RESUME JURNAL

Disusun oleh :
Desty Meilinawati (11161012)
Dwie Septivianie (11161018)
Fahmi Imanullah (11161023)
M. Rizky Ramadhan (11161040)
Nadhifah Assofatun Nisa (11161042)
Riska Julianti (11161047)

3 FA1

SEKOLAH TINGGI FARMASI BANDUNG

2018
 RESUME JURNAL
1. Judul jurnal
Identifikasi penanda oksidasi baru tanin anggur-kental oleh analisis UPLC-MS setelah
depolimerisasi kimia.
2. Tahun
2014
3. Penulis
Laetitia Mouls and Helene Fulcrand
4. Reviewer
Desty Meilinawati
Dwie Septivianie
Fahmi Imanullah
M. Rizky Ramadhan
Nadhifah Assofatun Nisa
Riska Julianti
5. Tanggal
16 November 2018

1. Abstrak
Solusi model campuran monomer / dimer teroksidasi dari flavan-3-ol (EC / B2, EGC /
B2, ECG / B2, EGCG / B2) dipelajari setelah depolimerisasi kimia oleh UPLCeMS. Penanda
oksidasi baru dari kental tanin diidentifikasi. Metode analitik ini diterapkan pada sampel
anggur dan sebagian besar teroksidasi penanda terdeteksi. Metode ini akan memungkinkan
mengikuti keadaan oksidasi tanin selama proses pembuatan anggur dan penyimpanan untuk
meningkatkan kualitas produk.
2. Pendahuluan
Polifenol anggur terlibat dalam stabilitas koloid anggur merah dan juga berkontribusi
terhadap sifat organoleptik, terutama warna dan rasa. Polifenol utama yang bertanggung
jawab adalah flavonoid termasuk anthocyanin dan proanthocyanidins, yang juga disebut tanin
kental. Nthocyanin adalah pigmen merah anggur, sementara proanthocyanidins adalah
polimer, ditandai dengan afinitas tinggi untuk protein interaksi
Metode yang kami pilih untuk menyelidiki struktur perubahan tannin pada oksidasi
dan mekanisme reaksinya didasarkan pada kromatografi cair ultra-kinerja online analisis
 spektrometri (UPLCeMS) dari produk yang diperoleh setelah depolimerisasi kimia tanin
teroksidasi.
Pada solusi model yang mengandung struktur anggur tannin. Setiap solusi terdiri dari
dimer B2 dan salah satunya subunit monomerik anggur: EC, epicatechin-3-O-gallate (ECG)
untuk benih, dan epigallocatechin (EGC) untuk kulit (Gbr. 1). Bahkan meskipun itu bukan
monomer konstitutif tanin anggur, solusi disiapkan dengan epigallocatechin-3-O-gallate
(EGCG) untuk bandingkan reaktivitasnya dengan yang lain. penanda oksidasi diidentifikasi
dalam solusi model ini diperiksa dalam anggur putih eksperimental yang difermentasi dengan
cara yang sama seperti pada anggur merah agar kaya akan tanin.

