Metode Simple Ekstraksi DNA Genom dari Sampel

Manusia untuk
Analisis PCR-RFLP
Isolasi DNA dari darah dan penyeka bukal dalam jumlah yang cukup
merupakan bagian integral dari penelitian forensik dan analisis. Penelitian ini
dilakukan untuk menentukan kualitas dan kuantitas DNA yang diekstraksi dari
empat sampel yang tersedia dan untuk memperkirakan durasi waktu amplifikasi
PCR berikutnya. Di sini, kami mendemonstrasikan bahwa sampel rambut dan urin
juga bisa menjadi sumber alternatif untuk hasil yang baik dari sejumlah kecil DNA
berbasis PCR. Kami mengembangkan metode sampel yang cepat, hemat biaya, dan
non-invasif pengumpulan dan ekstraksi DNA sederhana dari penyeka bukal, urin,
dan rambut menggunakan fenol-kloroform
metode. Sampel bukal menjadi sasaran ekstraksi DNA, segera atau setelah
pendinginan (4-6 ° C) selama 3 hari. Kemurnian dan konsentrasi DNA yang
diekstraksi ditentukan secara spektrofotometer, dan kecukupan ekstrak DNA untuk
pengujian berbasis PCR dinilai dengan memperkuat daerah 1030-bp dari D-loop
mitokondria. Meskipun DNA dari semua sampel cocok untuk PCR, sampel darah
dan rambut memberikan DNA berkualitas baik untuk analisis restriksi produk PCR
dibandingkan dengan swab bukal dan sampel urin. Dalam penelitian ini, sampel
rambut terbukti menjadi sumber DNA genom yang baik untuk PCR berbasis
metode. Oleh karena itu, DNA sampel rambut juga dapat digunakan untuk analisis
gangguan genomik selain analisis forensik sebagai hasil dari kemudahan
pengumpulan sampel dengan cara non-invasif, volume sampel yang lebih rendah
persyaratan, dan kemampuan penyimpanan yang baik.

PENGANTAR
Kemajuan penelitian terbaru dalam gangguan genom telah mengharuskan koleksi
kualitas bagus dalam jumlah besar DNA yang perlu diperoleh dari sampel yang
berbeda sumber. Saat ini, pengetikan DNA paling banyak divalidasi metode untuk
identifikasi pribadi tubuh manusia noda cairan yang ditemukan di TKP. Dalam
berbagai macam studi genetika, metode yang umum digunakan adalah untuk
mendapatkan DNA genomik dari sel-sel darah perifer yang berinti; sebagai hasil
dari invasi pendekatan ini, mungkin sulit untuk mendapatkan sampel dari subyek
penelitian skema isolasi telah membosankan, dan analisis total waktu juga agak
panjang. Sumber alternatif lainnya isolasi DNA termasuk sel bukal, rambut dengan
folikel, dan urine, yang lebih mudah didapat dengan cara non-invasif dibandingkan
dengan pengumpulan darah invasif. Koleksi sel pangkat dapat dilakukan dengan
mudah dengan swab bukal dengan kapas Usap atau gunakan prosedur pencuci
mulut.Isolasi DNA menggunakan penyeka bukal memberikan banyak keuntungan,
seperti pemrosesan yang hemat biaya, kebutuhan volume sampel yang lebih rendah,
pengarsipan jangka panjang, dan kesesuaian pasien, dan buccal penyeka
menyediakan DNA yang cukup untuk PCR, seperti yang mereka tuntut hanya
beberapa nanogram DNA Rambut manusia adalah salah satu biologis yang paling
umum bahan yang terkait dengan penyelidikan hukum dan telah digunakan untuk
pekerjaan populasi berbasis statistik dan berdasarkan DNA analisis dalam
kriminologi. Metode yang paling berharga pengujian DNA adalah analisis berulang
tandem nuklir pendek DNA. Ini mungkin ketika bagian akar rambut dan / atau
jaringan yang melekat Namun, rambut telogen (rambut rontok), sering dikaitkan
dengan TKP, mungkin tidak mengandung bahan nuklir apapun Mitokondria selular
dan DNA mitokondria (mtDNA) masih tetap utuh, sementara nukleus menurun
saat batang rambut mengeras selama keratinisasi, dan analisis mtDNA layak dari
rambut keratin. Sayangnya, sifat kaya protein sampel rambut membutuhkan
langkah tambahan untuk memecah poros dan melepaskan DNA (seperti
fragmentasi menggunakan penggiling kaca mikroskopis, diikuti oleh pelarut
organik ekstraksi) 7–9, sehingga mengekspos spesimen ke peningkatan risiko
kontaminasi. Investigasi forensik urin manusia noda sangat penting ketika
mengidentifikasi yang tepat lokasi kejahatan dan jenis kematian.10 Urin manusia
adalah sampel yang cocok untuk analisis toksikologi dalam doping dan tes skrining
obat.
Namun, karena kesulitan praktis dan metodologis alasannya, penting untuk
mengoptimalkan kondisi untuk memaksimalkan hasil dan kemurnian DNA yang
diperoleh dari berbagai jenis sampel menggunakan berbagai metode. A
disederhanakan metode, ditunjukkan dalam penelitian ini, untuk ekstraksi DNA
dari batang rambut yang mengurangi yang tidak perlu langkah-langkah hampir
menghilangkan kontaminasi DNA dan juga secara substansial melestarikan durasi
waktu analisis yang akan berguna bagi komunitas forensik sebagai baik untuk
komunitas penelitian berbasis populasi. Di Selain itu, kebutuhan volume sampel
yang lebih rendah digabungkan dengan koleksi sampel secara non-invasif
memungkinkan sampling pediatrik yang mudah bermanifestasi dalam penelitian
yang lebih luas rekrutmen dalam studi kasus berbasis populasi. Selanjutnya, dapat
dibayangkan untuk mengembangkan metode yang disederhanakan ini karena dapat
diterapkan sebagai alat diagnostik medis dengan DNA analisis yang dapat
dilakukan pada skala waktu yang cukup singkat (8 h) untuk mendeteksi keadaan
penyakit, yang saat ini diagnostik bidang medis

