BahanAjarPengantarBiotekPertanian PDF

Kuliah I
Sejarah, Pengertian dan Kontribusi

Bioteknologi dalam bidang Pertanian: Konsep
sel sebagai produsen dalam Bioteknologi
Copyright Statement:
Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)
bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum
disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.
Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran
sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus
mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran
dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana
berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.
Cuplikan GBPP
No Tujuan Instruksional Pokok Bahasan Sub Pokok Bahasan Est. Daftar
Khusus Waktu Kepustakaan
1. Mahasiswa mampu Sejarah, Pengertian dan 1. Sejarah 15 menit 1, 6, 7
menje-laskan sejarah, Kontribusi Bioteknologi Bioteknologi
pengertian, dan dalam bidang Pertanian: 2. Pengertian 5 menit
kontribusi bioteknologi Konsep sel sebagai Bioteknologi dan
dalam bidang produsen dalam ilmu terkait dalam
pertanian. Mahasiswa Bioteknologi Bioteknologi
juga harus mampu 3. Kontribusi 60 menit
menjelaskan konsep sel bioteknologi dalam
sebagai produsen bidang pertanian
dalam persepektif 4. Konsep sel sebagai 20 menit
bioteknologi produsen dalam
bioteknologi
I. Sejarah Bioteknologi
Perkembangan Bioteknologi
Jaman sebelum Louis Pasteur
• Minuman beralkohol (Bir, anggur, tuak)

• Makanan terfermentasi (Keju, yoghurt,
tape,tempe, petis, terasi)
Jaman Louis Pasteur
• Alkohol (Etanol, Butanol, aseton, gliserol)
• Asam organik (Asam sitrat, asam asetat)
• Pengolahan limbah secara aerob
Jaman antibiotika
• Antibiotika (Penisilin, tetrasiklin,

streptomisin)
• Vaksin (Vaksin anti NCD, vaksin anti polio)
• Transformasi steroid (DOPA)
• Teknologi fermentasi media cair
• Teknologi biakan jaringan hewan
Jaman pasca antibiotika
• Asam amino (Asam glutamat, lisin,
aspartame)
• Protein sel tunggal
• Enzim (amilase, glukosa isomerase, glukosa
dehidrogenase)
• Teknologi imobilisasi sel dan ensim
• Teknologi pengolahan limbah cair anaerob
(Biogas)
• Polisakarida bakteri (Xanthan, Trehalosa)
Timeline Perkembangan Bioteknologi
Seleksi kuda (Babylonia-6000 SM): benih padi

:Cina; Gandum, jagung : Eropah dan Amerika
Perkembangan ilmu Genetika :

 Mendel (1822-1884)
 1843, Abbe` Napp (1843)
Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Tahun Kejadian penting
1865 Gen dianggap sebagai faktor partikulat
1900 Penemuan kembali hukum Mendel (Correns, Tschermak, de Vries)
1903 Khromosome adalah unit keturunan
1910 Gen-gen terletak pada kromosom
1913 Kromosome mengandung gen-gen yang tersusun secara linear
1927 Mutasi adalah perubahan physik pada gen
1931 Rekombinasi disebabkan oleh pindah silang
1944 DNA adalah materi genetik
1945 Gen adalah pengkode protein
1953 DNA berbentuk double helix (Watson dan Crick)
1958 Replikasi DNA bersifat semikonservatif
1961 Kode genetik tersusun secara triplet
1972 Kloning DNA ke dalam plasmid vektor
1976 Kloning gen pengendali insulin
Tahun Kejadian
1972 Dihasilkannya rekombinan DNA pertama dengan bantuan enzim Ligase,
Dihasilkannya organisme transgenik pertama oleh Cohen, et al.
1973 Ditemukannya teknik elektrophoresis dengan Agarose
1975 Sekuensing dengan metode pemutusan berantai
1975 Metode hibridisasi DNA
1977 Didirikannya perusahaan yang bergerak dalam teknologi gen: Genentech
1978 Diperkenalkannya RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
1981 579 gen manusia berhasil dipetakan diperkenalkannya Hibridisasi in-situ
1982 Genbank sekuens pertama didirikan
1983 Identifikasi pertama penyakit Huntington’s pada kromosom IV
1984 Diperkenalkannya Pulsefield Gel Elektroporesis (PFGE)
1985 Diperkenalkannya PCR (Polymerase Chain Reaction)
1987 Diperkenalkannya YAC (Yeast Artificial Chromosome)
1988 Didirikannya proyek pensekuenan genom manusia
1989 Peta lengkap pertama genome Hemophilius influenzae
1992 Peta tautan lengkap genome manusia pertama
Tahun Kejadian
1993 Diperkenalkannya ESTs (Expressed Sequences Tags), Dipublikasikannya
peta fisik pertama genome manusia
1995 Genom Haemophilus influenza dan Mycoplasma genitalium lengkap
disekuens
1996 Genom Saccharomyces cereviceae (Eukaryot) lengkap disekuens, juga
Eschericia coli , Methanococcus fannaschii (Archaeobacteria) lengkap
disekuens, Diperkenalkannya teknologi chip
1997 Dipublikasikannya peta fisik genom manusia yang lengkap
1998 Genom C. elegans selesai disekuens
1999 Genom Drosophila melanogaster selesai disekuens
2000 Genom Arabidopsis thaliana selesai disekuens
2000 Genome manusia H.sapiens selesai disekuens
2000 Genom Oriza sativa selesai disekuens
2002 Genom nyamuk Anopheles gambiae dan Plasmodium palcifarum
selesai disekuens
2. Pengertian Bioteknologi
• Bios : makhluk hidup
• Teknos : teknik/metode/prosedur
• Logos : ilmu pengetahuan
Definisi
CBD (Convention on Biological Diversity)
29 Desember 1993 –Rio de Janeiro:
• Bioteknologi adalah teknologi yang mengaplikasikan
penggunaan sistem biologis, organisme hidup, atau
turunannya untuk membuat atau memodifikasi
produk ataupun proses untuk tujuan tertentu.
• Interpretasi (luas) mencakup berbagai alat dan teknik
yang digunakan dalam berbagai kegiatan produksi
material.
• Interpretasi (sempit) berkaitan dengan teknik-teknik
DNA (Deoxyribonucleic acid) yakni material genetik
yang terdapat pada setiap organisme hidup, biologi
molekuler dan aplikasi-aplikasi teknik reproduksi.
Pengertian Bioteknologi dan Ilmu Terkait dalam
Bioteknologi Ilmu
Bidang Kajian
pendukung
sesuai bidang Pertanian
kajian Kedokteran
Peternakan
Farmasi
Biotek Teknologi pangan
nologi ?????????
Lingkungan
Kehutanan
Industri
Nanoteknologi
3. Kontribusi bioteknologi dalam bidang
pertanian
Penciptaan Varietas Resisten
• Resistensi terhadap Herbisida
Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman

transgenik pertama yang diusahakan secara komersial, dengan
alasan:
1.Relatif mudah untuk menghasilkannya
2.Gulma dapat menyebabkan 10-15% pengurangan hasil
3.Penggunaan herbisida yang tidak saja mahal, akan tetapi juga
tidak ramah lingkungan.

