LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

DAN

UJI KEMURNIAN ( KLT DUA DIMENSI)

TUJUAN

1. Mampu menjelaskan proses yang terjadi pada senyawa dengan metode

KLTP
2. Mampu menjelaskan mekanisme kerja KLT dua dimensi

TINJAUAN PUSTAKA

A.Klasifikasi Tanaman Kunyit (Metode KLTP)

Kerajaan : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiosspermae

Kelas : Monocotyledonae

Ordo : Zingiberales

Familia : Zingiberaceae

Genus : Curcuma

Spesies : Curcuma domestica Val

Morfologi Tanaman Kunyit

Tanaman kunyit meruapakan tanaman jangka panjang atau tahunan dengan

dauan besar bertentuk elpis, 3-8 buah, panjang hingga mencapai 85 cm, lebar
samai 25 cm, pangkal daun meruncing, dan berwarna hijau mudah atau tua.

Batang tanaman kunyit adalah semu yang berwarna hijau dan keungguan, tinggi
batang mencapai 1,60 meter. Perbungan tanaman ini muncul dari rimpang,
terletak di batang, ibu tangkai bungan berambut kasar dan rapat. Saat kering
memiliki ketebalan mencapai 2-5 mm, panjang 16-40 cm, dauan kelopak
berambut berbentuk lanset dengan panajang 4-8 cm, lebar 2-3,5 cm, berwarna
hijau, berbentuk bulat telur, dan memilili bagian ujung terbelah-belah.

Bentuk bunga tanaman ini majemuk, mahkota berwana putih. Bagian dalam
berupa rimpang yang mempunyai bagian berbeda dengan zingibermwarna bagian
dalam kuning jingga atau pusatnya lebih pucat atau warna tidak jelas.

B. Uraian Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908),
seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa Yunani
(chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti penulisan dengan
warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu
fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat
padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas
(Kennedy, 1990).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-
komponen campuran dimana cuplikan berkesetimbangan di antara dua fasa, fasa
gerak yang membawa cuplikan dan fasa diam yang menahan cuplikan secara
selektif. Bila fasa gerak berupa gas, disebut kromatografi gas, dan sebaliknya kalau
fasa gerak berupa zat cair, disebut kromatografi cair (Hendayana, 1994).
Kromatografi ialah cara pemisahan berdasarkan perbedaan kecepatan zat-
zat terlarut yang bergerak bersama-sama dengan pelarutnya pada permukaan
suatu benda penyerap. Cara ini umum dilakukan pada pemisahan zat-zat
berwarna (bahasa Yunani: chromos = warna) (Kennedy, 1990).
Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari
berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem yang
terdiri dari fase diam dan fase bergerak. Semua pemisahan pada kromatografi
tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing komponen diantara kedua
fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan (terhambat) lebih lemah
oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang tertahan lebih
kuat. Perbedaan gerakan (mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya
disebabkan oleh perbedaan dalam adsorbs, partisi, kelarutan atau penguapan
diantara kedua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi
pemisahan secara sempurna. Oleh karena itu dalam kromatografi, pemilihan
terhadap fase bergerak maupun fase diam perlu dilakukan sedemikian rupa
sehingga semua komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda
agar dapat terjadi proses pemisahan (Ibnu, 2005).
Meski banyak terdapat metode seperti yang telah disebutkan di atas,
terdapat metode lain yang pembiayaannya paling murah dan memakai peralatan
paling dasar yaitu Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP). adsorben yang paling
banyak digunakan yaitu silika gel yang dipakai untuk pemisahan campuran lipofil
maupun senyawa hidrofil. ketebalan adsorben yang paling sering digunakan ialah
0,5–2 mm. pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran plat sudah tentu
mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Ukuran partikel
dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat mutu KLT (Heftmann,
2003).
Pada kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan
ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan
secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi
beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu
tanwarna, dan penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca.
Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna
untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk
telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan
alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk
memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis
kuantitatif (Nasution, 2010).
Proses isolasi kromatografi lapis tipis preparatif terjadi berdasarkan
perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen
kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen, oleh karena daya serap
adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak
dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan
pemisahan (Munson, 2010).
Adsorben yang paling banyak digunakan dalam kromatografi lapis tipis
adalah silika gel dan aluminium oksida. Silika gel umumnya mengandung zat
tambahan Kalsium sulfat untuk mempertinggi daya lekatnya. Zat ini digunakan
sebagai adsorben universal untuk kromatografi senyawa netral, asam dan basa.
Aluminum iksida mempunyai kemampuan koordinasi dan oleh karena itu sesuai
untuk pemisahan senyawa yang mengandung gugus fungsi yang berbeda.
Aluminium okida mengandung ion alkali dan dengan demikianbereaksi sebagai
basa dalam suspensi air. Disamping kedua adsorben yang sangat aktif ini dalam
hal tertentu dapat digunakan “kieselgur” yang kurang aktif sebagai lapis sorpsi
(Munson, 2010).
Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca yang
dapat menampung beberapa plat. Koefisien pemisahan dapat ditingkatkan
dengan cara pengembangan berulang. Harus diperhatikan bahwa semakin lama
senyawa berkontak dengan penyerap maka semakin besar kemungkinan
penguraian (Nasution, 2010)
Klasifikasi Ilmiah

Kunyit yang memunyai nama latin Curcuma domestica Val. merupakan tanaman yang
mudah diperbanyak dengan stek rimpang dengan ukuran 20-25 gram stek. Bibit
rimpang harus cukup tua. Kunyit tumbuh dengan baik di tanah yang tata pengairannya
baik, curah hujan 2.000 mm sampai 4.000 mm tiap tahun dan di tempat yang sedikit
terlindung. Tapi untuk menghasilkan rimpang yang lebih besar diperlukan tempat
yang lebih terbuka. Rimpang kunyit berwarna kuning sampai kuning jingga. (Sumiati ,
2004.)

