalam waktu 30 menit
untuk menghentikan reaksi.
B. Protokol ELISA Langsung
1) Lambang plat ELISA (96 plat sumur) dengan pengujian antigen
(10 μg / ml hingga 0,01 ng / ml dalam 50 mM Na2C03, pH 9,6,
sesuaikan berdasarkan reaktivitas antibodi, 100 µl / baik. Segel
pelat dan inkubasi semalam pada 4 ° C.
2) Cuci piring 3 kali dengan PBS-T (0,05% Tween-20 dalam PBS).
3) Piring balok dengan 0,2% susu kering tanpa lemak dalam PBS
pada suhu kamar selama 1 jam pada 4 ° C
Catatan: Susu harus benar-benar larut. Dianjurkan untuk
melarutkan 0,5 g susu dalam 50 ml PBS (1%) selama minimal 30
menit pada suhu kamar dengan rotasi atau pengadukan, kemudian
encerkan menjadi 0,2%, dan terus berputar atau aduk selama 10-15
menit pada suhu kamar. Jika latar belakang yang tinggi dialami,
1% susu dalam PBS dapat digunakan untuk pemblokiran dan
pengenceran antibodi.
4) Cuci piring 3 kali dengan PBS-T.
5) (a) Inkubasi dengan IgG kelinci teremunikan, IgG afinitas-
dimurnikan (0,1-0,5 μg / ml dalam PBS, 100 μl / well) pada
suhu kamar selama 1 jam, diikuti dengan mencuci 6 kali
dengan PBS-T, kemudian pergi ke 8a .
(b) Alternatifnya, inkubasikan dengan IgG kelinci yang dimurnikan
afinasinya (0,2-1 μg / ml dalam PBS, 100 μl / well) pada
suhu kamar selama 1 jam, diikuti dengan mencuci 6 kali
dengan PBS-T, kemudian pergi ke 8b.
6) (a) Inkubasi dengan HRP-Streptavidin (1: 4000-10.000
pengenceran) dalam 0,2% susu-PBS, 100 μl / well, pada
suhu kamar selama 1 jam.
(b) Inkubasi dengan IgG HRP-anti-kelinci (1: 3,000-10,000
pengenceran 1 mg / ml atau 0,25 μg / ml) dalam PBS, 100
μl / well, pada suhu kamar selama 1 jam.
7) Cuci piring 8 kali dengan PBS-T.
8) Kembangkan warna menggunakan TMB sebagai substrat (100 μl /
well) dan inkubasi pada suhu kamar selama 15-30 menit tanpa
gemetar.
9) Hentikan reaksi dengan penambahan 2N H2S04 (100 μl / well).
Catat absorbansi pada 450 nm pada pembaca pelat dalam waktu 30
menit untuk menghentikan reaksi.
Protokol ELISA Sandwich
1) Sebelum pemeriksaan, kedua preparat antibodi harus dimurnikan dan satu
harus diberi label.
2) Untuk sebagian besar aplikasi, pelat mikrotiter polyvinylchloride (PVC)
adalah yang terbaik; Namun, konsultasikan dengan panduan pabrik untuk
menentukan jenis plat yang paling tepat untuk pengikatan protein.
3) Ikatkan antibodi tanpa label ke bagian bawah setiap sumur dengan
menambahkan sekitar 50 μL larutan antibodi ke setiap lubang (20 µg / ml
dalam PBS). PVC akan mengikat sekitar 100 ng / baik (300 ng / cm2).
Jumlah antibodi yang digunakan akan tergantung pada pengujian individu,
tetapi jika pengikatan maksimal diperlukan, gunakan setidaknya 1 μg /
well. Ini jauh di atas kapasitas sumur, tetapi pengikatan akan terjadi lebih
cepat, dan solusi pengikatan dapat disimpan dan digunakan lagi.
4) Inkubasi piring semalam pada 4 ° C untuk memungkinkan pengikatan
lengkap.
5) Cuci sumur dua kali dengan PBS. Botol mousse 500 ml nyaman
digunakan. Larutan larutan antibodi dapat dihilangkan dengan membalik
piring di atas wadah yang sesuai.
 6) Sisa situs untuk pengikatan protein pada pelat mikrotiter harus dijenuhkan
dengan menginkubasi dengan buffer pemblokir. Isi sumur ke atas dengan
3% BSA / PBS dengan 0,02% natrium azida. Inkubasi selama 2 jam
semalam dalam suasana lembab pada suhu kamar. Catatan: Natrium azida
adalah inhibitor atau peroksidase horseradish. Jangan sertakan natrium
azida dalam buffer atau larutan pencuci jika antibodi berlabel HRP akan
digunakan untuk deteksi.
7) Cuci sumur dua kali dengan PBS.
8) Tambahkan 50 μL larutan antigen ke sumur (larutan antigen harus
dititrasi). Semua pengenceran harus dilakukan dalam buffer pemblokiran
(3% BSA / PBS). Inkubasi setidaknya selama 2 jam pada suhu kamar
dalam suasana lembab.
9) Cuci piring empat kali dengan PBS.
10) Tambahkan antibodi kedua yang berlabel. Jumlah yang akan ditambahkan
dapat ditentukan dalam percobaan awal. Untuk kuantisasi akurat, antibodi
kedua harus digunakan secara berlebihan. Semua pengenceran harus
dilakukan dalam buffer pemblokiran.
11) Inkubasi selama 2 jam atau lebih pada suhu kamar dalam suasana lembab.
12) Cara dengan beberapa perubahan PBS.
13) Tambahkan media seperti ditunjukkan oleh produsen. Setelah waktu
inkubasi yang disarankan telah berlalu, kepadatan optik pada panjang
gelombang target dapat diukur pada pembaca pelat ELISA. Catatan:
Beberapa substrat enzim dianggap berbahaya, karena potensi
karsinogenisitas. Tangani dengan hati-hati dan lihat Lembar Data
Keamanan Materi untuk tindakan pencegahan penanganan yang tepat.
Protokol ELISA Kompetitif