Herbisida Total X Herbisida Selektif
•Meracun terhadap semua jenis •Aktif pada dosis tertentu

tumbuhan terhadap tumbuhan tertentu
dengan karakter morfologi dan
fisiologi tertentu
•Cepat terurari di tanah
•Persistensi lama di tanah dan
•(Phosphinothricin, Basta=(WP) air.
PPT/10 hari), Glyphosat (Round up
•Atrazin, Bromoxynil, 2.4-D
(WP)/3-60 hari)

Penciptaan Tanaman Resistensi terhadap Herbisida
Herbisida Basta ®
Sumber gen Resisten: gen bar- dan gen pat- diisolasi dari
Bakteri tanah Streptomyces hygroscopicus dan S. viridochromogenes
Mutan Lucerne (Medicago sativa) gen toleran terhadap Basta
Produk: Phosphinothricin-acetyltransferase
Fungsi: detoksifikasi melalui proses acetilasi
Promotor: 35S-Promotor dari CaMV
Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai

Glyphosat
Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor)

dari A. tumifaciens strain CP4 (mutant)
Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Kapas, kentang, Jagung, kedelai, tembakau dan gandum
1996-1997 (USA):
Tanaman transgenik resisten herbisida menurunkan penggunaan herbisida
22-26%.
Erosi tanah menurun 90%, peningkatan produksi 5%
Problem :
kekuatiran tentang penyebaran gen herbisida resisten, dicoba
penggunaan plastida sebagai target untuk pengintegrasian gen asing

Resistensi terhadap herbisida

Resistensi terhadap Serangga
Pertimbangan:
Penggunaan insektisida yang jelas selain tidak ekonomis juga tidak ramah
lingkungan
Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga
Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin
European corn borer

Tanaman: Kapas, kentang, jagung, tomat
Keuntungan:
Kapas: penghematan insektisida 3,6 juta
liter, produksi 7% meningkat
Jagung : 300.000 kg (10%)
Western corn rootworm

Resistensi terhadap Serangga

Problem:
Ada serangga yang resisten terhadap δ_endotoxin,
Strategi lain:
Serin-Proteinase-inhibitor (menghambat enzim
pencernaan)

Resistensi terhadap Virus
Cross protection
Coat protein gen ditransfer sebagai pelindung thdp. virus asing
Source: www.apsnet.org

R-Gene (-Resistent Gen)
Resistensi terhadap Bakteri dan jamur
200 jenis bakteri bersifat pathogen (prokaryot)
8000 jenis jamur bersifat pathogen (Eukaryot) (100.000 jenis
nonpathogen)
Pathogen Tanaman Inang Gejala Penyakit
Bakteri
Agrobacterium tumifaciens Tumbuhan dikotil Pembentukan tumor
Erwinia amylovora Apel, peer
Pseodomonas syringae pv. lachrymans Timun Bercak daun
Streptomyces scabies Kentang Bisul
Xanthomonas oryzae pv. oryzae Padi Blast
Jamur
Ophiostoma novo-ulmi Ulm Mati ulm
Phytoptora infestans Kentang Busuk umbi
Puccinia graminis Gandum Karat hitam

Kerusakan akibat Jamur dan Bakteri:
• Kerusakan morfologis, fisiologis

• kontaminasi (mycotoksin) didalam bahan makanan dalam jang-
ka panjang bersifat carcinogenic
Kasus Phytoptora infestans
Tanaman kentang di USA (1845),

kelaparan terparah di dunia sehingga
menyebabkan migrasi besar-besaran
dari Irlandia ke USA
Strategi:
- Chitinase untuk mencerna lapisan chitin dinding sel jamur (spesifik)
- α-Thionin terhadap Pseudomonas syringae, dan Fusarium oxysporum

Strategi
- Gen Cholinoxygenase dari bakteri Arthrobacter globiformis
menghasilkan Transgenik Arabidopsi thaliana toleran terhadap
kadar garam tinggi (Glycinbetain)
- Mannitol-Dehydrogenase (E. coli )menyebabkan akumulasi
mannitol yang bisa meningkatkan toleransi terhadap
kekeringan pada tanaman tembakau
- Quicsilberreduktase (bakteri) pada tanaman Liriodendron
tulipifera meningkatkan toleransi terhadap logam perak
- Gen Metallothionin pada tanaman tembakau meningkatkan
resistensi terhadap logam Cadmium

Toleran terhadap stress lingkungan (abiotic-stress)
• Panas,
• Dingin,
• Kekeringan
• Kadar Garam yang tinggi
• Kekurangan mineral
• Logam berat
• Radiasi UV-B

Gene glutathione dari E. coli
berperan dalam chelating untuk
mengurangi keracunan pollutant.
Deteksi pollutant
Rumput lapangan golf
 Tahan herbisida
 Tumbuh lambat
mengurangi pemangkasan
mengurangi polusi
Bio Steel
 Jaring laba-laba adalah protein terkuat
 Protein penyusu jaring laba-laba
diekspresikan di bulu domba
 Hasilnya utuk membuat baju tahan
peluru (Nexia)
Deteksi Ranjau Darat
Dibutuhkan oleh Angkatan Darat,
Tanpa upaya ini,anak-anak dan penduduk sipil terancam
Bantuan Bioteknologi Tanaman
(dikembangkan oleh Aresa Biodetection)
• Gen yang peka terhadap logam dimasukkan ke dalam
tanaman
• Apabila akar tanaman menyentuh ranjau darat,
Tanaman berubah warna dari hijau menjadi merah
Mendeteksi ranjau darat

Perubahan pada bahan makanan
Negara berkembang: kekurangan pangan
Negara Maju : Alergi, kualitas bahan makanan, transportasi
Strategi
- Gen AGPase (ADP-Glucose-phsoporilase) dari E. coli digunakan untuk
meningkatkan kandungan pati pada tanaman kentang
Sebaliknya teknik ekspressi antisense
Dihasilkan kentang yang menghasilkan amylopketin, tapi tanpa amylosa
(penting untuk industri)
- Gen Thioesterase dari Umbellularia californica dapat meningkatkan kandungan
Laurat pada tanaman Raps, berguna dalam pembuatan margarin

Perubahan pada bahan makanan
Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

- Pada tanaman padi dihasilkan tanaman transgenikj yang
mampu menghasilkan kadar β-Carotin yang tinggi. Untuk itu
empat macam gen pengkode empat macam enzim
diintegrasikan:
- Phyton-Synthase, Phytoen-Desaturase, ζ-Carotin-Desaturase
dan Lycopen-ß-Cyclase.
- Golden Rice

Rasa dan Daya Simpan
• Polygalacturonase dengan teknik antisense
dapat diinaktifkan dan daya simpan
menjadi lama.
• Tomat dengan tanda Flavr Savr®.
Bahan baku industri
•Poly (3HB) = PHB untuk menghasilkan materi
bioplastik. Berhasil dicobakan pada plastida
tanaman Arabidopsis thaliana dari gen
Ralstonia eutropha
Source: Wikipedia
E. coli
Produksi Metabolik Sekunder
• Alkaloid : Morphin = Atropin (Papaver somniferum)
Taxol untuk kanker dari Taxus brevifolia
• Bahan untuk imunisasi: Gen spaA menghasilkan
protein yang mampu mencegah karies gigi
proteins such as growth hormones, insulin, blood

substitutes, and trypsin inhibitor
Promega-3 fatty acid not from fish
PENGANTAR PEMULIAAN TANAMAN
Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY
RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar

Tumbuhan Normal Tumbuhan Steril (MS)
TA29 Barnase TA29 Barnase

TA29 Barstar
Barnase + Barstar
Barnase
Degradasi RNA di tapetum
Tapetum mati
Tapetum hidup
Pollen tidak terbentuk

Pollen terbentuk normal
Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA
References:
1. Hayward, et al. (1993). Plant Breeding-principles and prospects. Chapman & Hall.
2. Fehr, W.R. (1987). Prnciples of cultivar development. Macmillan Publishing. Co. New York.