MATERIAL DAN METODE

Pengumpulan dan Pengolahan Sampel
Dalam penelitian ini, lima orang dewasa sehat direkrut (rentang usia, 22-
35 tahun), dan informasi demografis, termasuk usia, kondisi kesehatan, jenis
kelamin, populasi nenek moyang, warna rambut, dan perawatan rambut,
dikumpulkan. Kelima orang tersebut yang direkrut diminta untuk berkumur dengan
Air keran selama 30 detik sebelum pengambilan sampel dari penyeka bukal, untuk
menghindari kontaminasi sebagai akibat dari partikel makanan. Untuk setiap
individu, kedua sisi mukosa bukal diseka dengan kapas selama 15 detik , dan total
lima sampel adalah dikumpulkan dalam 500 l 10 M Tris-HCl, 10 mM EDTA, 2%
SDS, mengandung tabung microcentrifuge 1,5-ml. Isolasi dari DNA dari penyeka
kapas dilakukan (vide infra)
Sampel rambut (masing-masing tiga helai rambut) dari lima subjek dicuci dengan
merendamnya dalam air tawar untuk dihilangkan kotoran permukaan dan
kontaminan lainnya. Sampel rambut diambil dengan forceps bersih, dicuci dengan
500 l 70% etanol dalam tabung microcentrifuge 1,5-ml, dan kemudian disimpan di
sebuah tabung berisi air steril, deionisasi. Sampel rambut diperiksa lebih lanjut di
bawah kaca pembesar untuk dihapus cairan tubuh apapun jika ada. Rambutnya
dipotong 5–10 mm dari ujung proksimal (akar) untuk pencernaan.

Semua relawan yang direkrut sepenuhnya diberitahu tentang belajar dan

menginstruksikan sesuai untuk pengumpulan urin. Spesimen urin dikumpulkan
dalam botol sampel steril dan dicampur dengan inversi lembut setidaknya 30 menit
sebelumnya pengolahan. Untuk menghindari kontaminasi sebagai akibat dari
berulang sampling dan mempelajari dampak dari efek penyimpanan pada integritas
sampel, sampel dari masing-masing spesimen urin

aliquoted lebih lanjut (5 ml) dalam wadah yang sesuai. PBS (500 l)
ditambahkan dalam 1 ml sampel urin yang mengandung 2-ml tabung
microcentrifuge dengan 0,5MEDTA (pH 8.0) ke final konsentrasi 10 mM EDTA
untuk menghambat kemungkinan Aktivitas nuclease dalam sampel urin. Tabung
kemudian vortex secara menyeluruh selama 1 menit. urin masukkan segera atau
beku (20 ° C). Spesimen darah juga diperoleh dari yang sama donor dengan
menusuk jari menggunakan lancets steril oleh aseptik teknik dan disimpan dalam
microcentrifuge EDTA-dibilas tabung. Sampel darah (50 l) diproses segar dan
berfungsi sebagai referensi isolasi DNA subjek.