 Kerajaan : plantae
 Divisio : Spermatophyta
 Sub-diviso : Angiospermae
 Kelas : Monocotyledoneae
 Ordo : Zingiberales
 Famili : Zungiberaceae
 Genus : Curcuma
 Species : Curcumadomestica Val.
kandungan farmakologi
Beberapa kandungan kimia dari rimpang kunyit yang telah diketahui yaitu miny`k
atsiri sebanyak 6% yang terdiri dari golongansenyawa monoterpendan sesquiterpen
Beberapa kandungan kimia dari rimpang kunyit yang telah diketahui yaitu miny`k
atsiri sebanyak 6% yang terdiri dari golongansenyawa monoterpendan sesquiterpen
(meliputi zingiberen, alfa dan beta-turmerone). zat warna kuning yang disebut
kurkuminoid sebanyak 5% (meliputi kurkumin 50-60%,monodesmetoksikurkumin dan
bidesmetoksikurkumin), protein, fosfor, kalium, besi dan vitamin C. Dari ketiga
senyawa kurkuminoid tersebut,kurkumin merupakan komponen terbesar. Sering
kadar total kurkuminoiddihitung sebagai % kurkumin, karena kandungan kurkumin
paling besar dibanding komponen kurkuminoid lainnya. Karena alasan tersebut
beberapa penelitian baik fitokimia maupun farmakologi lebih ditekankan pada
kurkumin.(Sumiati , 2004.)
(meliputi zingiberen, alfa dan beta-turmerone). zat warna kuning yang disebut
kurkuminoid sebanyak 5% (meliputi kurkumin 50-60%,monodesmetoksikurkumin dan
bidesmetoksikurkumin), protein, fosfor, kalium, besi dan vitamin C. Dari ketiga
senyawa kurkuminoid tersebut,kurkumin merupakan komponen terbesar. Sering
kadar total kurkuminoiddihitung sebagai % kurkumin, karena kandungan kurkumin
paling besar dibanding komponen kurkuminoid lainnya. Karena alasan tersebut
beberapa penelitian baik fitokimia maupun farmakologi lebih ditekankan pada
kurkumin.(Sumiati , 2004.)

Morfologi tanaman kunyit atau ciri-ciri

Tanaman kunyit tumbuh bercabang dengan tinggi 40-100 cm. Batang merupakan
batang semu, tegak, bulat, membentuk rimpang dengan warna hijau kekuningan dan
tersusun dari pelepah daun (agak lunak). Daun tunggal, bentuk bulat telur (lanset)
memanjang hingga 10-40 cm, lebar 8-12,5 cm dan pertulangan menyirip dengan
warna hijau pucat. Berbunga majemuk yang berambut dan bersisik dari pucuk batang
semu, panjang 10-15 cm dengan mahkota sekitar 3 cm dan lebar 1,5 cm, berwarna
putih/kekuningan. Ujung dan pangkal daun runcing, tepi daun yang rata. Kulit luar
rimpang berwarna jingga kecoklatan, daging buah merah jingga kekuning-kuningan.

2. Uji kemurnian

Kemurnian baku

Kemurnian baku (standard of purity) merupakan ungkapan yang menyatakan

senyawa bebas dari senyawa asing atau batas toleransi maksimum terhadap cemaran/
senyawa asing yang masih diperbolehkan.Senyawa dikatakan murni, bila senyawa
tersebut bebas dari senyawa asing atau mengandung senyawa asing dalam batas yang
diperbolehkan.Kemurnian senyawa sangat erat kaitannya dengan khasiat dan keamanan
penggunaannya.

Contoh pernyataan kemurnian baku

— Senyawa sejenis. Lakukan penetapan dengan cara kromatografi lapis tipis, dst.
— Cemaran secara kromatografi. Cemaran total tidak lebih dari 2,0% dan cemaran
masing-masing tidak lebih dari 0,5%.

— Air, Metode I, Tidak lebih dari 2,0%.

— Susut pengeringan. Tidak lebih dari 3,0%, lakukan pengeringan pada suhu 105o selama
2 jam.

— Sisa pemijaran. Tidak lebih dari 0,1%.

— Logam berat, Metode III. Tidak lebih dari 20 bpj.

— Cemaran senyawa organik mudah menguap. Metode V, Memenuhi syarat.

— Selenium. Tidak lebih dari 30 bpj

Asal senyawa asing/cemaran

Bahan asal atau bahan baku pembuatan

Proses sintesis atau isolasi

Hasil urai bahan yang tidak stabil

Hasil antara yang tidak sempurna dihilangkan pada saat pemurnian atau diubah menjadi
hasil utama.

Hasil reaksi samping yang tidak sempurna dihilangkan.

Saat penyimpanan

Cemaran udara

Serangga, tikus, ulat dan binatang lainnya.

Tanda kemurnian

· Kadar senyawa utamanya 100%.

 · Mempunyai tetapan fisika (suhu lebur, suhu didih, indeks bias, rotasi jenis) yang unik
bukan rentang dan sesuai dengan pustaka (data base).

Tanda kemurnian dan derajat kemurnian ini sangat sulit dicapai, karena proses
pemurnian dan pemisahan belum tentu tuntas sempurna menghilangkan semua
cemaran/senyawa asing. Sehingga senyawa dimungkinkan masih terdapat sejumlah
“kecil” senyawa asing.