SELEKSI BERPANDUAN PENANDA
MARKER ASSISTED SELECTION (MAS)

Penanda Morfologis
Catharanthus roseus

Sistem Penanda AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Sistem Penanda STS (Sequences Tagged Sites)
CAPs (Cleavage Amplified Polymorphisms)
Mm m fmm mf mmm f f m mmm V Mm MM mm Mm MM mm

A
400 bp
211 bp
430 bp 152 bp
104 bp
85 bp
20-39 bp
STS B 104 bp 189 bp 341 bp 361 bp
ASP2-SP6 (M) 400 bp

104 bp 85 bp 152 bp 20 bp 39 bp
C 104 bp 189 bp
ASP2-SP6 (m) 400 bp

104 bp 85 bp
CAPs

Sistem Penanda SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

4. Konsep Sel Sebagai Produsen
Peluang pemanfaatan sel sebagai produsen dengan menggunakan potensi

bioteknologi
Kultur starter Enzim: untuk mencerna

lemak, selulose, protein, Antibiotika,
protein, aroma
buatan, bahan pati, hormon, enzim,
pengawet, Zat bahan, imunisasi,
perasa, Konversi
inhibitor,
konsentrat bahan mentah Produksi
Produksi
bahan obat- antibodi,
bahan
obatan
makanan Sel vitamin
Sebagai
Produsen Teknik
Protein pa- Produk Lingkungan dan
Pertanian Energi alternatif
kan ternak, Degradasi dan
Asam amino, Bahan baku perubahan
vitamin silase, dalam industri kontaminan
Biopestisida, berbahaya untuk
Tanaman Enzim pencuci, kosmetik, pembersihan
resisten, Plastik dan pembungkus sampah. Biogas,
metabolik ramah lingkungan,
sekunder

Selesai
Tugas
• Buatlah essai singkat (1 halaman folio) tentang
kemungkinan aplikasi bioteknologi dalam
bidang pertanian untuk berbagai macam tujuan.
• Thema yang digunakan tidak dibenarkan sama,
material kajian harus berbeda.
• Tulis dengan kalimat sendiri, bila menggunakan
kalima orang lain maka sumber harus dituliskan!
• Kumpul tanggal: 29 Agustus 2012, sebelum
kuliah dimulai.
Materi II.
Struktur Detail dan Fungsi

Molekul Genetik:
DNA, RNA dan Protein.

Copyright statement:

gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas) bahan
kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum
disini memiliki hak eksklusif intelektual. Penggunaan
diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana
disepakati dalam pemberian material harus
mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan
pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi
hukum sebagaimana berlaku dinegara kesatuan
Republik Indonesia.
Sub Pokok Bahasan
1. Struktur detail sel dan organel-
organelnya
2. Struktur detail dan fungsi DNA
3. Struktur detail dan fungsi RNA
4. Struktur detail dan fungsi protein
Tujuan Instruksional
Mahasiswa mampu menjelaskan

struktur detail DNA, RNA, dan
Protein
1.
Struktur detail sel dan organel-
organelnya
1. Struktur detail sel dan organel-organelnya
Liver Cell
Structure of an animal cel

Lokasi materi genetik DNA dan RNA (eukaryot)
N N
C M
M
M
S S
Tumbuhan Hewan
Lokasi materi genetik DNA dan RNA (prokaryot/virus)
Bakteri Virus
Dogma Sentral
Materi Proses Lokasi
DNA (Gen) Nukleus
Transkripsi
mRNA Nukleus/Sitoplasma
Translasi
Protein Nukleus/Sitoplasma
/organel lainnnya

Materi Genetik

Materi Genetik
Idiogram kromosom manusia

Materi Genetik
Source: Reamon Büttner, S.M.
Analisis FISH dengan berbagai probe

STRUKTUR HALUS MATERI GENETIK

2. Struktur Halus Materi Genetik


MATERI GENETIK
H
H H
Nukleotid 3‘
O
Timin
Ikatan hidrogen
5‘
H C H
O
C C H H
O
T
N N A
H Adenin
C C
N
N C
O C H
C C
Dioxyribosa H N
N
C
G
Ikatan hidrogen G
Citosin H C
H C
N H
C C
O
N N
C C Guanin T
N
N C A
O C H
C C
H
Dioxyribosa N N
N
H
C
G
3‘
5‘
Materi Genetik

Struktur Double Helix DNA menurut Watson dan Crick

Materi Genetik
20Å (2,0 nm)
34Å (3,4 nm)

Materi Genetik
Sekuens DNA 8 genotipe beet gula

telomer
repetitiv sekuens
daerah kaya gen
sentromer

Panjang rata-rata sebuah

gen ~ 1,2 kb
< 1 kb = 1000 bp
> 32 kb = 10.000 bp
Prokaryot: tidak mengandung intron

Eukaryot : Mengandung Intron

3. Struktur detail dan fungsi RNA
Ekspresi Genetik
Gen A
Exon Intron Exon Intron Exon
5‘ 5‘
3‘
E P Sekuens DNA
3‘
Titik start Titik stop
Transkripsi
m-RNA sementara
Pemisahan intron
m-RNA matang
Nukleus
Sitoplasma
Translasi
Protein

Materi Genetik

Materi Genetik
Pita atas
5‘ ACTGTTGCACCGGTTATATAGCGTAAGTCAGTCTCGA
3‘ TGACAACGTGGCCAATATATCGCATTCAGTCAGAGCT
Pita bawah
Sintesis mRNA
5‘ ACUGUUGCACCGGUUAUAUAGCGUAAGUCAGUCUCGA 3‘
Sintesis cDNA (Reverse transkriptase)
5‘ACTGTTGCACCGGTTATATAGCGTAAGTCAGTCTCGA 3‘

TRANSKRIPSI
Coding strand = sense
Template strand = antisense
Transkripsi

BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2005-2006
mRNA pada Eukaryot

Struktur cap yang terbentuk pada ujung 5‘ mRNA
eukaryot
NH2
O CH3
C N
C N C
HN
HN C CH
CH HC C
C C O O O N N
N N
H2N NH2
CH2 O P O P O P O CH2
C N
O O O HN C
OCH3 CH
HC C
O N N
O P O CH2
O
OCH3
O
O P O

Siklus
min Transkripsi mulai
RNA polymerase RNA polymerase
min Transkripsi mulai
0 <1
mRNA ppp
pp Modifikasi ujung 5‘
p
Ribosom memulai translasi 6 Ujung 3‘ mRNA dipotong dan dilepaskan
0,5
a. Bakteri
b. Eukaryot
ppp
Degradasi dimulai pada ujung 5‘ 20 Ujung 3‘ dipoliadenilasi
1,5
AAAAAA
ppp
25 mRNA ditransport ke dalam sitoplasma

2,0 RNA polymerase berhenti di ujung 3‘
AAAAAA
ppp
3,0 Degradasi mRNA berlanjut, ribosom menyelesaikan translasi
> 4 >h
hr Ribosom mentranslasi mRNA
AAAAAA
ppp

tRNA
tRNA adalah adapter yang menghubungkan
antara mRNA dengan asam amino.
Ciri-ciri penting:
1.Setiap satu tRNA mewakili satu jenis asam
amino yang berikatan secara kovalen.
2.Mengandung sekuens trinukleotid antikodon
berkomplementer dengan kodon yang
mencerminakan asam aminonya.

Asam
tRNA amino
5‘
Base-paired stem
Single stranded loop
Anti codon-codon pairing
mRNA

NH2
H
R C
C =O
O OH
Asam
Ujung 3‘ tRNA
amino O
CH2
5‘
tRNA
Base-paired stem
Single stranded loop
Anti codon-codon pairing
mRNA
Any base
A
Invariant
C
Semi invariant
C
Sometimes absent
73
1 72
Lengan penerima
2 71
3 70
4 69 Lengan TΨC
Lengan D 5 68
6 67
59
16 U* 7 66 Py A*
17 Pu C
9 65 64 63 62
17:1 A Pu
G* 13 12 Py 10 C
49 50 51 52 G
T
G Py Ψ
22 23 Pu 25
20 A 47:16
20:1 20:2 26
47:15
27 43 Lengan extra
44
28 42 45
29 41 46
47
30 40
47:1
31 39
Py* 38
U Pu
34 36
Antikodon 35

Modifikasi basa pada tRNA

Modifikasi basa yang terjadi pada tRNA mempengaruhi
kemampuan „pairing“.
O O
O O
C H C
C C
HN CH CH3 HN NH
HN C H HN C
C CH CH
C C H C CH C
O
N O O O
N N N
H
Uridine
Dihydrouridine (D) Ribothymidine (T) Pseudouridine (v)

NH2 NH2
NH
CH3 C
C C CH3
N CH N C
N CH
CH C CH
C C CH
O
O O N
N N
3-methylcytidine 5-methylcytidine
Cytidine
NH2 O
C C
N N
N C N C
CH CH
HC C HC C
N N
N N
Adenosine Inosine

rRNA (ribosomal RNA)
Karakteristik rRNA
Berada dalam ribosom

(ribonucleoprotein)
Ukuran ribosom ditentukan oleh tingkat
pengendapannya, diukur dengan satuan
S (Svedbergs).
Ribosom bakteri ~70S, sedangkan
eukaryot memiliki nilai sedimentasi
~80S.
Struktur 30S subunit

Kaya RNA
Kaya Protein
S11
S18 S6
S7 S21 S15 S17
S13 S19 S9 S1 S2 S16
S20 S12 S8
S14 S10 S3
Ujung 5‘
Ujung 3‘
Domain protein Domain pusat rRNA
Domain 3‘ rRNA Domain 5‘ rRNA

• Pada sub unit kecil (30S) bakteri, terdapat

jenis 16S rRNA & 21 protein. Sedangkan
unit besarnya (50S) mengandung 23S
rRNA dan 5S rRNA serta 31 protein.
• Pada eukaryot: terdapat 18S rRNA dan
28S rRNA serta protein yang lebih banyak.