Ekstraksi DNA dari Buccal Swabs

1. Sampel swab bukal tersuspensi dalam 500 ul buffer lisis [10 mM Tris (pH 8,0),
10 mM EDTA, dan 2,0% SDS], dan 50 l 10% SDS, diikuti oleh 5–10 l 20 mg /
ml proteinase K (Himedia, Mumbai, India) yg ditambahkan.
2. sampel diinkubasi 1–3 jam pada 56 ° C sampai jaringan itu benar-benar larut.
DNA
3. kemudian diekstraksi dari masing-masing sampel dengan volume fenol yang
sama: kloroform: isoamil larutan alkohol (25: 24: 1)
4. dicampur dengan lembut dengan membalik tabung selama 3 menit.
5. Sampel kemudian disentrifugasi (Eppendorf 5415R; Hamburg, Jerman) selama
10 menit dengan 10.000 g (4 ° C),
6. dan lapisan air atas adalah dipindahkan ke tabung microcentrifuge yang
disterilisasi. RNase A (10 l 10 mg / ml; Fermentas, Thermo Scientific, Jerman)
ditambahkan, dan diinkubasi pada 37 ° C selama 30 menit.
7. Volume kloroform yang sama: isoamyl larutan alkohol ditambahkan dan
disentrifugasi (Eppendorf 5415R), sekali lagi dengan 10.000 g (4 ° C) selama 10
 menit. Bagian atas lapisan berair dipindahkan ke microcentrifuge yang
disterilkan tabung, dan menggandakan volume isopropanol dingin (Merck,
Whitehouse Station, NJ, USA)
8. ditambahkan, bersama dengan sepersepuluh volume 3 M sodium asetat, dan
9. didinginkan pada 20 ° C selama 1 jam untuk presipitasi.
10. Setelah 1 jam, sampel disentrifugasi (Eppendorf 5415R) pada 10.000 g (4 ° C)
untuk 10 menit.
11. Setelah decanting supernatan, 250 l 70% etanol (Merck) ditambahkan, dan pelet
dilarutkan; campuran disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit, dan
supernatan itu tertuang dengan lembut.
12. Pelet itu dikeringkan di bawah aliran udara laminar, dan pelet kering itu
diresuspensi dalam 50 l air bebas nuklease atau 1 10 mM Tris-HCl, 1mMEDTA,
pH 7,6 (TE), buffer dan beku pada 20 ° C atau 80 ° C untuk penyimpanan.

Ekstraksi DNA dari Sampel Rambut

DNA diisolasi dari hair shafts menggunakan versi yang dimodifikasi dari ekstraksi
pelarut kaca dan ekstraksi organik mikroskopis protocol.12-14 Sebagai protokol ini
mengekspos spesimen peningkatan risiko kontaminasi, penelitian ini telah
menggantikan metode pencernaan fisik yang membosankan dengan metode
pencernaan kimia halus menggunakan dithiothreitol (DTT) (Hi-media) karena
merupakan agen pereduksi kuat dengan kandungan garam yang relatif tinggi dan
juga deterjen anionik. Penyangga pencernaan (500 l; 10 mM Tris-HCl, 10 mM
EDTA, 50 mM NaCl, 20% SDS, pH 7.5) ditambahkan ke 1,5-ml tabung
microcentrifuge, bersama dengan 40 l dari 1 M DTT (ke konsentrasi akhir 80 mM,
240 mM dari natrium asetat, pH 5.2) dan 15 l proteinase 10 mg / ml K (ke
konsentrasi akhir 0,3 mg / ml; Himedia). Rambut sampel ditambahkan ke solusi ini
sebelum vortexing dan inkubasi selama 2 jam pada 56 ° C. Setelah 2 jam inkubasi,
tabung sampel vortexed lagi, dan tambahan 40 l dari 1MDTT dan 15 l 10 mg / ml
proteinase K ditambahkan, diikuti dengan pencampuran lembut dan inkubasi pada
60 ° C untuk 2 lebih banyak h atau sampai rambut dilarutkan sepenuhnya.