3. Metodologi dan prosedur

3.1. Prosedur umum untuk mengoksidasi sampel
Sampel model dilarutkan pada konsentrasi 5 g L 1 dalam H2O yang diasamkan
hingga pH 3,5 dengan TFA pada 98% minimum agar berada pada pH yang sama seperti
anggur. Oksidasi dilakukan dengan mengaduk sampel dengan adanya kuantitas udara
terkendali pada suhu konstan 24 C selama 34 minggu. Sampel diambil dan dianalisa pada t0, 3,
4, 5, 7, 9, 12, 15, 17, 19, 21, 26, 30, dan 34 minggu.
3.2. Prosedur umum untuk depolimerisasi kimia
Dalam pekerjaan ini kami menggunakan prosedur thioglycolysis yang sama yang
dijelaskan dalam pekerjaan kami sebelumnya.6 Larutan 1 mg L 1 dari setiap sampel yang
dioksidasi kering disiapkan dalam metanol. Seratus mikroliter larutan ditempatkan dalam
sisipan gelas 250 mL dan 100 mL larutan asam tioglikolat (40 mL asam tioglikolik dengan 4960
mL metanol / HCl pekat 95: 5 v / v) ditambahkan. Setelah menyegel sisipan kaca dengan topi
lembam, reaksi dilakukan pada 90ºC selama 6 menit.
3.3. Prosedur umum untuk analisis UPLCeESI / MS
Dalam pekerjaan ini kami menggunakan prosedur yang sama untuk analisis
UPLCeESI / MS yang dijelaskan sebelumnya.6 Analisis dilakukan pada Ana-lytical REversed-
Phase UPLCeESI-MS yang diujicobakan oleh perangkat lunak HyStar 3.2.
Sampel teroksidasi depolimerisasi (5 mL) langsung disuntikkan ke sistem UPLC
digabungkan ke ESI-MS. Sistem kromatografi cair adalah Acquity UPLC (Waters, Milford, MA)
yang dilengkapi dengan Photodiode Array Detector. Kolom (HSS T3 100 2.1 mm, 1.8 mm, 100
& angst) adalah Nucleosil 120-3 C18 endcapped (MachereyeNagel, Swedia). Laju aliran 0,55
mL min 1 dan kondisi gradien adalah pelarut A (H2O / CHOOH, 99: 1, v / v); pelarut B (CH3CN /
H2O / CHOOH, 80: 19: 1, v / v / v); awal 0,1% B; 0e2 mnt, 25% B linier; 2e4 mnt, 35% B linier;
4e5 menit, 35% B isokratik; 5e6 mnt, 40% B linier; 6e8 menit, 99,9% B linear dan 8e10 menit,
99,9% B isokratik.
Analisis MS dilakukan pada spektrometer massa ESZ Trap amaZon (Bruker Daltonics,
Bremen, Jerman). Dalam sumbernya, tekanan nebulizer adalah 44 psi, suhu gas kering diatur
menjadi 200 C dengan aliran 12 L min 1; tegangan kapiler diletakkan pada 5,5 kV. Spektrum
massa diperoleh selama rentang massa 70e2000 Th dalam mode ionisasi positif. Pengambilan
spektrum massa kecepatan ditetapkan pada 8.1 m / z s 1. MS2 dan MS3 eksperimen dilakukan
dalam MS otomatis (n). Untuk mendapatkan hasil MS2 dan MS3 yang optimal, amplitudo
fragmentasi dioptimalkan untuk senyawa yang diminati dengan metode otomatis 'SmartFrag'
(banyak amplitudo fragmentasi diterapkan selama setiap langkah fragmentasi antara 60%
hingga 180%), pemilihan cut-off 27 %, delay 0 ms, waktu 40 ms, lebar> 4 m / z.
4. Hasil dan pembahasan
Produk autoxidation terbentuk dalam empat solusi model (B2 / EC, B2 / ECG, B2 /
EGC, B2 / EGCG) dipantau selama 34 minggu dengan analisis UPLCeMS setelah depolimerisasi
kimia oleh metil ester dari asam thioglycolic (thioglycolysis). penanda oksidasi yang terlibat
Unit ECG, EGC atau EGCG harus dibentuk oleh re-molekul antarmolekul tindakan (Gbr. 2)
Produk lain yang dihasilkan oleh reaksi B2 adalah salah satu dari tipe-A, yang dihasilkan dari
reaksi intramolekul atau tipe dehydrodicatechin dihasilkan dari reaksi antarmolekul, seperti
yang ditunjukkan di kami penelitian sebelumnya. Namun, kami fokus pada identi fikasi
penanda oksidasi yang terkait dengan ECG, EGC, dan EGCG. Sana adalah dua jenis penanda
oksidasi: (i) reaksi antarmolekul penanda unit terminal (monomer atau unit terminal B2); (ii)
penanda reaksi antarmolekul campuran terminal dan ekstensi unit (monomer dan unit
perpanjangan B2).