Ribosom rRNA Protein
Bakteri
50S 70S 23S = 2904 basa 31
Masa= 2,5 x 106 D
66% RNA
5S = 120 basa
30S 21
16 S = 1542 basa
Mamalia
60S 80S 28S = 4718 basa 49

Masa= 4,2 x 106 D
60% RNA
5,8S = 120 basa
40S
5S = 120 basa
18S = 1874 basa 33

Fungsi rRNA dalam sintesis protein
• Ujung 3‘ rRNA berinteraksi secara langsung

dengan mRNA pada tahap inisiasi
• Daerah spesifik 16S rRNA berinteraksi secara
langsung dengan derah antikodon tRNA
• Interaksi subunit melibatkan baik 16S dan 23S
rRNA, meskipun belum jelas apakah interaksi
terjadi secara langsung antara RNA-RNA atau
RNA-protein.

4. Struktur detail dan fungsi protein

PROTEIN
Komponen esensial untuk organisme hidup
Jenis protein:
Protein sederhana : hidrolisis menghasilkan hanya asam
amino
Protein majemuk : hidrolisis menghasilkan asam amino
dan senyawa lain (organik –non
organik = gugus prostetik)

Klasifikasi protein sederhana
Nama Sifat Kelarutan
Albumin Larut dalam air, dapat diendapkan oleh garam
dengan kadar tinggi
Globulin Tidak larut dalam air murni, larut dalam garam
encer, tetapi tidak larut dalam larutan garam ¼
atau ½ jenuh.
Glutelin Tidak larut dalam larutan netral, tapi larut dalam
larutan basa atau asam encer
Gliadin Tidak larut dalam air atau etanol absolute, tapi
(Promalin) larut dalam etanol 70-80%
Histon Larut dalam air, tidak larut dalam larutan amonia
encer, histon bersifat basa
Protamin Larut dalam air dan bersifat basa (lebih basa dari
histon), dan berupa protein kecil.
Klasifikasi Protein Majemuk Berdasar Gugus Prostetiknya
Nama Gugus Prostetik

Nukleoprotein Asam Nukleat
Glikoprotein Karbohidrat
Phospoprotein Phospat
Lipoprotein Lipid
Khromoprotein Zat Warna (pigmen)
Flavoprotein Flavin nukleotida
Flavoprotein sering dimasukkan kedalam kelas khromoprotein, karena
flavin juga berwarna

Asam Amino sebagai Molekul Dasar Protein
R C COOH
NH2

BIOLOGI MOLEKULER. Smester Genap 2004-2005 Asam Amino
Simbol-simbol untuk asam-asam amino penyusun protein
No. Asam amino Simbol 3 huruf Simbol 1 huruf
1. Alanin Ala A
2. Arginin Arg R
3. Asparagin Asn N
4. Asam aspartat Asp D
5. Asn + Asp Asx B
6. Sistein Cys C
7. Glutamin Gln Q
8. Asam Glutamat Glu E
9. Gln + Glu Glx Z
10. Glisin Gly G
11. Histidin His H
12. Isoleusin Ile I
13. Leusin Leu L
14. Lisin Lys K
15. Methionin Met M
16. Phenilalanin Phe F
17. Prolin Pro P
18. Serin Ser S
19. Threonin Thr T
20. Tirosin Tyr Y
21. Valin Val V
22. Triptophan Tri

Struktur Kimia Senyawa Poplipeptida
Ujung N/N terminal Ujung C/C terminal

H2N– AA1—AA2—AA3—AA4—AAn-2—AAn-1—AAn--- COO
g N (amino) Ujung C (kar
Klasifikasi protein berdasar fungsi biologisnya
Golongan Fungsi Biologis
1. Enzim Mengkatalisis reaksi-reaksi biokimia, misalnya ribonuklease, tripsin,
amilase, dll.
2. Protein cadangan Disimpan sebagai bahan cadangan , misalnya gliadin, dalam gandum,
zein dalam jagung, ovalbumin dalam putih telu
3. Protein transpor Mentransfor zat-zat atau unsur tertentu, seperti hemoglobin untuk O2,
albumin serum untuk asam lemak dll.
4. Protein kontraktil Untuk kontraksi jaringan-jaringan tertentu misalnya miosin untuk
kontraksi otot, dinein untuk kontraksi cilia dan flagellata
5. Protein pelindung Melindungi tubuh terhadap agen-agen asing, seperti zat antibodi,
dalam darah mamalia fibrinogen dll.
6. Toksin Racun-racun yang berasal dari hewan atau tumbuhan, seperti risin
(racun dalam beras), racun ular, dll.
7. Hormon Senyawa yang berfungsi sebagai pengatur proses hidup dalam tubuh,
seperti insulin, hormon pertumbuahan, dll.
8. Protein struktur Protein penyusun struktur sel, jaringan dan tubuh organisme, seperti
glikprotein untuk dinding sel, keratin untuk rambut, bulu, skleretin
untuk bagian luar serangga , dll.

Sintesis Protein = Expressi Gen
Dua Proses Utama:
1.Transkripsi : proses menghasilkan RNA pita
tunggal yang identik dengan salah satu pita
dari pita ganda DNA.
2.Translasi : proses perubahan sekuen asam
nukleat RNA kedalam sekuens asam amino
penyusun protein.

Basa pertama Basa kedua
U C A G
U UUU
UUC
Phe UCU
UCC Ser
UAU
UAC
Tyr UGU
UGC
Cys
UUA Leu UCA UAA STOP UGA STOP

UUG UCG UAG UGG Trp
C CUU
CUC Leu
CCU
CCC Pro
CAU
CAC
His CGU
CGC
Arg
CUA CCA CAA Gln CGA

CUG CCG CAG CGG
A AUU
AUC
Ile ACU
ACC Thr
AAU
AAC
Asn AGU
AGC
Ser
AUA ACA AAA Lys AGA Arg

AUG Met ACG AAG AGG
G GUU
GUC Val
GCU
GCC Ala
GAU
GAC
Asp GGU
GGC Gly
GUA GCA Glu GGA
GUG GCG GGG

Daftar asam amino, simbol 3 dan 1 huruf serta karakteristik masing-masingnya.
Karakteristik berdasar
Asam amino Simbol 3 huruf Simbol 1 huruf
gugus R
Alanin Ala A hidropobik
Arginin Arg R Basa
Asparagin Asn N Netral
Asam aspartat Asp D Asam
Asn + Asp Asx B
Sistein Cys C Asam
Glutamin Gln Q Netral
Asam Glutamat Glu E Asam
Gln + Glu Glx Z
Glisin Gly G -
Histidin His H Basa
Isoleusin Ile I Hidropobik
Leusin Leu L Hidropobik
Lisin Lys K Basa
Methionin Met M Hidropobik
Phenilalanin Phe F Hirdopobik
Prolin Pro P Hidropobik
Serin Ser S Netral
Threonin Thr T Netral
Tirosin Tyr Y Netral-Hidropobik
Valin Val V Hidropobik
Triptophan Tri W Hidropobik
Asam amino tidak spesifik X
Struktur Protein
Struktur primer, yakni struktur protein
berdasarkan sekuen asam amino
penyusunnya.
GFP-Sekuens (238)
• MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFIC
TTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQ
ERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEY
NYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIG
DGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDE
LYK
Struktur sekunder
• Struktur yang
terbentuk oleh
adanya ikatan
hidrogen antara
rantai utama
peptida.
Struktur tertier
Struktur tiga dimensi
dari molekul protein
tunggal.
Struktur tiga dimensi
akan ditentukan oleh
interaksi hidrofobik
non spesifik antara
struktur α-heliks
dengan struktur pita-β
membentuk struktur
globular.
Struktur quartener
• Struktur yang
terdiri dari
beberapa
macam sub
unit ikatan
polipeptida
ataupun
protein.
Structure of human hemoglobin, source: Wikipedia