DNA kemudian diekstraksi dari setiap sampel dengan volume fenol yang
sama: kloroform: isoamil alkohol solusi (25: 24: 1) dan aduk dengan lembut dengan
membalik tabung untuk beberapa menit. Sampel disentrifugasi (Eppendorf 5415R)
selama 10 menit dengan 10.000 g (4 ° C), diikuti oleh mentransfer lapisan air atas
ke dalam segar, disterilkan tabung microcentrifuge. RNaseA (10 l 10 mg / ml;
Fermentas, Thermo Scientific) ditambahkan dan disimpan untuk inkubasi pada 37
° C selama 30 menit. Volume kloroform yang sama: isoamil alkohol ditambahkan,
dan tabung disentrifugasi (Eppendorf 5415R) lagi at10, 000 g (4 ° C) selama 10
menit. Lapisan berair atas dipindahkan ke segar, disterilkan tabung microcentrifuge
sebelum menggandakan volume isopropanol dingin dan volume sepersepuluh dari
3 M natrium asetat ditambahkan. Sampel didinginkan pada 20 ° C untuk 1 h untuk
presipitasi DNA terjadi. Sampelnya adalah disentrifugasi (Eppendorf 5415R) pada
10.000 g (4 ° C) selama 10 mnt Supernatan dibuang, 250% etanol 70%
ditambahkan, dan pelet disadap dengan lembut sebelum lebih lanjut sentrifugasi
(Eppendorf 5415R) pada 10.000 rpm selama 10 mnt Supernatan dibuang, dan
peletnya kering udara dalam aliran udara laminar, diresuspensi dalam 50 l nuklease-
air bebas atau 1 TE buffer, dan dibekukan pada 20 ° C atau 80 ° C untuk
penyimpanan.

Ekstraksi DNA dari Sampel Urin

Sampel urin beku dicairkan pada suhu kamar dan kemudian ditempatkan
segera di es sebelum isolasi DNA. Spesimen urin terbalik atau berputar-putar dalam
spesimen cangkir untuk membuat suspensi sel yang homogen. Satu mililiter
spesimen dipindahkan ke Eppendorf tabung dan disentrifugasi (Eppendorf 5415R)
selama 10 menit pada 10.000 g (4 ° C). Supernatan dihapus, dan kering sel yang
mengandung pellet didinginkan pada 20 ° C selama 15 menit. Lysis buffer (500 l;
10 mM Tris, 1,2 mM EDTA, 10% SDS, pH 9.0) ditambahkan ke pelet kering, dan
sampel itu vortexed untuk resuspend pelet. Proteinase K (20 l dari 20 mg / ml;
Himedia) ditambahkan, dan tabung diinkubasi di pemandian air (CW-30G; Jeio
Tech, Seoul, Korea) pada suhu 56 ° C selama 2 jam. Sodium acetate (60 l dari 3M)
dan 0,5 ml isopropanol dingin ditambahkan, campuran, dan didinginkan pada 20 °
C selama 1 jam, diikuti dengan sentrifugasi pada 10.000 g (pada 4 ° C) untuk
20 mnt. Supernatan dibuang, 250 l 70% etanol ditambahkan, dan pelet diketuk
dengan lembut, diikuti dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit
sebelumnya supernatan dibuang dengan lembut. Pelet itu dikeringkan dalam aliran
udara laminar, dan pelet kering diresuspensi di 50 l nuclease-free water atau 1 TE
buffer dan dibekukan pada 20 ° C atau 80 ° C untuk penyimpanan.