Tingkat/derajat kemurnian

Derajat kemurnian senyawa ditentukan oleh tiga hal, yaitu:

1. Kegunaan dari senyawa tersebut, misalnya pro analisis, pharmaceutical grade, pure,
teknis, dll.
2. Kandungan cemaran yang masih diperkenankan, misalnya kadar air, susut pengeringan,
logam berat, dll.
3. Kandungan bahan aktif/utama, misalnya mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak
lebih dari 101,0% dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

Sesuai dengan persyaratan IPTEKS dan keamanan yang lebih ketat, maka derajat
kemurnian bahan akan berubah menjadi ketat lagi, terlebih lagi bagi senyawa yang
digunakan dalam pengobatan.

Pemeriksaan Kemurnian

Derajat kemurnian suatu senyawa dapat dtetapkan melalui uji penetapan kadar senyawa
aktif/utamanya dan atau uji kemurnian.

Uji kemurnian merupakan pengujian kualitatif, semi kuantitatif dan kuantitatif senyawa
asing/cemaran yang masih ada atau diduga ada dalam senyawa yang diuji.

Jumlah senyawa asing/cemaran pada umumnya sangat kecil tetapi berbahaya bagi
kesehatan, oleh karena itu diperlukan suatu metode/prosedur analisis yang sensitif dan
mudah dalam pengamatannya.
 Faktor yang Harus diperhatikan untuk mengoreksi kesalahan pengamatan

 Kespesifikan reaksi kimia yang digunakan.

 Kepekaan reaksi.
 Pengawasan terhadap kesalahan personal, yang dapat diatasi dengan cara sebagai
berikut:

1. Melakukan uji reaksi negatif.

2. Melekukan uji pembandingan dengan larutan pembanding yang mengandung cemaran
dalam kadar tertentu seperti yang dipersyaratkan monografi.
3. Melakukan penetapan kuantitatif cemaran yang dimaksud

Jenis senyawa asing/cemaran

1. Cemaran anorganik (kation dan anion/radikal asam).

2. Cemaran organik (bahan organik asing: hasil urai, senyawa antara, hasil samping, dll)
3. Cemaran umum, meliputi kadar air, susut pengeringan, sisa pemijaran/kadar abu dan
kemurnian kromatografi.
4. Residu pelarut/senyawa mudah menguap

1. Cemaran Organik

 Senyawa asing/cemaran organik dalam zat berasal dari hasil urai, senyawa asam atau basa
bebasnya, senyawa antara, senyawa sejenis atau hasil samping reaksi sintesis atau isolasi
yang tidak sempurna dihilangkan pada saat pemurniannya.
 Beberapa senyawa asing bersifat toksis atau memberikan efek yang lain yang berbeda
dengan zat utamanya maka keberadaannya harus diuji untuk menjamin khasiat dan
keamanannya.
 Pengujian terhadap adanya senyawa asing dan cemaran dimaksudkan untuk membatasi
senyawa demikian sampai pada jumlah yang tidak mempengaruhi zat pada kondisi
penggunaan biasa.
 A. Metode kimia

 Pengujian adanya cemaran organik dapat dilakukan dengan menggunakan reaksi kimia
yang khas dan peka.
 Gejala yang diamati adalah hasil reaksi yang dapat diamati: pembentukan warna, endapan
atau tidak terjadi reaksi (“no visual reaction”). Kadang-kadang hasil reaksi dilanjutkan
dengan analisis lanjut untuk dihitung kadarnya.
 Pengujian secara kimia sangat sulit karena jenis dan kadarnya sangat sedikit. Di samping
itu sifat reaktivitasnya kadang-kadang sama dengan zat yang diuji.

Contoh :

1. Uji alkaloida lain ( dari kofein).Pada larutan jenuh dingin dalam air, tambahkan 1 ml
larutan kalium tetraiodo hidrargirat (II): tidak terbentuk endapan.
2. Uji kofein, teobromin dan paraxantin (dari teofilin). Kocok 200 mg zat dengan 5 ml kalium
hidroksida encer P atau amonia encer: larutan tetap jernih.
3. 4-aminofenol (dalam parasetamol). Tidak lebih dari 0,005% diukur setelah direaksikan
dengan pereaksi natrium nitroprusida basa, setelah 30 menit warna biru tidak lebih tua
dari larutan pembanding yang mengandung parasetamol dan 4-aminofenol.

B. Uji batas

1. Cemaran senyawa pereduksi: adanya aldehid, keton atau gula dalam suatu bahan obat.
2. Kontaminasi oleh senyawa tidak jenuh.
3. Kontaminasi senyawa peroksida.
4. Kontaminasi metanol dalam etanol
5. Cemaran alkaloida lain

Contoh Uji batas alkaloida lain

Contoh uji kontaminasi obat sintetik oleh senyawa antara.

C. Penetapan kuantitatif
 • Ketika cemaran/senyawa asing tidak diketahui secara khusus dan uji batas dengan
cara kimia tidak dapat digunakan dalam menunjukkan adanya pencemaran, maka
penetapan kadar cemaran umum dapat dilakukan.

• Cara ini digunakan untuk penetapan:

1. Batas bahan yang tidak larut

2. Batas bahan terlarut
3. Batas lengas dan bahan menguap pada 105o
4. Batas bahan tidak menguap
5. Batas sisa pemijaran
6. Batas susut pemijaran
7. Kadar abu

Batas bahan tidak larut

ž Pengujian dilakukan melalui uji kejernihan larutan dalam pelarut tertentu.

ž Misalnya: Senyawa barbiturat larut seperti Natrium barbiturat harus diuji adanya bahan
yang tidak larutnya yaitu senyawa asam barbiturat. Pengujian dilakukan dengan cara
melarutkan dalam air dengan perbandingan tertentu: seharusnya terbentuk larutan jernih
tidak boleh ada partikel yang tidak melarut.

ž Bahan yang tidak melarut dapat diukur kadarnya dengan cara filtrasi, endapan yang
tersisa di atas filter ditimbang setelah dikeringkan.