Struktur Protein
SELESAI

Bioteknologi Tanaman
Dasar-Dasar
Teknik Analisis Molekuler


2.1. Isolasi DNA

2.1. Isolasi DNA
Tujuan :
Membebaskan molekul DNA didalam sel tanpa merusak
keutuhan molekul DNA, (protein histon, inti sel, dinding sel).
Hal Penting yang harus dipertimbangkan

1. Keutuhan ukuran molekul DNA
2. Efektifitas isolasi
3. Kemurnian DNA hasil isolasi
4. Praktis dan ekonomis

Langkah-Langkah Isolasi
1. Pemecahan sel dari jaringan:

cara: Mekanis , dengan menggerus jaringan (akar, daun, batang dll)
kimiawi , dengan menggunakan enzim spt. sellulase, pektinase,
dan lain-lain.
Pemurnian dilakukan dengan cara lisis menggunakan deterjen spt:
SDS = Sodium Duodecyl Sulfonat
CTAB = Hexadecyltrimethyl ammonium bromide
2. Deproteinase:
cara : Proteinase K, Phenol yang dilanjutkan dengan mengendapkan-
nya dengan Chloroform dan isoamylalkohol

3. Pemanenan DNA:
Cara: Kromatografi adsorpsi, Kromatografi pertukaran ion, Presipitasi
dengan, isopropanol ataupun alkohol
Isolasi juga dapat dilakukan dengan Kit Isolasi tetapi

harganya mahal
Kontrol Kualitas:
Cara :
Teknik elektrophoresis standar menggunakan gel agarose

Contoh hasil analisis kualitas DNA dengan elektrophoresis

standar
25 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Sumber DNA Genomik asparagus, dokumentasi Jamsari

2.3. Elektroporesis

Electrophoresis:
Proses pemisahan molekul-molekul dengan
menggunakan arus listrik
Bedakan dengan :
Electrophoration
Diperkenalkan tahun 1973 bersamaan dengan penemuan agarose

(Sambrook, et al. 1973)

Prinsip:
DNA bermuatan negatif, karena itu mengalir dari negatif menuju positif
Molekul besar bermigrasi lambat, molekul kecil bermigrasi cepat
Power Supply
Horizontal electrophoresis Vertical electrophoresis

Gambar Bak Elektrophoresis
Sumber: Bio Rad (Jerman)

Faktor penentu laju migrasi

1. Berat molekul,
2. Konsentrasi gel,
3. Bentuk konformasi dari molekul DNA,
4. dan kekuatan arus listrik
1. Berat molekul,
Semakin berat semakin lambat

2. Konsentrasi gel,
Kisaran daya pisah molekul DNA pada berbagai konsentrasi gel agarose
Kisaran molekul DNA dalam bentuk linear

Konsentrasi agarose (% [w/v]) yang efisien untuk dipisahkan (kb)
0,3 5,0 - 60,0
0,6 1,0 - 20,0
0,7 0,8 - 10,0
0,9 0,5 - 7,0
1,2 0,1 - 6,0
1,5 0,2 - 3,0
2,0 0,1 - 2,0
Methaphore gel untuk molekul DNA berukuran kecil < 0,3 kb

polyaccrylamid gel (PAGE). Acrylamid dan Methylenbisacrylamid untuk

memisahkan dengan resolusi beberapa basa
Kisaran efektif pemisahan molekul DNA pada berbagai konsentrasi PAGE
Kisaran molekul DNA Xylen Xyanol Bromophenol Blue

Konsentrasi yang efisien untuk
PAGE [%(w/v)] dipisahkan (bp)
3,5 1000 - 2000 460 100

5,0 80 - 500 260 65
8,0 60 - 400 160 45
12,0 40 - 200 70 20
15,0 25 - 150 60 15
20,0 6 - 100 45 12

Contoh Penggunaan PAGE

M 123 4 5
300 bp
200 bp
100 bp
Sumber: Jamsari

Power Supply Pengatur arah arus
Pompa pendingin
-
- -
120°°
+ +
+
PFGE (Pulse Field Gel Elektrophoresis).

Penentuan besar ukuran insert 20 klon BAC terpilih yang dirunning dengan
menggunakan PFGE setelah dilakukan pemotongan enzim NotI
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
145.0 kb
97.0 kb
48.5 kb
23.1 kb
6.5 kb
Sumber: Jamsari

SELESAI
2.3. Enzim Restriksi


2.2. Enzim Restriksi
Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan

bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,
internal = endonuklease
Aktifitas:
Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA

3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III

Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama
Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda
Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan

Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan
dengan cutting site (titik pemotongan)
Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide)
Contoh:
4: AfaI ; GT AC ; 37°C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65°C-15 menit
6: Eco RI; G AATTC; 37°C; Escherichia coli H709C; 60°C-15 menit
8; Not I; GC GGCCGC; 37°C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol

Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease
C T G A T G A A T T C C G T EcoRI
G A C T A C T T A A G G C A
Ujung kohesif C T G A T G A A T T C C G T
G A C T A C T T A A G G C A
Cohesive end
G A T G A T G A A T T C C G T MseI
C T A C T A C T T A A G G C A
B G A T GA T G A A T T C C G T
C T A C T A C T T A A G G C A
Ujung tumpul
Blunt end

Analogi Pemotongan Enzim Restriksi
Enzim A Enzim B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
A B AB
20,0
11,5
11,0
7,0
3,0
2,5
1,0
Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA

M V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
12 kb
6 kb
3 kb
2 kb
1,6 kb
DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari

Frekuensi pemotongan = 4n
4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT)
N = jumlah sisi pengenal spesifik
Contoh :
EcoRI, hexanukleotid , maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 46
basa = 4096
Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000,
akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan
EcoRI,
Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment

Transfer Asam Nukleat

Southern Transfer (DNA)
Northern Transfer (RNA)
Western Transfer (Protein)

Transfer Asam Nukleat
Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977)
Pemberat
Tumpukan kertas penghisap
Membran selulosa Bahan penghisap larutan alkali
Bak berisi larutan alkali

Gel tempat DNA

Hibridisasi Asam Nukleat
Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe)

yang sudah diketahui identitasnya
Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita
miliki (70-100%)
Sumber Probe:
1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih.
2. Pustaka cDNA
3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)

Langkah-langkah Proses Hibridisasi
Hibridisasi
dengan Probe
Restriksi Agarose gel Nylon membran Röntgen Film


Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi
dengan DNA genomik tanaman asparagus,
Sumber, Jamsari

Selesai
KULIAH V
PCR,
Sekuensing


PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Reaksi Berantai Polymerase

PCR
PCR : Reaksi amplifikasi/penggandaan molekul DNA secara in-

vitro dengan menggunakan bantuan enzim Taq-Polymerase
Prinsip Kerja Mesin PCR:

menyediakan kondisi reaksi optimal untuk terjadinya denaturasi
ds-DNA, pengikatan primer (annealing), dan ekstensi primer
dengan menggunakan molekul dNTPs bebas melalui bantuan
enzim Taq-Polymerase.