Ekstraksi DNA dari Sampel Darah

Limfosit dari darah utuh dipisahkan oleh lysing sel darah merah (RBCs)
menggunakan buffer hipotonik (amonium bikarbonat dan amonium klorida;
Himedia) dengan efek lisis minimal pada limfosit. Tiga volume buffer lisis RBC
ditambahkan ke sampel darah dan dicampur dengan vortexing dan pembalikkan
secara menyeluruh selama 5 menit dan disentrifugasi (Eppendorf 5415R) pada
20,00 g selama 10 menit. Itu supernatan kebanyakan dibuang, meninggalkan 1ml
ke mencegah hilangnya sel. Untuk pellet, buffer vol 3 lester RBC ditambahkan, dan
vortexing, inverting, dan langkah sentrifugasi diulang dua hingga tiga kali hingga
menjadi supernatan yang jelas dan pelet putih bersih diperoleh. Setelah pencucian
akhir, supernatan dibuang sepenuhnya, dan peletnya diresuspensi dalam 500 l PBS,
diikuti oleh penambahan 400 l buffer lisis sel (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 50
mM NaCl, 10% SDS, pH 7,5) dan 10 l proteinase K (10 mg / ml stok; Himedia).
Sampel itu vortex ke larutkan pelet sepenuhnya dan diinkubasi selama 2 jam pada
56 °C dalam bak air (CW-30G; Jeio Tech) untuk lisis. Sederajat volume fenol
(disetimbangkan dengan Tris, pH 8) selanjutnya ditambahkan ke tabung dan
dicampur dengan baik oleh pembalik untuk 1 mnt. Tabung disentrifugasi pada
10.000 g (pada 4 ° C) selama 10min, dan lapisan atas berair dipindahkan ke segar
tabung berisi volume yang sama (1: 1) fenol dan kloroform: isoamil alkohol (24:
1). Tabung dicampur dengan pembalik selama 1 menit dan disentrifugasi selama 10
menit pada 10.000 g (pada 4 ° C). Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung
segar, dan 10 l 10 mg / ml RNase A (Fermentas, Thermo Ilmiah) ditambahkan.
Sampel diinkubasi pada 37 ° C selama 30 menit sebelumnya volume kloroform
yang sama: isoamil alkohol (24: 1) ditambahkan dan dicampur dengan membalik
tabung selama 1 menit dan sentrifugasi pada 10.000 g (pada 4 ° C) selama 10 menit.
Supernatan itu dipindahkan ke tabung segar, dan dua kali volume alkohol absolut
(Merck) ditambahkan dan dibalikkan dengan lembut beberapa kali dan didinginkan
pada 20 ° C, diikuti dengan sentrifugasi pada 10.000 g pada (4 ° C) selama 20 menit.
Supernatan itu dibuang, 250 l etanol 70% ditambahkan, dan pelet diketuk dengan
lembut, diikuti dengan sentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit dan decanting
supernatan dengan lembut. Itu pelet dikeringkan dengan udara dalam aliran udara
laminar, dan yang kering pelet diresuspensi dalam 50 l air bebas nuklease atau 1 TE
buffer dan dibekukan pada 20 ° C atau 80 ° C untuk penyimpanan.

Penentuan Konsentrasi dan Kemurnian

Sebuah uji spektrofotometri kuantitatif DNA dilakukan menggunakan
spektrofotometer UV-terlihat Cary 60 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA,
USA). Absorbansi diukur pada panjang gelombang 260 dan 280 (A260 dan A280,
masing-masing) nm. Absensi absorbansi (OD260 / OD280) memberikan perkiraan
kemurnian DNA. Sebuah nilai selisih serapan rasio 1,8 (R) 2,0 adalah dianggap
baik, DNA yang dimurnikan. Rasio 1,8 adalah indikasi kontaminasi protein, di
mana sebagai rasio 2,0 menunjukkan kontaminasi RNA.

DNA Integritas
Integritas DNA genom dengan dengan pemecahan Ekstrak DNA pada gel agarose
0,4% oleh elektroforesis (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), diikuti dengan visualisasi
dengan pewarnaan ethidium bromide. Setiap sampel DNA adalah Mengungkapkan,
sesuai dengan sampel migrasi elektroforetik DNA dibandingkan dengan berat
molekul yang diketahui marker (Fermentas, Thermo Scientific).

PCR Amplifikasi Daerah D-Loop mtDNA untuk PCR Based

Tes
Kecukupan buccal, rambut, urin, dan DNA darah ekstrak untuk tes
berbasis PCR dinilai dengan memperkuat daerah mtDNA D-loop, yang diperkuat
oleh PCR menggunakan primer mitokondria manusia (HMt) -F (5 =
CACCATTAGCACCCAAAGCT-3 =) dan HMt-R (5 = -
CTGTTAAAAGTGCATACCGCCA-3 =), seperti yang dijelaskan oleh
Salas dkk. untuk wilayah HVI. PCR (vapo.protect; Eppendorf)
dilakukan dalam 25 l volume reaksi total, masing-masing mengandung DNA DNA
100 ng, 0,2 pM masing-masing primer, 2,5 l 10 buffer PCR (penyangga PCR 1
final), 1,5 mM MgCl2, 200 mM dNTPs, dan 1 unit Taq DNA polimerase. Campuran
reaksi dipanaskan sampai 94 ° C selama 5
min, diikuti oleh 40 siklus, masing-masing terdiri dari 1 menit denaturasi pada 94 °
C, 1 menit annealing pada 63 ° C, 1,5 menit ekstensi pada 72 ° C, dan perpanjangan
10-menit terakhir pada 72 ° C. Produk amplifikasi PCR (10 l) menjadi sasaran
elektroforesis (Bio-Rad) pada gel agarose 1,2% dalam 1 Trisacetate- EDTA buffer
di 80 V selama 30 menit dan diwarnai ethidium bromide (Himedia), dan gambar
diperoleh di dokumentasi gel (G-Box; Syngene, Cambridge, UK)
sistem.