Penetapan kadar air <1031>

— Sebagian besar bahan berupa senyawa hidrat atau mengandung air dalam bentuk
terserap. Oleh karena itu penetapan kadar air penting untuk memenuhi standar.

— Tergantung bahannya, dalam masing-masing monografi tercantum metode

penetapan kadar air dalam bahan.

— Jika bahan mengandung air hidrat, dapat digunakan metode titrimetri (Titrasi Karl
Fischer), metode distilasi azeotropi atau metode gravimetri (lihat kuliah AFA).
 Susut Pengeringan

• Merupakan jumlah bahan yang dapat menguap pada pengeringan dalam oven 105o.

• Beberapa zat dapat menyerap lengas pada permukaan selama penyimpanan.

Adanya air lengas ini dapat memicu pertumbuhan bakteri atau reaksi penguraian seperti
hidrolisis yang mengakibatkan mutu zat menurun.

• Kadar air lengas perlu dibatasi dan dikontrol.

• Kalau bahan yang menguap pada pengujian itu hanyalah air, maka susut pengeringan
akan sama dengan kadar airnya.

• Tetapi kalau tidak sama, maka berarti ada komponen lain dalam zat yang menguap
pada 105o tersebut.

Penetapan susut pengeringan (1121)

ž Tara botol timbang dangkal dengan tutupnya yang telah dikeringkan selama 30 menit
pada kondisi percobaan.

1. Masukkan zat uji kedalam botol timbang tersebut dan timbang seksama botol beserta
isinya (kurang lebih 1 – 2 g zat), perlahan-lahan permukaan zat diratakan sehingga
merupakan tumpukan setinggi 5 – 10 mm.

2.Masukkan ke dalam oven pengering, buka tutupnya dan biarkan didalam oven lalu
dikeringkan pada suhu (+2) dan selama waktu yang telah ditetapkan monografi.

3. Pada saat oven dibuka, segera botol ditutup dan keluarkan dari oven dan masukkan ke
dalam desikator sampai suhunya mencapai suhu kamar.

4.Timbang botol beserta isi dan tutupnya hingga bobot tetap. Susut pengeringan dapat
dihitung dari selisih bobot zat sebelum dan sesudah dikeringkan.

Sisa pemijaran

Batas ini diterapkan pada tiga jenis senyawa yaitu:

1. Senyawa yang menguap sempurna pada saat pemijaran tanpa ada residu.
2. Senyawa yang terdekomposisi pada saat pemijaran dan meninggalkan residu (hasil
dekomposisinya)
3. Senyawa yang dikontaminasi oleh cemaran anorganik yang akan meninggalkan residu
pada saat pemijaran (berupa logam oksida).

Penetapan sisa pemijaran

• Tara krus platina atau silika yang telah dipijar selama 1 jam pada kondisi percobaan.

• Masukkan 1 -2 g zat kedalam krus lalu ditimbang beserta isinya.

• Panaskan di atas api kecil sampai terjadi pengarangan sempurna. Dinginkan

• Teteskan 1 ml asam sulfat pekat dan panaskan lagi sampai asap putih menghilang.

• Pijarkan dalam tanur 800o sampai arang habis terbakar.

• Keluarkan krus dari tanur, masukkan dalam desikator dan dinginkan sampai suhu
kamar.

• Timbang hingga bobot tetap. Sisa pemijaran merupakan selisih bobot krus setelah
dipijar dengan bobot krus kosong.

Penetapan kuantitatif lainnya

Penetapan kuantitatif lainnya pada pengujian kemurnian adalah penetapan bilangan

kimia dalam sampel berupa minyak dan lemak (lihat AFO) yaitu:

1. Bilangan Asam
2. Bilangan Penyabunan
3. Bilangan Ester
4. Bilangan Hidroksil
5. Bilangan iodida
 Metode spektrofotometri

Pengujian adanya cemaran organik dalam senyawa obat dapat dilakukan berdasarkan
pada pengukuran serapan di daerah UV atau VIS, atau kadar cemaran setelah direaksikan
dengan suatu pereaksi yang spesifik.

Pengujian yang dilakukan:

1. Perbandingan serapan pada dua panjang gelombang (A1/A2)

2. Harga serapan pada satu panjang gelombang.
3. Penetapan kadar cemaran setelah direaksikan dengan pereaksi spesifik secara
spektrofotometri.

Contoh pengujian cemaran secara spektrofotometri

1. Perbandingan serapan pada dua panjang gelombang.

Pada fenoksi metilpenisilina: Larutkan kurang lebih 100 mg dalam 5 ml larutan

natriumm bikarbonat LP, encerkan dengan air hingga 500 ml. Ukur serapan 1 cm larutan
pada 268 nm dan 274 nm. Perbandingan serapan pada 268 nm terhadap 274 nm tidak
kurang dari 1,21 dan tidak lebih dari 1,24.

2. Harga serapan pada satu panjang gelombang.

Untuk oksitetrasiklin: Spektrum ultraviolet dalam asam klorida 0,01N menunjukkan

maksimum pada 268 dan 353 nm. Serapan 1 cm larutan 0,001% dalam asam klorida 0,01N
pada 268 nm adalah 0,37 sampai 0,40, dan pada 353 nm adalah 0,27 sampai 0,29.

3. Penetapan kadar cemaran, setelah direaksikan dengan suatu pereaksi khas.

Kadar p-Aminofenol bebas dalam Parasetamol: Masukkan 5,0 g zat ke dalam labu takar
100,o ml, larutkan dalam 75 ml campuran metanol-air (1:1), tambahkan 5,0 ml larutan
natrium nitroprusida basa. Encerkan dengan campuran metanol-air (1:1) hingga tanda.
Biarkan selama 30 menit. Ukur serapan larutan ini dan larutan p-aminofenol yang dibuat
dengan cara yang sama pada 710 nm. Menggunakan 5,0 ml larutan natrium nitroprusida
basa sebagai blangko.
 4. Penetapan kadar senyawa utuh/bebasnya.