1) Untuk sebagian besar aplikasi, pelat mikrotiter polyvinylchloride (PVC)

adalah yang terbaik; Namun, konsultasikan dengan panduan pabrik untuk
menentukan jenis plat yang paling tepat untuk pengikatan protein.
2) Tambahkan 50 μL antibodi primer diencerkan (tangkap) ke setiap sumur.
Pengenceran yang sesuai harus ditentukan menggunakan titrasi kotak-
kotak sebelum pengujian sampel. PVC akan mengikat sekitar 100 ng / baik
(300 ng / cm2). Jumlah antibodi yang digunakan akan tergantung pada
pengujian individu, tetapi jika pengikatan maksimal diperlukan, gunakan
setidaknya 1 μg / well. ini jauh di atas kapasitas sumur, tetapi pengikatan
akan terjadi lebih cepat, dan solusi pengikatan dapat disimpan dan
digunakan lagi. Biarkan hingga inkubasi selama 4 jam. pada suhu kamar
atau 4 ° C semalam.
 Catatan: Jika antibodi penangkap yang dimurnikan tidak tersedia, plat
harus terlebih dahulu dilapisi dengan antibodi sekunder murni yang
diarahkan melawan host antibodi penangkap sesuai dengan prosedur
berikut:
a) Ikatkan antibodi sekunder yang tidak berlabel ke bagian bawah setiap
sumur dengan menambahkan sekitar 50 μL larutan antibodi ke setiap
lubang (20 μg / mL dalam PBS).
b) Inkubasi piring semalam pada 4 ° C untuk memungkinkan pengikatan
lengkap.
c) Tambahkan antibodi penangkap utama (seperti di atas).
3) Cuci sumur dua kali dengan PBS. Botol mousse 500 mL nyaman
digunakan. Larutan larutan antibodi dapat dihilangkan dengan membalik
piring di atas wadah yang sesuai.
4) Sisa situs untuk pengikatan protein pada pelat mikrotiter harus dijenuhkan
dengan menginkubasi dengan buffer pemblokir. Isi sumur ke atas dengan
3% BSA / PBS dengan 0,02% natrium azida. Inkubasi selama 2 jam. untuk
bermalam dalam suasana lembab pada suhu kamar
5) Cuci sumur dua kali dengan PBS.
6) Tambahkan 50 μL standar atau larutan sampel ke sumur. Semua
pengenceran harus dilakukan dalam buffer pemblokiran (3% BSA / PBS
dengan 0,05% Tween-20)
Catatan: Natrium azida adalah inhibitor atau peroksidase horseradish.
Jangan sertakan natrium azida dalam buffer atau larutan pencuci, jika
konjugat berlabel HRP akan digunakan untuk deteksi.
7) Tambahkan 50 μL larutan antigen-konjugasi ke sumur (larutan antigen
harus dititrasi). Semua pengenceran harus dilakukan dalam buffer
pemblokiran (3% BSA / PBS dengan 0,05% Tween-20). Inkubasi
setidaknya selama 2 jam. pada suhu kamar dalam suasana lembab.
8) Cuci piring empat kali dengan PBS.
9) Tambahkan substrat seperti yang ditunjukkan oleh produsen. Setelah
waktu inkubasi yang disarankan telah berlalu, kepadatan optik pada
panjang gelombang target dapat diukur pada pembaca ELISA.
Catatan: ELISAs Kompetitif menghasilkan kurva terbalik, di mana nilai
antigen yang lebih tinggi dalam sampel atau standar menghasilkan jumlah
perubahan warna yang lebih rendah.
III.METODE
Berdarkan warna campuran dari pendaran signal diukur dengan
spektrofotometer yang disebut ELISA reader hingga mendapat hasil berupa
densitas optis (OD).Dengan menghitung rata-rata control negative yang di
gunakan,didapat nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel.
Metode ELISA (enzym-linked immunosorbent assay) metode dalam penelitian
dengan Berdasarkan : Ikatan spesifik antara antigen (Ag) – antibody(Ab).