Pencernaan Restrik dari Daerah D-Loop mtDNA PCR

Produk
Batasan fragmen-panjang polimorfisme (RFLP) dari daerah mtDNA D-loop
dilakukan untuk memeriksa kontaminasi dalam DNA.13 terisolasi produk PCR
dicerna dengan HaeIII dan AluI (Fermentas, Thermo Scientific) dalam volume total
20 l (10 l larutan reaksi, 2l penyangga enzim, enzim 0,2 l, dan 7,8 l suling air) dan
ditempatkan di inkubator pada suhu 37 ° C selama 4 jam. Itu produk restriksi
dianalisis dengan elektroforesis (Bio-Rad) pada gel agarose 2%, dan berat molekul
fragmen terbatas dianalisis dengan dokumentasi gel sistem (G-Box; Syngene)
setelah ethidium bromide (Himedia) pewarnaan.

HASIL
Dalam penelitian ini, kami menunjukkan cepat, dapat diandalkan, dan metode yang
kuat untuk mendapatkan DNA genom yang siap PCR dari penyeka bukal manusia,
rambut, dan sampel urin, menuntut volume sampel sangat rendah dengan isolasi /
amplifikasi waktu itu, setidaknya, faktor dua lebih pendek saat dibandingkan
dengan metode konvensional. Darah digunakan sebagai sampel referensi untuk
isolasi DNA. Dengan memodifikasi metode fenol-kloroform konvensional, kami
juga berhasil dikembangkan dan menunjukkan protokol yang dapat diandalkan
cepat, hemat biaya, dan mudah diterapkan untuk isolasi DNA dengan konsentrasi
dan kemurnian yang optimal.

Hasil dan Kemurnian

Hasil dari DNA yang diekstrak dari empat berbeda sumber sampel dievaluasi
menggunakan sinar-ganda UVvisible spektrofotometer dan elektroforesis gel (Gbr.
1). Skala kecilDNAekstraksi dari penyeka bukal (dari 1 ml) menghasilkan 60-85 ng
/ l DNA genomik / isolasi, 49-72 ng / l rambut (dari empat bagian), 25–42 ng / l
dalam urin (Dari 5 ml), dan 57-94 ng / l dalam darah (dari 50 l) sampel (Tabel 1).
Begitu pula dengan kemurnian yang diekstraksi DNA dari urin (1,42-1,58) dan
sampel swab bukal (1,54 –1,67) lebih rendah dari darah (1,76-1,86) dan spesimen
rambut (1,72-1,97) (Tabel 1). Penyimpanan diekstrak DNA dari urin, rambut,
darah, dan penyeka bukal, untuk lebih dari 1 bulan, dibekukan pada 20 ° C, tidak
mempengaruhi PCR kinerja

Pengaruh Pengolahan Sampel pada Integritas DNA

Intensitas band yang berbeda diamati untuk diekstrak DNA dari sampel yang baru
dikumpulkan dan / atau disimpan. Sana tidak ada degradasi dalam DNA yang
diisolasi segera setelah pengambilan sampel urin dan bukal. Namun, isolasi DNA
dari penyeka bukal dan sampel urin menunjukkan band dengan beberapa derajat
Degradasi DNA (pita intensitas rendah) dan seiring mengotori di jalan. Namun,
untuk rambut dan sampel darah, penyimpanan dengan pembekuan (20 ° C atau 80 ° C)
tidak berpengaruh pada integritas DNA yang diekstraksi (Tabel 1).