Betametason bebas: Tidak lebih dari 1,0%. Larutkan 25,0 mg dalam air 25,0 ml.
Pindahkan 5,0 ml larutan ke dalam corong pisah, ekstraksi tiga kali masing-masing dengan
25 ml kloroform. Kumpulkan sari dan uapkan serta residunya dilarutkan dalam metanol
hingga 25,0 ml. Ukur serapan pada 239 nm. Hitung Betametason bebas dengan rumus=
3,25 A.

Metode Kromatografi

Berkat keunggulan yang dimilikinya, teknik kromatografi sering digunakan untuk

mendeteksi adanya cemaran organik. Kromatografi lapis tipis, kromatografi gas, dan
kromatografi cair kinerja tinggi ketiganya direkomendasikan oleh beberapa Farmakope,
termasuk FI IV. KLT lebih banyak dipakai karena lebih cepat, sederhana dan tidak
memerlukan keahlian yang khusus.

Kromatografi lapis tipis

Prosedur umum pengujian kemurnian dengan KLT adalah:

1. Di mana struktur cemaran diketahui. Cemaran yang dimaksud merupakan hasil urai atau
senyawa utuhnya. Beberapa Farmakope telah mencantumkan cemaran-cemaran yang
dimaksud (lihat BP dan USP).
2. Di mana struktur cemaran belum diketahui strukturnya, masih prakiraan saja belum
sempurna dinyatakan. Biasanya zat yang berasal dari alam (tumbuhan dan fermentasi)

Cemaran sudah diketahui.

Uji batas dengan KLT berdasarkan pada uji pembandingan kromatogram larutan pekat
bahan yang diuji dengan larutan encer cemaran yang telah diketahui.

Intensitas dari bercak dari cemaran pada kromatogram bahan yang diuji dibandingkan
dengan intensitas bercak cemaran pada lempeng yang sama.

Bercak cemaran pada larutan bahan yang diuji tidak boleh seintensif bercak pada
larutan cemaran pada kromatogram yang sama.
Contoh:

• Uji batas 4-epianhidrotetrasiklin

Fase diam : silika gel/tanah silika yang telah dicuci dengan asam HCL disuspensikan
dalam poliglikol 400 dalam gliserol dan Na EDTA 0,1 N pH 7 lalu dibuat lapis tipis diatas
lempeng kaca. dan dibacam dalam larutan amonium klorida P.

Fase gerak: Campuran Na EDTA pH 7, etil asetat, kloroform dan aseton (1:1:3).

Penampak bercak: lampu UV 366 nm.

Larutan Uji : larutan 0,1% tetrasiklin dalam metanol.

Larutan baku cemaran: larutan 4-epianhidrotetrasiklin 0,005%.

Hasil amatan: Kecuali bercak utama terdapat bercak yang tidak lebih intensif dari
bercak baku cemaran.

Pada FI IV, prosedur bukan KLT tetapi kromatografi kolom dengan sistem yang mirip
(lihat <311>, hal 926).

• Cemaran hidrokortison dalam hidrokortison asetat.

Bercak yang dibuat dari 5 μL larutan 1% hidrokortison asetat dan bercak lain pada
lempeng yang sama 5μL larutan 0,01% hidrokortison, lempeng dikembangkan dalam
bejana yang berisi campuran metilenklorida-eter-metanol-air (77:15:8:1,2). Bercak
diamati di bawah lampu UV.

Hasil kalau intensitas bercak analit lebih kuat daripada bercak cemaran, maka zat uji
tidak memenuhi syarat uji batas. Batas yang dipersyaratkan adalah [0,01/1] x 100 = 1%
hidrokortison yang masih boleh ada dalam bahan baku hidrokortison asetat.

Kalau struktur cemaran tidak diketahui

• Beberapa senyawa tercemari oleh cemaran yang tidak diketahui strukturnya.

• Untuk mengujinya dilakukan penotolan bercak dari larutan pekat dan larutan yang
encer (hasil pengenceran tertentu).
• Misalnya uji kodein hasil ekstraksi dari poppy opium, dibuat bercak 10μL larutan
4,0% kodein, 0,06% kodein (larutan 2) dan 0,04% kodein (larutan 3). Lempeng
dikembangkan dalam bejana berisi campuran etanol-siklohexan-amonia 13,5% (72:30:6).
Bercak disemprot dengan larutan Dragendorff.

• Hasil amatan: Tidak boleh ada bercak kedua selain bercak utama yang lebih intensif
dari bercak larutan 2. Tidak boleh ada bercak selain bercak kedua yang mempunyai Rf
lebih besar dari bercak larutan 3.

• Batas dua cemaran itu adalah:

a. cemaran I = 0,06/4 x 100 = 1,5%

b. cemaran II = 0,04/4 x 100 = 1,0%

Uji KLT untuk cemaran umum

• Uji cemaran umum yang tertera pada monografi digunakan untuk menilai profil
cemaran suatu bahan. Uji cemaran tersebut menggunakan KLT<481>, hal 947.

• Fase diam digunakan silika gel P setebal 0,25 mm.

• Fase gerak sesuai tertera pada monografi

• Penampak bercak : bermacam-macam sesuai monografi ( ada 22 jenis penampak

bercak KLT dalam FI IV).

• Pengamatan : Tidak ada bercak lain selain dari bercak utama.