ELISA dipakai untuk pengujian semua antigen, hapten atau antibody. Paling
banyak dipakai di laboratorium klinis, misalnya uji immunoglobulin G dan E,
hormone seperti insulin, esterogen dan gonadotrofin.

Antibody yaitu Antibodi disekresi oleh Sel Plasma (Sel B), Biasanya digunakan
monoklonal Antibody karena lebih spesifik untuk epitop tertentu daripada
policlonal antibodi. Dapat dibeli terpisah atau dalam paket ELISA Kit, biasanya
diproduksi dengan cara induksi respon imun humoral pada hewan coba ( rat,
mouse) dengan cara injeksi Antigen berulang, dilakukan ekstraksi sel dan
purifikasi Ab. Dapat juga diekstraksi dari manusia yang telah diimunisasi dengan
Ag tertentu.

Terdapat 2 Teknik Metode ELISA

Teknik Kualitatif adalah Berdasarkan bahwa tiap antibodi berikatan pada
antigen yang spesifik.
Teknik kuantitatif berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan
dengan nilai absorbansi. Teknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan
kepekaan uji enzymatis dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan
pada enzyme yang mudah ditera

II. ALAT DAN BAHAN

Alat : -Mesin Sentrifuge dan Microsentrifuge
-Tabung sampel darah (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes
dengan K2 EDTA 3,6 mg)
-ELISA Washer
-ELISA Reader Multiskan GO
-Perlengkapan untuk Pengmbilan sampel darah (Tourniquet,
Swab Alkohol, Spuit 3cc)
-Tabung Microsentrifuge
Bahan : -Darah Sampel
-ELISA KIT MyBioSource untuk Pemeriksaan
Human PREALBUMIN yang terdiri dari:
a. Diluent Consentrate 5x
b. Wash Solution 20x
c. Enzyme Antibody Conjugate 100x
d. Chromogen-Substrate Solution
 e. Stop Solution
f. Anti-Human Prealbumin ELISA
Microplate
g. Human Prealbumin Standard (Human
Prealbumin Calibrator)
-Mikropipet single channel ukuran 100-1000 μl dan 20-200 μl
serta mikropipette multichannel
-Tip micropipette
-Vortex
-Gelas Ukur
-Aluminium Foil
III. CARA KERJA
IV. Cara Kerja
a. Sampel
1. Pengambilan sampel darah masing-masing tabung 1,5 cc sampel 1 dan 2
dimasukkan
ke dalam tabung yang berisi EDTA untuk diambil plasma darahnya,
sementara
sampel ke 3 dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuge tanpa EDTA
untuk diambil serumnya. Selanjutkan dilakukan sentrifugasi ketiga sampel
darah tersebut untuk memisahkan plasma darah dan serum darah dengan
sel darah.
Tabung sampel+EDTA 1 dan 2 → sentrifugasi dengan kecepatan 3000
rpm selama 10 menit.
Tabung mikrosentrifuge 3 → dengan mikrosentrifuge kecepatan 3000 rpm
selama 10 menit.