Pengaruh Pengolahan Sampel pada PCR-RFLP

Untuk memeriksa kualitas DNA yang terisolasi dalam skala kecil dari penyeka
bukal, rambut, urin, dan sampel darah, kami memperkuat daerah loop D mtDNA
menggunakan uji PCR. Daerah mtDNA D-loop berhasil diamplifikasi dari semua
sampel, terlepas dari status sampel, apakah diproses segera setelah pengumpulan
atau disimpan (Gbr. 2). Oleh karena itu, urin, penyeka bukal, dan rambut adalah
bagus, sumber alternatif, selain sampel darah, kapan DNA genomik siap PCR
diperlukan. Namun, yang signifikan variasi dalam hasil, serta kualitas atau
kemurnian di antara tipe sampel, diamati. Oleh karena itu, a Reaksi PCR andal dapat
dilakukan bahkan dengan menggunakan banyak jumlah DNA terisolasi yang lebih
kecil. Produk PCR intensitas lebih tinggi untuk darah dan template rambutDNAthan
dengan spesimen urin dan buccal swab. PCR-RFLP pola pita baik dalam hal rambut
dan darah DNA, tetapi sampel urin dan buangan tidak menunjukkan intensitas band
yang memuaskan. Namun, tidak ada yang terdeteksi kontaminasi antara sampel
DNA yang terisolasi, seperti semua sampel yang dicernakan memiliki panjang yang
sama (Gambar 3 dan 4).

DISKUSI
Hasil DNA yang diperoleh dari penyeka bukal dan urine adalah sangat
berubah tergantung pada swab atau jenis urin, yang individu yang diusap, teknik
swabbing, dan jumlah sel yang diambil pada kapas dan dalam urin. Hasil yang
diharapkan menggunakan protokol ini adalah 60–85 ng / l /
usap dan untuk urine, 25–45 ng / l / 15 ml koleksi (Tabel 1), yang, setidaknya, faktor
dua lebih tinggi bila dibandingkan dengan metode konvensional. Hasil dan
kemurnian
DNA yang terisolasi juga tergantung pada penanganan para peneliti
Prosedur. Penurunan kualitas dan kuantitas DNA diamati ketika bahan tidak
ditempatkan segera dalam buffer lisis sel untuk diproses lebih lanjut. Degradasi pita
DNA diamati pada penyeka bukal dan Spesimen urin diproses dengan waktu tunda,
sedangkan degradasi dalam darah dan sampel rambut tidak diamati, mungkin
sebagai hasil dari sifat sampel dan tingkat konsentrasi enzim nuklease dalam sampel
sebelum pencernaan. Meskipun ada tingkat tertentu Degradasi DNA dalam sampel
disimpan di bawah suhu dingin kondisi selama 3 hari, penelitian ini tidak
menunjukkan ada perbedaan signifikan antara ekstraksi DNAPCR produk
amplifikasi dari sel-sel bukal segera setelah pengumpulan sampel atau dari sel-sel
bukal yang dibekukan 3 hari pada 20 ° C. Apalagi 1 minggu penyimpanan, seperti
yang didinginkan pada 4 ° C atau beku pada 20 ° C, juga tidak mempengaruhi hasil
DNA atau PCR yang diamplifikasi DNA. Dalam contoh rambut dan sampel darah,
kualitas DNA yang tinggi diperoleh untuk digunakan nanti, bahkan setelah
penyimpanan rambut sampel dalam etanol selama lebih dari 2 bulan dan darah
sampel dalam botol berlapis EDTA selama lebih dari 4 bulan di 20 ° C

Secara umum, untuk studi mengetik DNA, darah segar segar atau bahan
bernoda darah adalah sumber utama dari seorang individu DNA "sidik jari" dan
digunakan sebagai standar untuk perbandingan. Temuan yang disajikan di sini
memungkinkan kami untuk menunjukkan penggunaan penyeka bukal dan urine
sebagai alternatif sumber untuk ekstraksi DNA. Namun, ada yang ditandai
perbedaan antara sampel urin pria dan wanita tentang kuantitas DNA yang tersedia;
seperti dalam banyak kasus, ada tidak ada informasi mengenai jenis kelamin ketika
urin berada dikumpulkan dari TKP, 10 harus selalu dikumpulkan dari noda urin
terbesar yang tersedia. volume air liur dan urin dapat dikumpulkan secara non-
invasif cara tanpa rasa sakit. Bahkan, swabbing bukal dan urin dengan mudah
diperoleh dengan rewel minimal untuk analisis terperinci, bahkan dari seorang
bayi.14 Kita juga bisa memperkuat gen virus dan bakteri dari DNA urin dan
penyeka bukal untuk mempelajari ada atau tidak adanya patogen menggunakan
assay PCR yang dilaporkan.