 Perbandingan pola fragmentasi dari produk oksidasi ucts antara solusi EGCG / B2 dan
EC / B2 menunjukkan bahwa mereka memiliki tulang punggung yang sama yang terdiri dari
dua unit EC yang berasal dari unit terminal B2 dan hidroksil tambahan, kemungkinan
disediakan oleh molekul air. Perhatikan bahwa pembentukan produk ini di Larutan EGCG / B2
tidak memerlukan monomer dan karenanya bukan penanda spesifik oksidasi EGCG
dibandingkan dengan ECG dan EGC yang memiliki ion penanda oksidasi spesifik pada m / z
593. Ion penanda lain yang diidentifikasi sebelumnya terdeteksi dalam inisolusi model: (i)
pada m / z 787 dan 801, sesuai dengan dimeric penanda reaksi intermolecular dari unit
perluasan yang diidentifikasi oleh kehadiran reagen nukleofilik (Nu) yang digunakan dalam
reaksi polimerisasi, dan secara formal terdiri dari ECNu / ECNu dan (ECNu / ECNu) þOH,
masing-masing; (ii) pada m / z 683 dan 681 corre- sponding to dimeric intermolecular reaction
markers dari terminal dan unit perluasan, yang secara formal terdiri dari ECNu / EC, dan ECNu
/ EC-2H, yang kedua adalah produk oksidasi yang pertama; (iii) pada m / z 865 dan m / z 881,
sesuai dengan re-molekul intermolekuler trimeric penanda tindakan unit terminal, secara
formal terdiri dari (EC / EC / EC) - 2H dan (EC / EC / EC) -2HþOH, masing-masing. Dalam karya
ini, kedua isomer dideteksi pada m / z 683 dalam solusi B2 / EC dapat diidentifikasi dengan
massa fragmentasi mereka spektrum.
Memang, dua kemungkinan struktur dapat dibayangkan dari dimer tipe-
dehidrodikatechin B ini yang disubstitusi oleh nuclear ophilic reagent (ECNu / EC) dan
dihubungkan oleh ikatan kovalen antara A dan B berdering: ECNu dapat dihubungkan dengan
cincin A atau B (Gbr. 3). Kedua Spektrum massa fragmentasi menunjukkan serangkaian
fragmen ion yang sama (m / z 577, 559, 425, dan 407) menunjukkan bahwa salah satu dari dua
B cincin tidak terlibat dalam ikatan kovalen dan salah satu dari dua EC diganti dengan reagen
nukleofilik).
Ion pada hasil m / z 451 dan 439 dari kehilangan simultan reagen nukleofil dan
kehilangan bagian cincin A oleh cincin fisi heterosiklik (HRF) atau retro- Mekanisme
DielseAlder (RDA), masing-masing. Untuk iso kedua ini mer, ion-ion ini pada m / z 515 dan
pada m / z 439 menunjukkan bahwa nukleosida reagen phile adalah pada unit EC yang
dihubungkan oleh cincin A. Akibatnya, itu isomer pertama pada m / z 683 terelusi memiliki
unit ECNu yang dihubungkan oleh B cincin dan isomer kedua memiliki unit ECNu yang
dihubungkan oleh cincin A (Gbr. 3).
 Gambar 3 : Spektrum massa fragmentasi dari kedua ion penanda isobar pada m / z 683.
4.1 Penanda oksidasi dari Epikatekin galat
Penemuan ini menunjukkan bahwa cincin B dalam struktur ECG lebih rentan oksidasi
dari kelompok galloyl. Namun demikian, berdasarkan redox nilai-nilai yang ditampilkan pada
Tabel 1, asam galat adalah zat pereduksi yang lebih baik sebagai asam bebas dibandingkan
dengan bentuk ester. Bukti untuk ikatan ester hidrolisis ditemukan atas dasar deteksi asam
galat dalam solusi yang mengandung ECG atau EGCG. Selain itu, setengah dari ion penanda
yang diidentifikasi dalam solusi ECG / B2 menunjukkan bahwa asam galat yang dilepaskan
dioksidasi dan bereaksi dengan cincin A banyak unit flavanol hadir dalam larutan ini, seperti
yang diuraikan di bagian berikutnya.
Tabel 1 : Potensi reduksi dari beberapa senyawa fenolik pada pH 3,5 yang dijelaskan oleh John
C. Danilewicz2
E²V (5:3)
Cathecol (seperti cincin B flavanol) 0,85
3,5-Dihydroxy-anisole (seperti cincin flavanol) 1,07
(þ) –Catechin 0,91
(þ) –Epigallocatechin 0,73
Metil galat 0,91
Asam galat 0,78

