Metode Kerja High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Kelompok A2 2015

1. Alat

Alat yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT (shimadzu) dengan kolom baja
tahan karat berisi Oktadesilsilana (C18); sonikator (sonica); penyaring membran PVDF 0,45
πm; penangas air; penyaring vakum; timbangan analitik (shimadzu); dan alat-alat gelas.

2. Bahan

Bahan yang digunakan adalah Acetonitril grade for HPLC; Aquabidest; Asam Sulfat
pekat; Baku Fenoksietanol; Baku Metil Paraben; Baku Propil Paraben; Etanol 96%; Metanol
grade for HPLC; Sediaan Handbody Lotion merek Emeron Lovely White.

Sampel uji (Handbody Lotion) yang digunakan terdapat dalam kemasan wadah botol
plastik dan masa kadaluarsa sampai 9 Februari 2021 dengan komposisi yaitu Water;
Isopropyl Palmitate; Glycerin; Stearic Acid; Dimethicone Ethanol; Pachyrrhizus Erosu Root
Extract; Ethanol; Cetearyl Alcohol; Dicaprylyl Ether; Triethanolamin; Glyceryl Stearate;
Titanium Dioxide; Niacinamide (Vit. B3); Ethylhexyl Methoxycinnamate; Buthyl
Methoxybenzoylmethane; Parfume; Mulberry (Morus alba Root) Extract; Methylparaben;
Propylparaben; Phenoxyethanol; Retinyl Palmitate (Vit. A Palmitate); Alumunium Starch
Octenysuccinate; Sodium Acrylates Copolymer; PPG-1 Trideceth-6; Acrylates/C 10-30 Alkyl
Acrylates Crosspolymer; Tocopheryl Acetate (Vit. E Acetate); Sodium Ascorbyl Phosphate
(Vit. C); Punica granatum Extract; dan Vitacinamide (Vitamin C + Niacinamide).

A. Pembuatan Pereaksi
a) Pembuatan Pelarut Campur Etanol : Aquabidest ( 9 : 1 )
b) Dimasukkan Etanol sebanyak 900 ml ke dalam labu tentukur 1000 ml
kemudian ditambahkan Aquabidest sebanyak 100 ml lalu dikocok sampai
homogen.
B. Pembuatan Fase Gerak Tetrahidrofuran : Aquabidest : Metanol : Asetonitril ( 5 :
60 : 10 : 25 )

Dimasukkan Tetrahidrofuran sebanyak 50 ml dalam labu tentukur 1000 ml

kemudian Aquabidest sebanyak 600 ml; Metanol sebanyak 100 ml dan Asetonitril
sebanyak 250 ml lalu dikocok sampai homogen.
3. Prosedur
A. Pembuatan Larutan Baku
- Ditimbang masing- masing Metil Paraben dan Propil Paraben sebanyak 25 mg
masukkan ke dalam labu tentukur 50 ml (500 ppm).
- Ditimbang juga Fenoksietanol sebanyak 100 mg masukkan ke dalam labu
tentukur 50 ml (2000 ppm).
- Kemudian masing-masing labu tersebut ditambahkan 25 ml pelarut campur
- Dikocok hingga homogen dan dicukupkan sampai garis tanda.
- Kemudian dari masing- masing larutan tersebut dipipet sebanyak 20 ml, 10 ml, 5
ml, 2 ml, dan 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu tentukur 50 ml dan larutan
tersebut merupakan larutan baku seri I, II, III , IV dan V.
- Ditambahkan 1 ml H2SO4 2M pada masing- masing labu tentukur
- Dicukupkan dengan pelarut campur sampai garis tanda.
- Dikocok hingga homogen.
- Disaring dengan penyaring membran dan larutan ini sebagai larutan A.

B. Persiapan Larutan Uji

- Ditimbang sebanyak 1 g sampel ke dalam erlenmeyer 250 ml.
- Ditambahkan 1 ml H2SO4 2M dan 50 ml pelarut campur
- Dikocok sampai homogen
- Dipanaskan diatas penangas air pada suhu (60±1)0C selama 5 menit
- Didinginkan sebentar pada temperature kamar
- Dimasukkan ke kulkas selama 1 jam
- Disaring dengan penyaring membran dan larutan ini sebagai larutan B.

C. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1) Pengaturan Kondisi Sistem

Diperiksa sistem untuk meyakinkan apakah sistem pengalir pelarut telah

disambungkan dengan baik, kolom telah dipasang, tersedia cukup pelarut di dalam
botol, penyaring pelarut dipasang dan detektor yang sesuai dipasang dengan benar.

2) Pembuatan Kurva Kalibrasi

- Disuntikkan setiap larutan baku ke dalam kromatograf dan rekam
kromatogram
- Dicatat dan dihitung rasio luas puncak larutan baku dengan larutan baku dari
kromatogram
- Dibuat kurva antara rasio luas puncak dengan konsentrasi larutan baku
masing- masing pengawet
- Ditentukan linieritas kurva kalibrasi masing- masing pengawet

D. Cara Penetapan Kadar

1) Disuntikkan masing- masing larutan A dan B secara terpisah dan lakukan
penetapan secara kromatografi cair kinerja tinggi dengan kondisi sebagai berikut:
- Fase Gerak : Tetrahidrofuran : Aquabidest: Metanol: Asetonitril (5:60:10:25)
- Kolom : Panjang 250 mm, diameter dalam 4,6 mm berisi oktadesi- Silana
(C18) dengan ukuran partikel 5 µm
- Laju Alir : 1,5 ml/ menit
- Suhu Kolom : 400C
2) Perhitungan kadar Metil Paraben dan Propil Paraben.