DNA yang terisolasi dari semua sampel telah menghasilkan PCR

produk ukuran pasangan basa yang sama dari mitokondria target gen. Namun,
dalam kasus pembatasan pencernaan, Produk rambut dan darah PCR yang
dihasilkan sangat baik dicerna
produk. Ini mungkin merupakan hasil dari kehadiran yang baik konsentrasi produk
amplifikasi PCR dan ketiadaan dari pengotor dalam sampel PCR, bukan urin dan
sampel swab bukal yang tidak dicerna dengan baik oleh enzim restriksi. Oleh
karena itu, kita bisa menggunakan sampel rambut bukan sampel darah untuk PCR-
RFLP berbasis molekuler
analisis.
 Ada kemungkinan tingkat kontaminan rendah yang mungkin ada dalam
DNA yang diisolasi dari serum atau plasma yang jauh lebih sedikit daripada yang
itu ada dalam spesimen urin dan buccal.Dalam teknik ini, ada lebih sedikit
kontaminan, sehingga kemungkinan gangguan kontaminan selama Proses PCR
sangat rendah

Harty et al.have melaporkan bahwa amplifikasi PCR

berhasil setelah penyimpanan lama sampel, meskipun penyimpanan telah
mengurangi hasil DNA. Pada saat ini belajar, isolatedDNAdari semua sampel
disimpan sebagai beku 20 ° C cocok untuk digunakan nanti. DNA diambil dari
sampel urin yang disimpan selama lebih dari 1 bulan dibekukan 20 ° C dilakukan
sebaik sampel urin segar. Meskipun DNA dalam spesimen urin tampaknya
menurun selama periode waktu, sampel urin, disimpan hingga 3 bulan dibekukan
pada 20 ° C, masih dapat digunakan untuk amplifikasi PCR. Isolasi DNA dari
rambut dan darah sangat baik atas dasar stabilitas DNA untuk penyimpanan sebagai
dibekukan pada 20 ° C untuk analisis lebih lanjut.

Kesimpulan
Koleksi sampel yang berhasil dan ekstraksiDNA genomik dari penyeka bukal, urin,
dan rambut alternatif non-invasif dan andal terhadap invasif biang kerok
pengambilan sampel darah, baik untuk subjek dan pengumpul sampel. 17–20 Kami
telah menunjukkan di sini suatu hal yang sederhana dan baru metode pengumpulan
sampel dan ekstraksi DNA, yang hemat biaya, mudah, dan cepat, menyediakan
cukup kuantitas dan kualitas DNA untuk PCR-RFLP berbasis analisis.
Perbandingan prosedur ekstraksi menunjukkan bahwa metode fenol-kloroform
sederhana adalah yang paling banyak cocok untuk ekstraksi DNA dari swab bukal,
urin, rambut, dan sampel darah. Di bawah kondisi penyimpanan yang sesuai, DNA
diisolasi dari sel-sel bukal, urine, dan rambut bisa berhasil digunakan untuk
melakukan tes berbasis PCR. DTT, garam tinggi, larutan deterjen anionik ekstraksi
mtDNA Metode yang dikembangkan dalam penelitian ini mewakili cepat dan
protokol sederhana yang mengungguli keberhasilan amplifikasi mtDNA tingkat
pelarut kaca-penggilingan / organik standar teknik ekstraksi yang saat ini digunakan
oleh banyak laboratorium forensik. Jumlah langkah yang relatif lebih sedikit yang
digunakan dalam hal ini metode memfasilitasi durasi waktu yang lebih singkat dan
sebagai tambahan, menghasilkan kemungkinan kontaminasi yang berkurang secara
signifikan dengan kerugian sampel minimal. Pencernaan kimia DTT metode
menggunakan reagen, persediaan, dan peralatan dengan mudah tersedia di
laboratorium dasar. Kemudahannya akan membantu dalam analisis mtDNA di
laboratorium yang belum melakukan tes mtDNA forensik, serta berdasarkan
populasi belajar menggunakan sampel rambut. Namun, pertanyaan penting masih
tetap dieksplorasi mengenai hasil dan kualitas DNA manusia yang dapat diperoleh
dari metode ekstraksi DNA yang berbeda