Ion ini dapat dihasilkan dari hilangnya bagian benzil mengandung cincin B oleh
mekanisme BFF. Keuntungan menggunakan spektrometer massa perangkap ion adalah untuk
melakukan percobaan MS3, yang memungkinkan kita untuk memperkuat struktur ion ini.
Memang, aktif Spektrum massa MS3, ion pada m/z 283 secara resmi diproduksi oleh
hilangnya molekul air sementara ion pada m/z 273 hasil dari hilangnya molekul CO. Ion
fragmen pada m/z 301 juga ada spektrum massa untuk ion isobarik pertama pada m/z 593
dielusi pada waktu retensi 4.1e4.2, tetapi tidak melimpah. Sebaliknya, ion pada m/z 273
dihasilkan oleh fragmentasi ion pada 301 berlimpah pada spektrum massa. Efeknya,
sementara massa fragmentasi spektra tidak mengizinkan identifikasi struktural lengkap
dua penanda ini, struktur dari dua regioisomer C6/C8 adalah sementara diusulkan seperti
yang digambarkan dalam Skema 1.
Mekanisme didalilkan untuk formasi mereka kemungkinan merupakan penambahan
tipe-Michael dari ECG Sebuah cincin melalui karbon C8 atau C6 ke ortho-quinone of gallic
AC id. Setelah regenerasi sistem aromatik pada galloyl dan Sebuah lingkaran cincin setelah
penambahan, siklisasi intramolekul antara hidroksil cincin A dan karboksil dari
residu galloyl memuncak pada lakton yang dihasilkan, seperti yang ditunjukkan pada
Skema 2.