CEMARAN SENYAWA ORGANIK MUDAH MENGUAP

• Diuji dengan kromatografi gas. FI IV memuat prosedur uji cemaran senyawa organik
mudah menguap <471>, hal 943.

• Metode khusus yang digunakan dan jenis metode yang diperlukan diuraikan di dalam
masing-masing monografi.
 • Yang termasuk cemaran mudah menguap adalah antara lain pelarut organik dan gas
yang digunakan dalam pembuatan bahan baku atau proses pembuatan sediaan dan
sterilisasi atau cemaran hasil urai bahan baku.

• Cemaran mudah menguap, antara lain:

1. Etilen dioksida (batas 10 bpj)

2. Dimetil anilin (dalam bupivakain)
3. Metilen klorida (dalam tablet salut)
4. Glutaraldehida (dalam film polimer)
5. Benzena (batas 100 bpj)
6. Klororoform (batas 50 bpj)
7. 1,4 dioksan ( batas 100 bpj)
8. Trikloroetilen (batas 100 bpj)

Prosedur BP untuk penetapan residu pelarut

Prosedur KG untuk cemaran mudah menguap

ž Bermacam-macam prosedur/metode yang dilakukan dalam FI IV adalah Metode I

hingga metode VI, dan metode khusus untuk metilen klorida.

ž Headspace analysis, Dalam prosedur ini sampel ditempatkan dalam vial yang bertutup
karet kuat bersama-sama pelarut yang tidak menguap misalnya air. Vial dipanaskan dan
dikocok hingga setimbang dan sebuah alat suntik diinjeksikan ke dalam vial tsb lalu
disedot sejumlah 1 ml gas yang ada di atas campuran tsb. Kemudian diinjeksikan ke
kromatograf gas.

Pengambilan sampel pada headspace analysis

Kemurnian kromatografi

• Kemurnian kromatografi adalah uji kemurnian yang dilakukan dengan kromatografi

(KLT, KCKT dan KG).

• Uji dengan KCKT dapat dilakukan dengan dua cara yaitu prosedur di mana cemaran
belum diketahui strukturnya dan prosedur dimana cemaran sudah diketahui prosedurnya
Klasifikasi Ilmiah

Kunyit yang memunyai nama latin Curcuma domestica Val. merupakan tanaman yang
mudah diperbanyak dengan stek rimpang dengan ukuran 20-25 gram stek. Bibit
rimpang harus cukup tua. Kunyit tumbuh dengan baik di tanah yang tata pengairannya
baik, curah hujan 2.000 mm sampai 4.000 mm tiap tahun dan di tempat yang sedikit
terlindung. Tapi untuk menghasilkan rimpang yang lebih besar diperlukan tempat
yang lebih terbuka. Rimpang kunyit berwarna kuning sampai kuning jingga. (Sumiati ,
2004.)

 Kerajaan : plantae
 Divisio : Spermatophyta
 Sub-diviso : Angiospermae
 Kelas : Monocotyledoneae
 Ordo : Zingiberales
 Famili : Zungiberaceae
 Genus : Curcuma
 Species : Curcumadomestica Val.
kandungan farmakologi
Beberapa kandungan kimia dari rimpang kunyit yang telah diketahui yaitu miny`k
atsiri sebanyak 6% yang terdiri dari golongansenyawa monoterpendan sesquiterpen
Beberapa kandungan kimia dari rimpang kunyit yang telah diketahui yaitu miny`k
atsiri sebanyak 6% yang terdiri dari golongansenyawa monoterpendan sesquiterpen
(meliputi zingiberen, alfa dan beta-turmerone). zat warna kuning yang disebut
kurkuminoid sebanyak 5% (meliputi kurkumin 50-60%,monodesmetoksikurkumin dan
bidesmetoksikurkumin), protein, fosfor, kalium, besi dan vitamin C. Dari ketiga
senyawa kurkuminoid tersebut,kurkumin merupakan komponen terbesar. Sering
kadar total kurkuminoiddihitung sebagai % kurkumin, karena kandungan kurkumin
paling besar dibanding komponen kurkuminoid lainnya. Karena alasan tersebut
beberapa penelitian baik fitokimia maupun farmakologi lebih ditekankan pada
kurkumin.(Sumiati , 2004.)
(meliputi zingiberen, alfa dan beta-turmerone). zat warna kuning yang disebut
kurkuminoid sebanyak 5% (meliputi kurkumin 50-60%,monodesmetoksikurkumin dan
bidesmetoksikurkumin), protein, fosfor, kalium, besi dan vitamin C. Dari ketiga
senyawa kurkuminoid tersebut,kurkumin merupakan komponen terbesar. Sering
kadar total kurkuminoiddihitung sebagai % kurkumin, karena kandungan kurkumin
paling besar dibanding komponen kurkuminoid lainnya. Karena alasan tersebut
beberapa penelitian baik fitokimia maupun farmakologi lebih ditekankan pada
kurkumin.(Sumiati , 2004.)

Morfologi tanaman kunyit atau ciri-ciri

Tanaman kunyit tumbuh bercabang dengan tinggi 40-100 cm. Batang merupakan
batang semu, tegak, bulat, membentuk rimpang dengan warna hijau kekuningan dan
tersusun dari pelepah daun (agak lunak). Daun tunggal, bentuk bulat telur (lanset)
memanjang hingga 10-40 cm, lebar 8-12,5 cm dan pertulangan menyirip dengan
warna hijau pucat. Berbunga majemuk yang berambut dan bersisik dari pucuk batang
semu, panjang 10-15 cm dengan mahkota sekitar 3 cm dan lebar 1,5 cm, berwarna
putih/kekuningan. Ujung dan pangkal daun runcing, tepi daun yang rata. Kulit luar
rimpang berwarna jingga kecoklatan, daging buah merah jingga kekuning-kuningan.