PCR
Ditemukan oleh: Kary Mullis pada tahun 1984-5 (USA)
Gambar: T-Gradient PCR produksi Biometra-

Gmbh.-Jerman

PCR
Taq-Polymerase ditemukan oleh: David Gelfant dan Susanne Stoffel
Diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
Prasyarat:
1. DNA Template, DNA yang akan diamplifikasi
2. Primer (Oligonukleotida), (8-35 basa nukleotid) (spesifik,
arbitrary).
3. Enzim Taq-Polymerase, untuk mensintesis (memperpanjang
rantai DNA dengan kecepatan 150 nukleotid/detik.
4. dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP, dATP), baik yang mixed atau single
5. MgCl2

PCR
Siklus 3
Siklus 2
5‘ 3‘
Primer /
Oligonukleotid
3‘ 5‘ Siklus 1
5‘ 3‘
Templet
3‘ 5‘

PCR

PCR
Suhu Annealing
Tm = ((G+C) x 4°C) + ((A + T) x 2°C).
Contoh:
CATAAGTCTGATACTTGCTG
dimana:
jumlah basa C = 4, G = 4, A = 5, T = 7,
maka besarnya Tm adalah:
Tm = ((4+4)x4) + ((5+7)x2) = 32 + 24 = 56°C
suhu annealing sekitar 54-58°C

PCR
Primer yang ideal :
1. Memiliki panjang sekitar 15-35 nukleotid

2. Memiliki titik didih yang relatif tinggi
3. Sekuens primer hanya hadir satu kali pada templet DNA
4. Tidak berkomplementer dengan primer pasangannya
5. Tidak membentuk struktur sekunder dengan primer pasangannya
6. Memiliki proporsi GC dan AT yang seimbang
7. Primer pasangannya memiliki titik didih yang relatif sama
Oligos V. 3.0
Universitas di Helsinki, Finlandia (Kalendar, 2002 )

PCR
Jumlah perbanyakan molekul DNA sintetis
X = 2n
Dimana:
X = Jumlah molekul yang dihasilkan setelah n siklus

n = Jumlah siklus yang digunakan
Contoh :
Jika n = 30, maka jumlah molekul yang dihasilkan adalah:
1.024.000.000
Sekuensing
Teknik identifikasi urutan nukleotida-nukleotida dari susunan DNA
Diperkenalkan pada tahun 70-an oleh

Maxam dan Gilbert, kemudian disusul oleh Sanger
et al (Nobel, 80-an)
Teknik Maxam dan Gilbert disamping sangat

complicated juga banyak menggunakan bahan kimia
yang toxic, karena itu teknik dari Sanger dianggap lebih
efisien dan berkembang sampai saat ini
Prinsip Sekuensing Metode Sanger
Chain termination method
• Menggunakan ddNTPs sebagai DNA chain

terminator
• Komponen yang dibutuhkan:
1. single-stranded DNA template,
2. DNA primer,
3. DNA polymerase,
4. radioactively or fluorescently labeled nucleotides
5. modified nucleotides that terminate DNA strand
elongation (ddNTPs)
Semi Automated Sekuensing
5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
3‘ ACGTAACTTATACTGCAACTGATCGATTGCAAATTGAT 5‘
+ TGCATTG
5‘ TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACTA 3‘
TGCATTG
+ Polymerase; dA, dC, dG, dT, ddT
TGCATTGAAT
TGCATTGAATAT
TGCATTGAATAAGACGT
… dst …
TGCATTGAATATGACGTTGACTAGCTAACGTTTAACT
Full Automated Sequencing
(Dye-Terminator Sequencing)
Sumber: Charoen Phokphand

Perbandingan penampilan
antara sekuensing manual
dengan sekuensing automatis
Sumber: Charoen Phokphand

Contoh data sekuens dan elektrophoregram utk kontrol
kualitas
Tampilan Elektrophoregram dari sekuenser
automatis
A
Megabace1000
B produced by
Amersham
&Molecular-
Dynamic.
Automated Sequencer
• ABI Prism
3100-Avant
Genetic
Analyzer
(Applied
Biosystems,
USA).
• 4-Capillary
Systems
Beckmann Coulter-Ge XP System
Sekuensing
Elektrophoregram hasil pembacaan Megabace yang diolah dengan software
DNAstar. DNA template berasal beet gula
Sumber: Jamsari
Sekuens Analisis
Gen databank (Genbank), DNA databank
http:// www.ncbi.
http:// www.embl-heidelberg.de.
http:// www.ebi.ac.uk.
http:// www.expasy.org.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

BLASTn, BLASTp
Sekuens Analisis
Asp12-SP6
ATTGATTCCTGATCTCTGGACGAAACCTGCGTTGTTGCTGTTTAACGGGTTTTACATCCGGATCGATGTTGAGACGGTGCA
TGGCCACCTTCGGGTCAAGGCCAGACATATCTTCATAATTCCAAGCGAAGACATCTATATATTCTCGGATGAGAGATATAA
GGTCTTCCTTCTCGGATGATGATAGGTCTTCAGCTATAAAGATAGGCTTGGGATCAGATTCATCTCCCATGTTGACCTGAA
TTACTTTATCTTCAGTGGGTGGTTCGCGTTGTTCGAATCGCATATCCCATAAAGTGTTAAGACGTTTGATCCAAGGATCGT
TGGGTGACTCGATTAACTCTTCGTCACCCCCTGCATCTTCATCAGGATGACTAGTTGAAACCATGTTCACAGTCAAATCTT
TAAAGAAAGGTCCGACACTGACGTCGGATTCCCAAGAAGAGGTTCCGGACGAATGATCCTGACGCAGATAATTACTGGTT
TCATTTTCTGAGGCAGGGGGAGTTGTGACATAACCTAAGCCCCTTCCGGTTTTTTGATAATAATCCGGAGGTTTTCCTTCA
GGGGTTAGAGACATCCGGATTGGGGTTCGTCTACCTTTTCCGAAGTTCAGACCATGTTTCTCATTAAAGTTATACCCCATT
TGGCTTTATTAAGTATATAGAATTGGGTTCGTGATAATGGAATTGGGGAACTCCGTCGTCTTCCTCTGAACTTCCTCGT
Query= user-submitted sequence (726 letters)Database: PlantDNA 1,993,818 sequences;
1,842,947,813 total letters Score Sequences producing significant alignments: (bits) E-Value
gi|17638710|gb|BH452999.1|BH452999 BOGBG11TR BOGB Brassica oler... 42
0.27gi|16282742|gb|BI945182.1|BI945182 sb30h05.y1 Gm-c1009 Glycine ... 38
4.1gi|19927330|gb|AAAA01003021.1| Oryza sativa (indica cultivar-gr... 38
4.1gi|19930894|gb|AAAA01006584.1| Oryza sativa (indica cultivar-gr... 38
4.1gi|17643069|gb|BH457358.1|BH457358 BOGXJ15TR BOGX Brassica oler... 38
4.1gi|19893587|gb|BH794948.1|BH794948 ME_MBa0003L17r Manihot escul... 38
SELESAI
Pengantar Bioteknologi Pertanian
SISTEM VEKTOR – INANG

Plasmid


SISTEM VEKTOR - INANG
VEKTOR: Media untuk dan memperbanyak dan mentransfor-

masi fragmen DNA


PERSYARATAN SUATU VEKTOR:
1. REPLIKASI AUTONOM DALAM INANG
2. BERPENANDA UNTUK SELEKSI
3. BERPOSISI KLONING TUNGGAL
4. BERBERAT MOLEKUL KECIL
5. MEMILIKI BEBERAPA KOPI PADA SETIAP SEL
6. TIDAK BERKONJUGASI

JENIS VEKTOR:
1. PLASMID
2. FAG  (FAG M13)
3. KOSMID
4. P1- (PAC) (Plasmide artificial chrom.)
5. BAC (Bacterial artificial chromosome)
6. YAC (Yeast Artificial Chromosome)

KAPASITAS TAMPUNG BEBERAPA VEKTOR

Vektor Inang Kapasitas kloning
Plasmid Escherichia coli ~ 5000 bp
Plasmid Saccharomyces cerevisiae ~ 5000 bp
Plasmid Bacillus subtilis ~ 5000 bp
-Phage Escherichia coli 9 – 23 kb
Cosmid Escherichia coli 30 – 48 kb
P1-(PAC) Escherichia coli 85 – 110 kb
BAC Escherichia coli 30 – 350 kb
YAC Saccharomyces cerevisiae 50 kb – 2 Mb


PLASMID: DNA EKSTRAKROMOSOMAL BERBENTUK
SIRKULAR TERTUTUP, BERPITA GANDA,
UKURAN 1 – 200 kb.
KROMOSOMAL DNA
PLASMID

Kendali replikasi plasmid

- Kontrol ketat (stringed control)
- Kontrol longgar (relaxed control) (10-200
kopi)