2. Pengenceran Diluent Solution 5X → 1X

Untuk mendapatkan 10 ml diluent sol 1x= 2 ml Diluent sol. + 8 ml
Aquades.
3. Pengenceran sampel.
Siapkan 2 tabung eppendorf untuk tiap sampel,
Tabung I = 5 μl Sampel + 495 μl Diluent 1X
= 1/100 dilution → sentrifugasi.
Tabung II = 5μl Tabung I + 495 μl Diluent 1X
= 1/10000 dilution → sentrifugasi.
b. Standard
1. Siapkan 8 tabung eppendorf
- Standard 7 = 8 μL Human Pre-Calibrator + 677 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 6 = 300 μL standard 7 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 5 = 300 μL standard 6 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 4 = 300 μL standard 5 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 3 = 300 μL standard 6 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 2 = 300 μL standard 3 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 1 = 300 μL standard 2 + 300 μL Diluent 1X → sentrifugasi.
- Standard 0 = 600 μL Diluent 1X.
c. Well ELISA (Anti-Human Prealbumin ELISA Microplate)
1. Dengan menggunakan micropipet, masukkan Standard 7-0 ke dalam well
kolom 1
(A-H) sebanyak 100 μL.
2. Dengan menggunakan micropipet, masukkan Sampel 1-3 ke dalam well
kolom 2 (AH)
sebanyak 100 μL.
3. Diinkubasikan pada suhu ruangan selama 60±2 menit. Tutup well plate
dengan
plastik transparan dan dalam posisi sejajar.
4. Siapkan Wash Solution 20X → 1X sebanyak 100 ml.
= 5 ml Wash Solution + 95 ml Aquades.
5. Setelah selesai diinkubasi, well plate dicuci dengan larutan Wash Solution
sebanyak
4 kali dengan menggunakan alat Elisa Washer(Thermo Scientific™
Wellwash™Microplate Washer).
6. Siapkan 100x enzyme-antibody conjugate yang diencerkan menjadi 1x
(dalam
keadaan gelap).
= 20 μl enzim + 1980 μl 1X diluent.
7. Masukkan ke masing-masing well 100 μl enzim yang telah diencerkan.
Kemudian tutup dengan aluminium foil (dalam keadaan gelap) dan
inkubasi selama 30±2 menit.
8. Lakukan pencucian kembali seperti langkah 5.
9. Masukkan 100 μL TMB Substrate Solution (Chromogen-Substrate
Solution) pada masing-masing well dan inkubasi dengan suhu ruangan
dan keadaan gelap selama 10 menit.
10. Kemudian masukkan 100 μL Stop Solution pada masing-masing well.
11. Masukkan seluruh well ke Elisa Reader Multiskan GO dan lakukan
pembacaan hasil dengan gelombang absorbansi 450 nm.
IV. PERAWATAN
1.PERAWATAN HARIAN
-matikan alat setelah selesai di gunakan
-bersihkan tray dari kotoran atau debu dengan menggunakan sponn/tisu
2.PERAWATAN 6 BULAN
-lakukan kalibrasi pada alat secara keseluruhan seperti : lampu,proses
pembacaan.
V. GAMBAR
VII. DAFTAR PUSTAKA
- Candra,dwi.2018.KELOMPOK EISA terbaru : http://www.academia.edu/
30429543/KELOMPOK_ELISA_terbaru.10oktober2018
- Wanenoor,rezone.2012.Metode ELISA(Enzyme Linked Immune Sorbent
Assay):http://wanenoor.blogspot.com/2012/11/metode-elisa-enzym
e-linked-immune.html?m=1#.W-ZLKdczbIW.10oktober2018
- Kurniawan,aynita.2014.Prinsip Dasar Eliza : https://www.scribd.com/doc/
218573393/Prinsip-Dasar-Elisa.10oktober2018
- Anonymos.2017.Prinsip ELISA: http://riset.fk.unsoed.ac.id/2017/04/16/pri
nsip-elisa/.10oktober2018