Spektrofotometri

Pengertian Spektrofotometri

Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas
cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energy relatif jika energy tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan
sebagai fungsi panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dengan fotometer
adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih di deteksi dan cara ini diperoleh
dengan alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter dari
berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek pada panjang gelombang
tertentu (Gandjar,2007)
Prinsip Kerja Spektrofotometri

Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya. Suatu daerah

akan diabsorbsi oleh atom atau molekul dan panjang gelombang cahaya yang diabsorbsi
dapat menunjukan struktur senyawa yang diteliti. Spektrum elektromagnetik meliputi
suatu daerah panjang gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek
berenergi tinggi sampai pada panjang gelombang mikro (Marzuki Asnah 2012)

Spektrum absorbsi dalam daerah-daerah ultra ungu dan sinar tampak umumnya
terdiri dari satu atau beberapa pita absorbsi yang lebar, semua molekul 4 dapat menyerap
radiasi dalam daerah UV-tampak. Oleh karena itu mereka mengandung electron, baik
yang dipakai bersama atau tidak, yang dapat dieksitasi ke tingkat yang lebih tinggi.
Panjang gelombang pada waktu absorbsi terjadi tergantung pada bagaimana erat
elektron terikat di dalam molekul. Elektron dalam satu ikatan kovalen tunggal erat
ikatannya dan radiasi dengan energy tinggi, atau panjang gelombang pendek, diperlukan
eksitasinya (Wunas,2011)

Spektrofotometer UV-Vis

Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan

Visible yang menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya Visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator. Spektrum absorpsi dalam daerah-daerah ultraviolet dan sinar
tampak terdiri dari satu atau beberapa pita absorpsi.

Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling popular
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sampel berwarna
juga untuk sampel tak berwarna seperti senyawa organik yang berdasarkan transisi atau
dan karena itu memerlukan kromofor di dalam molekulnya. Transisi ini terjadi dalam
daerah spektrum kira – kira 200-700 nm.

Spektrokopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis

atau UV/Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti
menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat
dengan inframerah (NIR) kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara
langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari 8 spektrum
elektromagnetik, molekul mengalami transisi elektronik. Teknik ini melengkapi
fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan transisi dari ground state ke
eksited state.

Semua molekul dapat mengabsorpsi radiasi daerah UV-Vis karena mengandung

elektron, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang
lebih tinggi. Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap
oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan
sehari-hari disebut warna komplementer
PROSEDUR

1. kromatografi lapis tipis preparative

Masukkan eluen ke dalam Siapkan silica yang sudah diukur

chamber, dan jenuhkan tanda batas atas dan bawah .
selama 1 jam

Jika sudah ditotolkan Kemudian hasil yang diuapkan

masukkan silica pada ditotolkan pada silica,
chamber yang berisi eluen menotolkan nya jangan terlalu
yang sudah dijenuhkan besar karena akan meleber

Tempat penotolan tidak boleh terendam

eluen, chamber ditutup. Biarkan sampai eluen
mencapai batas atas. Setelah mencapai tanda
batas atas dikeluarkan dan diamati bercak
pada sinar UV dengan panjang gelombang 365
nm
 2. prosedur 2 dimensi

Siapkan isolate rimpang kunyit Kemudian larutan dengan etil

dengan cara mengerok KLTP asetat dan selanjutnya
dengan Rf mendekati Rf disentrifugasi
kurkumin

Dekantasi hasil sentrifugasi.

Buat tanda pada plat yang Aktivasi plat KLT pada oven suhu
sudah diaktivasi 105C selama 15 menit.

Jenuhkan eluen pada

Putar plat 90derajat.
chamber. Masukkan pada
chamber biarkan terelusi Elusi dengan eluen yang
angkat keringkan lebih polar
Hasil KLTP dan KLTP dua Dimensi

No Vial Nilai Rf

Vial 2 dan 3 Niali Rf 1= 0,6, Rf2=0,76 Rf3= 0,9

spektrofotometri UV-Vis
PEMBAHASAN KLTP
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom,
perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi
resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram. Pada
kromatografi lapis tipis preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa
garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar dan dikembangkan secara tegak lurus
pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanwarna, dan
penyerap yang mengandung senyawa pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian
cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah
pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang
lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan
yang murni untuk mengkalibrasi kromatografi lapis tipis kuantitatif.
Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah ekstrak kunyit
(Curcuma longa Linn. syn./Curcuma domestica Val.) dan senyawa yang akan
dipisahkan yaitu senyawa flavonoid. Prinsip dari kromatografi Lapis Tipis
Preparatif yaitu adsorpsi dan partisi, adsorpsi yaitu penyerapan pada permukaan
oleh adanya fase diam (silica) sedangkan partisi yaitu pemisahan oleh adanya fase
gerak (eluen). Tujuan dilakukannya praktikum ini yaitu untuk mendapatkan isolate
aktif dari sampel ekstrak kunyit. Dalam praktikum ini, yang dilakukan yaitu
kromatografi lapis tipis preparatif. Dimana faksi terbaik dari percobaan
sebelumnya diambil kemudian dibuat eluen sesuai dengan fraksi yang dipilih. Lalu
fraksi ditotol pada lempeng KLT dengan penotolan yang berkesinambungan.
Setelah itu lempeng di elusi di dalam chamber dengan menggunakan eluen
kloroforom : metanol (9:1), setelah nodanya naik dilihat pada UV 254 nm dan 366
nm kemudian tandai noda yang tampak seperti pita, didapatkan 3 pita yang masing-
masing memiliki nilai Rf dan pada pita kedua didapatkan nilai Rf 0,7 yang
berdasarkan literature merupakan Rf yang mengindikasikan adanya senyawa
flavonoid. Kemudian, noda yang nampak dikeruk dan dimasukkan ke dalam botol
sentrifug kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 800 rpm.
Setelah terbentuk endapan hasilnya disaring dan dimasukkan ke dalam vial. Hasil
yang didapat kemudian digunakan untuk percobaan selanjutnya.
PEMBAHASAN KLT 2 DIMENSI
Praktikum kali ini membahas mengenai KLT dua dimensi dan multi eluen
dengan menggunakan ekstrak dari hasil kerokan KLT-Preparatif ekstrak kunyit.
Pertama-tama, hasil kerokan dari lempeng dilarutkan dengan etanol yang
merupakan pelarut awal pada saat pengekstrakan kemudian sampel yang telah
dilarutkan di sentrifugasi untuk memisahkan filtrat. Hasil sentrifugasi, endapannya
dipisahkan dan dibuang sedangkan larutan yang didapat digunakan untuk KLT 2D
dan sebagian untuk dianalisis pada spektrofotometer UV-Vis. Prinsip dari KLT dua
dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254 sebagai
fase diam dan perbandingan eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang
lintasan noda (Rf) dengan menunjukkan seyawa tunggal yang terdapat pada sampel
kunyit (Curcuma longa Linn. syn./Curcuma domestica Val.). Sedangkan prinsip
dari multi eluen yaitu adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254
sebagai fase diam dengan beberapa perbandingan eluen pada tingkat kepolaran
tertentu untuk mempertegas adanya senyawa tunggal yang terdapat pada sampel
kunyit (Curcuma longa Linn. syn./Curcuma domestica Val.).