Skema 1 : Hipotesis fragmentasi ion pada m / z 593 oleh ESI-MS / MS.

Skema 2 : Formasi hipotetik dari ion penanda pada m / z 593 yang dihasilkan oleh
penambahan ECG Sebuah cincin melalui karbon C8 (a) atau C6 (b) ke orto-quinone dari asam
galat.
 hasil dari reaksi serupa antara orto-kuinon asam galat yang sebelumnya dikeluarkan
oleh ECG hidrolisis dan cincin A dari unit perluasan B2. Setelah depolimerisasi,
dua ion utama pada m/z 545 terdeteksi. Menurut spektrum massa fragmentasi mereka, ion
pada m/z 439 dan 421 menunjukkan adanya reagen nukleofilik pada C4. Itu
rangkaian fragmen ion pada m / z 393, 289, dan 153 dapat dihasilkan dari fisi heterocycle
sesuai dengan mekanisme RDA. Kehadiran gugus galloyl pada hidroksil di C3 adalah
diabaikan karena ion penanda yang terdeteksi adalah unit perluasan yang hanya dapat
disediakan oleh dimer B2.
4.2 Penanda oksidasi dari Epigalokatekin
Temuan ini menunjukkan bahwa hidroksil tambahan grup pada penanda EC / EC tidak
pada posisi yang sama dengan EGC. Lima campuran ion penanda reaksi molekuler terminal
dan unit penyuluhan khusus untuk EGC diidentifikasi dalam solusi ini. Tiga dari mereka terdiri
dari EGC dan unit perpanjangan B2 dihubungkan oleh satu atau dua ikatan kovalen (m / z 699
dan 697, masing-masing) dengan kelompok hidroksil tambahan (m/z) dalam beberapa kasus.
Pada tahun 1964, Takino dan rekannya menunjukkan bahwa reaksi oksidasi
melibatkan cincin B EGC dan EC memberikan theaflavin pigmen (Gambar 4a), yang
mengandung cincin benzotropolon.11 Oleh karena itu, kopling oksidatif EGC dan EC
berdekatan dengan cincin B sedangkan itu istimewa menghubungkan cincin A dan B dari dua
yang berbeda EC. Cincin benzotropolon yang dihasilkan oleh dimerisasi EGC/EC dapat
dioksidasi ulang untuk menghasilkan dehidrotheaflavin.7,12 Ion penanda terdeteksi pada m/z
669 ditugaskan untuk struktur tipe theaflavin digantikan oleh reagen nukleofilik (Gambar 4b)
dan ion pada m/z 683 pada struktur tipe dehydrotheaflavin yang digantikan oleh nukleofilik
reagen (Gbr. 4c).
 Gambar 4 : Struktur (a) theaflavine, (b) ion penanda pada m/z 669 (struktur tipe
theaflavin), dan (c) ion penanda pada m/z 683 (struktur jenis dehidrotheaflavin) yang
diidentifikasi dalam larutan EC / EGC setelah kimia depolimerisasi.
4.3 Penanda oksidasi dari Epigalokatekin galat
Penelitian ini menyoroti hidrolisis ikatan ester EGCG, seperti untuk ECG. Namun,
bertentangan dengan solusi ECG / B2, pelepasan asam galat tampaknya kurang terlibat dalam
reaksi dengan flavanol karena lebih sedikit ion penanda yang diamati. Temuan ini dapat hasil
dari cincin B EGCG menjadi lebih kompetitif daripada cincin catechol EC atau ECG. Anehnya,
tidak ada penanda ion dengan struktur tipe theaflavin, yang akan menunjukkan koneksi B / B,
diidentifikasi dalam larutan EGCG / B2. Ini menunjukkan bahwa reaksi lebih cepat daripada
EGC dan produknya lebih maju dan dipolimerisasi.
Secara umum, dalam penelitian ini, ion penanda yang diidentifikasi melibatkan unit
ekstensi B2 terkait dengan EGC, ECG atau EGCG oleh cincin A dan yang dibentuk dengan unit
terminal B2 terkait dengan cincin B EGC, ECG atau EGCG. Ini konsisten dengan jumlah situs
nukleofil yang lebih tinggi pada cincin unit perluasan dibandingkan dengan unit terminal.
Akibatnya, unit perpanjangan B2 bereaksi lebih sebagai nukleofil (oleh cincin A) sedangkan
unit terminal B2 bereaksi sebagai elektrofil (oleh cincin B).
4.4 Deteksi penanda oksidasi dalam anggur
Semua penanda oksidasi yang dibahas yang diidentifikasi dalam solusi model diteliti
dalam anggur 'sederhana merah' yang diproduksi di unit eksperimental Pech rouge.
Berlawanan dengan proses pembuatan anggur putih, pembuatan anggur merah secara kritis
melibatkan ekstraksi komponen kulit, termasuk anthocyanin dan tannin kental.
Anthocyanin adalah pigmen merah dari varietas merah. Com-pound ini dapat juga
bereaksi dengan tanin. Oleh karena itu, untuk mengurangi kemungkinan reaksi, kami
memutuskan untuk menerapkan proses pembuatan anggur merah ke varietas anggur putih,
Grenache blanc. Dengan cara ini, anggur putih yang kaya tannin diproduksi. Fraksi tannin yang
berbeda diisolasi dari anggur ini dan dianalisis dengan metode MS setelah depolimerisasi
kimia seperti yang dibahas sebelumnya.
Karena tanin anggur-terkondensasi mengandung proporsi ECG dan EGC yang lebih
rendah daripada solusi model kami, tidak mengherankan bahwa tidak semua penanda untuk
EKG dan EGC terdeteksi dalam sampel ini.
5. Kesimpulan
Dalam penelitian ini, studi tentang solusi model yang mengandung blok bangunan
tertentu tanin anggur-kental (EGC dan ECG) diperbolehkan untuk identifikasi ion penanda
 baru. seperti pada produk oksidasi teh yang ditandai menggunakan NMR oleh ( kelompok
Tanaka). Spektrum massa fragmentasi memberikan bukti untuk benzotropolone moiety dan B
/ B hubungan antara EGC dan flavanol lain, struktur asli telah dicirikan dari reaksi quinone
asam galat dengan sebuah cincin dari unit flavanol. Identifikasi struktur ini di bawah bentuk
lakton menggarisbawahi sebagian hidrolisis ikatan ester EKG dan EGCG dengan waktu.
penelitian ini menunjukkan adanya perbedaan reaktivitas antara perpanjangan dan unit
terminal B2. Demikian, unit penyuluhan lebih terlibat dalam oksidatif kopling sebagai nukleofil
melalui cincin A sementara terminal unit lebih terlibat oleh cincin B melalui oquinone
elektrofil. Fraksi tannin ini akan digunakan untuk menyelidiki dampak oksidasi pada interaksi
tanin dengan makromolekul anggur. Kemudian memperluas identifikasi penanda oksidasi
yang dihasilkan oleh oksidasi produk anthocyaninsetin , namun analisis anggur Fraksi tannin
menunjukkan adanya banyak ion yang bisa tidak mudah diidentifikasi ini teragantung dari
oksidasi anggur.
6. Refensi
Moulus, Laetitia dan Fulcrand H., 2015, ‘Identification of new oxidation markers of grape-
condensed tannins by UPLCeMS analysis after chemical depolymerization’,
Elsevier.