Eco RI Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III
MCS = Multicloning Site
P O Z
lac
pBin19
Km® 10 kb


KLONING DALAM PLASMID
Bam HI Bam HI Bam HI
Eco RI Kpn I Sma I Bam HI Xba I Sal I Hind III

MCS = Multicloning Site
DNA Asing
P O Z
lac
pBin19
Km® 10 kb

DNA Asing
Km®
DNA Ligase

DNA Asing
Km®


PENYUSUNAN PUSTAKA DNA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
Km®
D
E
F
G
H


ISOLASI DNA PLASMID
Tris, Buffer EDTA

CENTRIFUSE + NaOH dan SDS
Km® PELLET
CENTRIFUSE Km®
Km®
Km®
Km®
Km®
Km®
Km®


Analisis DNA Plasmid dan insersi
Sumber: Jamsari

PENAMPILAN DNA PLASMID STLH DIISOLASI
SELESAI

PENYISIPAN GEN/FRAGMEN DNA
ASING KEDALAM SEL SUATU
ORGANISME


TRANSFORMASI GENETIK

Dasar-Dasar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman
Beberapa Tanaman Budidaya Transgenik.

Buah Sayuran Butiran Tanaman lain Bunga2an
Apel Kol Bunga Jagung Kapas Krisantemum
Pisang Brokolli Padi Luzerne Kalankoa
Peer Chikori Gandum Raps Pelargonia
Strawberry Timun Lada Petunia
Kiwi Kentang Kol liar Mawar
Melon Wortel Kedelai
Jeruk Kol Bg Matahari
Pepaya Selada Tembakau
Plum Oliv Tebu
Anggur Asparagus Beet gula
Ubi Jalar
Tomat
Zucchini

Penyisipan gen/fragmen DNA Asing
• Transformasi genetik
• Bisa berupa Gen fungsional ataupun
Fragmen struktural.
METODE TRANSFORMASI
1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens

2. Transformasi dengan Biolistik
3. Transformasi dengan fusi protoplasma
4. Transformasi dengan mikroinjeksi
5. Transformasi dengan elektrophorasi (Electrophoration)
6. Transformasi dengan chemical (heat shock)

1. Transformasi dengan Agrobacterium tumifaciens
Agrobacterium tumifaciens
adalah bakteri tanah penyebab
tumor pada tanaman
dikotiledon.
Pertama ditemukan tahun

1907, dilanjutkan dengan
penemuan plasmidnya yang
berukuran 200-800 kb.

Plasmid mengandung gen penyebab tumor sehingga disebut
dengan Tumour inducing-plasmid (Ti-Plasmid)
tms tmr nos
T-DNA = DNA transfer
noc = katabolisme Nopalin
T-DNA nos = sinthesis Nopalin
LB
RB tmr = sintesis Sitokinin
tms = sintesis Auxin
noc
vir = daerah virulen
vir Ti-Plasmid ori = asal replikasi
LB = batas kiri
tra
RB = batas kanan
ori

Kromosom dalam inti
sel tumbuhan
Agrobacterium
Pelukaan
Sel tumbuhan
Infeksi pada sel tumbuhan dan

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor
Infeksi pada sel tumbuhan dan

transfer T-DNA
Tumor
T-DNA didalam
kromosom inti
sel
Agrobacterium di
dalam tumor

LB RB
1
T-DNA
LB RB
2
T-DNA
virD2
LB RB
3
virD2
virE2
virD2
LB RB
4
Komplek T-DNA-Protein

LB T2 Gen P2 T1 SMG P1 RB
T-DNA dimodifikasi
LB RB
vir Ti-Plasmid E. coli - plasmid

E.c. ori
tanpa T-DNA dengan T-DNA
A.t. ori Kan®

SKEMA SISTEM VEKTOR BINER

TRANSFORMASI BIOLISTIK
= PARTIKEL BOMBARDEMEN
= MIKROPROJEKTIL
KELEBIHAN:
1. TIDAK MEMERLUKAN PENGHILANGAN DINDING SEL
2. TEORITIS SETIAP SEL ATAU JARINGAN BISA DITRANSFORMASI
3. CARA TRANSFORMASI TIDAK SEKOMPLEKS A. TUMIFACIENS
4. VEKTOR YANG DIPERLUKAN UNTUK TRANSFORMASI SEDERHANA
5. DAPAT MENGAKOMODASI LEBIH DARI 10 GEN SEKALIGUS PADA
PLASMID YANG BERBEDA
6. METODENYA DAPAT DITERAPKAN PADA SETIAP ORGANISME DAN
GENOTIP

Hind III Sma I
Eco RI
T Plasmid untuk transformasi biolistik
P
Amp® = gen resistensi ampicilin
SMG = Gen penanda untuk
Amp®
SMG tumbuhan
P = promotor
T = terminator
E.c. ori

KAMAR TEKANAN
PEMEGANG MAKRO
DNA BERLAPIS
PARTIKEL EMAS
CAWAN PETRI DGN

JARINGAN
TANAMAN BIORAD
PRINSIP ALAT TRANSFORMASI BIOLISTIK

KELEMAHAN:
1. EFISIENSI RENDAH (0,05%)
2. TIDAK SETIAP DNA YG DITRANSF. STABIL
TERINTEGRASI DIDALAM INTISEL
3. KEBANYAKAN HARUS MENGGUNAKAN
JARINGAN MERISTEM

Transf. potongan daun dgn A. tumifaciens Transformasi kalus dengan biolistik
Potongan daun dengan A. tumifaciens Embrio/Kallus diinisiasi dan dikultivasi

dikokultivasi
8-12 minggu
1-2 hari
Potongan daun dicuci Transformasi biolistik
Perlakuan antibiotik untuk mematikan

Bakteri dan menseleksi sel-sel Pertumbuhan kallus tanpa seleksi
transformant
4 hari
2-4 minggu
Transfer potongan daun ke medium Pertumbuhan kallus dengan media
regenerasi dan seleksi (pembentukan seleksi
kalus dan tunas)
8-12 minggu
6-10 minggu
Potongan daun diletakkan pada medium Regenerasi dan seleksi lanjutan
tanpa phytohormon untuk pembentukan
akar 8-12 minggu
4-6 minggu Regenerasi tanaman transgenik
Regenerasi tanaman transgenik

3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma
LANGKAH PERTAMA:
MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI DINDING SEL
(ENZIMATIS) :
UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE
PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM MEDIUM: ISO-OSMOSIS
VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK

METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL)
ELECTROPHORATION
PROBLEM: REGENERASI TRANSFORMANT

SISTEM SELEKSI DAN REPORTER

NH2
1. SELEKSI DOMINAN:
CH2
ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID: O
OH
Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO
Gentamycin dari Micromonospora purpurea HO
Neomycin dari Streptomyces fradiae O

HO NH2
Streptomycin dari Streptomyces griseus
CH2O O NH2
O
HO
NH2 OH
STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN

3. Transformasi Dengan Fusi Protoplasma
LANGKAH PERTAMA:
MEMBEBASKAN PROTOPLASMA DARI
DINDING SEL
(ENZIMATIS) :
UTAMA PEKTINASE DAN CELLULASE
PROTOPLASMA DIPELIHARA DALAM
MEDIUM: ISO-OSMOSIS

VEKTOR TRANSFORMASI = BIOLISTIK
METODE : PEG (POLYETHYLENGLYKOL)
ELECTROPHORATION
PROBLEM:
REGENERASI TRANSFORMAN
Mikroinjeksi
Injeksi materi genetik yang mengandung
gen baru kedalam sel resipien.
Mekanisme ilmiah mikroinjeksi belum

difahami secara baik, terutama
bagaimana gen yang diinjeksikan dapat
menemukan sel inangnya dan
beintegrasi dalam struktur genom
mereka.
Mikroinjeksi
• Pada sel-sel berukuran besar seperti

tumbuhan dan hewan, mikroinjeksi
dapat dilakukan menggunakan
jarum mikro yang sangat halus.
Transformasi dengan
Microinjeksi
NH2
1. SELEKSI DOMINAN:
CH2
ANTIBIOTIK KELAS AMINOGLYCOSID: O
OH
Kanamycin dari Streptomyces kanamyceticus HO
Gentamycin dari Micromonospora purpurea HO
Neomycin dari Streptomyces fradiae O