Metode KLT-2D terjadi jika terdapat reaksi antara dua eluen, dan
penyimpangan dari garis diagonal dapat diamati setelah elusi kedua. Untuk KLT
dua dimensi, disiapkan alat dan bahan, dilarutkan ekstrak dengan etanol, lalu
ditotolkan pada lempeng yang sudah diaktifkan dibuat perbandingan eluen, eluen
yang digunakan adalah kloroform : metanol (9:1). Kemudian dielusi hingga batas
atas, setelah mencapai batas atas dikeluarkan dan dikeringkan. Setelah itu lempeng
diputar 90°. Tujuan dari pemutaran lempeng 90° adalah agar memperpanjang jarak
lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal. Setelah itu, dimasukkan kembali
lempeng kedalam chamber dengan menggunakan perbandingan eluen kedua, 5:1.
Setelah mencapai batas atas dikeluarkan dan dikeringkan. Dilihat noda yang tampak
pada UV 254 dan 366 nm.

Jika pada pengamatan menunjukkan bahwa pada kedua proses elusi yang
dilakukan terdapat satu bercak tunggal, maka dapat dikatakan bahwa bercak
tersebut merupakan senyawa tunggal, namun hasil praktikum tidak mendapatkan 1
noda melainkan 2 noda yang mengindikasikan bahwa sampel tersebut masih belum
murni karena kemungkinan mengandung lebih dari 1 senyawa. Warna noda yang
dihasilkan pada plat yaitu warna merah muda dan biru keunguan. Terbentuknya dua
noda tersebut dikarenakan senyawa yang dikerok pada KLT preparatif
kemungkinan bukan hanya senyawa flavonoid saja, tetapi terdapat senyawa lain.

Percobaan selanjutnya yaitu mengidentifikasi senyawa menggunakan

spektrofotometri UV-VIS yang dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui nilai
absorbansi dari senyawa yang digunakan yaitu sampel kunyit (Curcuma longa Linn.
syn./Curcuma domestica Val.). Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah
pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang
tertentu . Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400
nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm.
Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang melibatkan
energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif
dibandingkan kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran
secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan
mengukur absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum
Lambert-Beer. Sampel dianalisis pada panjang gelombang 200nm-800nm, hasil
yang didapat sampel menghasilkan 3 absorbansi masing-masing 0,102 ; 0,106 ;
0,132.

Pada praktikum ini tidak didapatkan senyawa murni hal ini dapat
dikarenakan pada saat pengerokan sampel pada KLTP masih ada senyawa yang
terkerok, maka dari itu perlu untuk dilakukan pemisahan kembali sampai senyawa
yang diinginkan benar-benar murni.
KESIMPULAN

Dalam praktikum ini, yang dilakukan yaitu kromatografi lapis tipis

preparatif. Dimana faksi terbaik dari percobaan sebelumnya diambil kemudian
dibuat eluen sesuai dengan fraksi yang dipilih. Lalu fraksi ditotol pada lempeng
KLT dengan penotolan yang berkesinambungan. Setelah itu lempeng di elusi di
dalam chamber dengan menggunakan eluen kloroforom : metanol (9:1), setelah
nodanya naik dilihat pada UV 254 nm dan 366 nm kemudian tandai noda yang
tampak seperti pita, didapatkan 3 pita yang masing-masing memiliki nilai Rf dan
pada pita kedua didapatkan nilai Rf 0,7 yang berdasarkan literature merupakan Rf
yang mengindikasikan adanya senyawa flavonoid. Kemudian, noda yang nampak
dikeruk dan dimasukkan ke dalam botol sentrifug kemudian disentrifugasi selama
15 menit dengan kecepatan 800 rpm. Setelah terbentuk endapan hasilnya disaring
dan dimasukkan ke dalam vial. Hasil yang didapat kemudian digunakan untuk
percobaan selanjutnya.
Pada praktikum KLT dua dimensi tidak didapatkan senyawa murni hal ini
dapat dikarenakan pada saat pengerokan sampel pada KLTP masih ada senyawa
yang terkerok, maka dari itu perlu untuk dilakukan pemisahan kembali sampai
senyawa yang diinginkan benar-benar murni.