HO NH2
Streptomycin dari Streptomyces griseus
CH2O O NH2
O
HO
NH2 OH
STRUKTUR FORMULA KANAMYCIN

SELEKSI DOMINAN:
• RESISTEN GEN dengan promotor dan terminator tanaman:
• Neomycin-Phosphotransferase (nptII-gen)
• Hygromycin-B-Phosphotransferase
• 3-Enolpyruvylshikimat-5-Phosphatsynthase (EPSP-
Synthase)

SISTEM REPORTER (INDIKATOR):

luciferase, green fluorescent protein (GFP)
Cahaya (562 nm)
Lalat api-Luciferase
O2 + Luciferin Oxyluciferin + CO2
ATP AMP + PP1


SISTEM REPORTER (INDIKATOR): β-D-Glucuronidase
Cl 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronid
COOH Br (X-GlcA)
HO O
O
OH
N
H
HO
β-Glucuronidase
OH Cl Cl O O Cl
COOH OH Br
HO Br Oksidasi Br
O
OH + udara
N N N
HO H H H
Bahan pewarna indigo

Ekspressi GUS
Sumber: Abdullah, et al., 2005. Immature embryo: A useful tool for oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) genetic transformation
studies. Electronic Journal of Biotechnology (28): 24-34.
Analisis Reporter
Fluorescent protein for marker

Plasmid
REGENERASI SEL-SEL TRANSFORMANT
TEKNIK KULTUR JARINGAN (KULTUR IN-VITRO)
POTENSI:
• SIFAT TOTIPOTENSI SEL TUMBUHAN
• KOMPOSISI MEDIA BERSIFAT GENOTYPE SPESIFIK
• PHYTOHORMON BERSIFAT SPESIFIK; CYTOKININ-TUNAS
AUXIN – KALLUS DAN AKAR
• VARIASI SOMAKLONAL

REGENERASI SEL-SEL
TRANSFORMANT
REGENERASI
KALLUS
TANAMAN
TEMBAKAU
MEMBENTUK
TUNAS DAN DAUN
SUMBER KEMPKEN DAN KEMPKEN

PENGUJIAN ADANYA PERUBAHAN GENETIS
MANFAAT:
1. MEMBEDAKAN ANTARA TRANSFORMANT DARI MUTANT
2. FIHAK BERWENANG DALAM PENANGANAN
MATERIAL/PRODUK TRANSGENIK
DNA dng. XhoI dipotong
TL T1 T2 T3 T4 Pengujian dengan
hibridisasi
6,6 kb Probe untuk hibridisasi adalah
DNA vektor yang digunakan
4,4 kb
dalam transformasi
TL = TIPE LIAR
T1-T2 = Transformant 1-2
2,0 kb

Pengujian dengan PCR

Pengujian jagung
transgenik dengan
menggunakan primer
spesifik yang didesain
- 828 bp
dari gen amp®, herbisida
resisten (bar), 35Sbar
(promotor untuk
- 266 bp herbisida resisten, cry1A
(gen dari Bt-resisten), ivr1
(gen invertase)

METHODE LAIN:
EKSPRESSI REPORTER GEN ( GUS; β-Glucuronidase)
GMO Soya Test-Kit TM :
Strategic Diagnostic Inc & Monsanto Co.

EKSPRESSI GEN YANG DITRANFORMASI
EKSPRESSI GEN
1. EKTOPIK : BEREKSPRESSI PADA SETIAP SEL
2. SPESIFIK SEL/JARINGAN: HANYA PADA SEL/ JARINGAN
TERTENTU
EKTOPIK : MENGGUNAKAN PROMOTOR KONSTITUTIF 35S-Promotor

DIISOLASI DARI Cauliflower Mosaik Virus-Kol Bunga
(CaMV):
COCOK UNTUK EKSPRESSI: GEN MARKER DAN REPORTER

TIDAK COCOK UNTUK EKSPRESSI GEN-GEN DALAM FUNGSI METABOLIK

EKSPRESSI GEN-GEN YANG DITRANFORMASI
EKSPRESSI SPESIFIK SEL/JARINGAN
Tipe sel atau jaringan Nama Tumbuhan

gen/promotor
Jaringan phloem daun dan Asus 1 Arabidopsis thaliana
akar
Bunga dan ujung akar CHS15 Kacang-kacangan
Meristem Cyc07 Arabidopsis thaliana
Phloem Fragment dari Padi
RTBV
Pollen PLAT4912 Tembakau
Biji Puroindolin-b Gandum
Sel pada tapetum TA29 Tembakau

Protein Transport:
Signal sequences atau
Adress sequences
Fungsi:
Melokalisasi protein
yang sudah dibentuk
Ribosom pada tempat
yang semestinya.

PENGARUH EKSPRESSI-RNA ANTISENSE
RNA-ANTISENSE:
RNA MOLEKUL YANG
BERKOMPLEMENTER DNG.
SEKUENS TRANSKRIP SUATU
GEN

STABILITAS TANAMAN TRANSGENIK
INAKTIFASI GEN ASING SEBAGAI SUATU BENTUK

MEKANISME PERTAHANAN SEL TANAMAN
MEKANISME:
1. METILASI.
• Terjadi pada atom 5 dari basa Cytosin dengan urutan
kebanyakan CpG (p = C, G, A, T).
• banyak ditemukan pada transformasi biolistik
• umumnya terjadi pada cluster gen (gen yang
menggerombol)
cis-inactivation (cluster, tempat yang sama), trans-inactivation tempat yang
jauh
EKSPRESSI GEN YANG
DITRANFORMASI
2.Co-suppressi
Terjadi akibat penurunan jumlah RNA hasil

transkripsi, yang disebabkan oleh
peningkatan laju degradasi RNA bukan
karena aktifitas transkripsi yang menurun.

SELESAI

BahanAjarPengantarBiotekPertanian PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

BahanAjarPengantarBiotekPertanian PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Kuliah I

Sejarah, Pengertian dan Kontribusi

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

• Minuman beralkohol (Bir, anggur, tuak)

• Antibiotika (Penisilin, tetrasiklin,

Seleksi kuda (Babylonia-6000 SM): benih padi

Perkembangan ilmu Genetika :

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

• Resistensi terhadap Herbisida

Tanaman dengan resistensi terhadap herbisida adalah tanaman

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

•Meracun terhadap semua jenis •Aktif pada dosis tertentu

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Tanaman: lucerne, tomat, jagung, padi, gandum dan kedelai

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Enzym Oxidoreduktase (bakteri) dan EPSP-Shynthase (35S-Promotor)

Tanaman transgenik yang dihasilkan:

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Menjadikan tanaman resisten terhadap serangga

Sumber gen resisten: Bacillus thuringiensis, Bt-toxin , δ-Endotoxin

European corn borer

Western corn rootworm

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

• Kerusakan morfologis, fisiologis

Kasus Phytoptora infestans

Tanaman kentang di USA (1845),

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

• Kadar Garam yang tinggi

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Mendeteksi ranjau darat

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Kandungan Protein dan asam amino esensial, vitamin

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

proteins such as growth hormones, insulin, blood

Barnase-Barstar-System ON MALE STERILITY

RNase dari Bacillus amyloliquefaciens >< Barstar

TA29 Barnase TA29 Barnase

Degradasi RNA di tapetum

Pollen tidak terbentuk

Dr. Jamsari-program study pemuliaan tanaman-BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

MARKER ASSISTED SELECTION (MAS)

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Mm m fmm mf mmm f f m mmm V Mm MM mm Mm MM mm

STS B 104 bp 189 bp 341 bp 361 bp

ASP2-SP6 (M) 400 bp

ASP2-SP6 (m) 400 bp

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Peluang pemanfaatan sel sebagai produsen dengan menggunakan potensi

Kultur starter Enzim: untuk mencerna

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Struktur Detail dan Fungsi

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks,

Mahasiswa mampu menjelaskan