ANALISIS DNA, REKOMBINAN DNA &

REKAYASA GENETIK

R. I’TISHOM

DEPARTEMEN BIOLOGI KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN UNAIR
2016
 OUTLINE
• ANALISIS DNA

• TEKNOLOGI REKOMBINAN DNA

• REKAYASA GENETIK
 ANALISIS DNA
• Gregor Mendel merumuskan bahwa setiap
organisme yg dapat diwariskan diatur oleh
gen, yaitu suatu partikel yg berada di suatu
tempat di dalam sel.
• Penemuan kembali hukum-hukum Mendel
tahun 1900 menandai lahirnya Genetika, yaitu
suatu ilmu pengetahuan yang ditujukan untuk
memahami tentang apakah gen itu dan
bagaimana gen itu bekerja.
 ANALISIS DNA
• Tahun 1903 (W. Sutton) : gen terletak dalam
kromosom.
• Tahun 1910 (T.H. Morgan) : mendukung teori
W. Sutton secara laboratorium yaitu pemetaan
gen.
• Tahun 1922 (T.H. Morgan) : menghasilkan
analisis yg menyeluruh mengenai posisi, relatif
lebih dari 2000 gen pd ke-4 kromosom
Drosophila melanogaster.
 ANALISIS DNA
• Tahun 1944 (Avery, Mac Leod dan Mc Carty)
serta Hershey & Chase tahun 1952 : DNA
merupakan material genetik.
• Sebelumnya orang beranggapan bahwa gen
tersusun oleh protein.
• Tahun 1952 – 1966 (Delbruck, Chargaff, Crick
dan Monod) : mengetahui struktur DNA, kode
genetik dipecahkan, serta proses-proses
transkripsi dan translasi dapat dijabarkan.
 ANALISIS DNA
• Tahun 1971-1973 (Herbert Boyer dan Stanly
Cohen) : Revolusi dlm percobaan Biologi.
• Metode tsb dinamakan Teknologi DNA
Rekombinan dengan pokok proses adalah
kloning gen.
• Boyer dan Cohen berhasil mengekspresikan
gen dari suatu bakteri dalam Escherichia coli.
 ANALISIS DNA
• Dengan ditemukannya DNA sebagai bahan gen,
manusia berupaya untuk mendapatkan kombinasi
sifat-sifat baru suatu makhluk hidup dengan cara
melakukan perubahan langsung pada DNA
genomnya.
• Usaha untuk mengubah DNA genom secara
langsung ini disebut Rekayasa Genetik (Genetic
Engineering).
• Dalam upaya melakukan rekayasa genetik,
manusia menggunakan Teknologi DNA
Rekombinan.
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Tekonologi DNA rekombinan telah
memungkinkan bagi kita untuk :
1. Mengisolasi DNA dari berbagai organisme
2. Menggabungkan DNA yang berasal dari
organisme yang berbeda sehingga terbentuk
DNA rekombinan.
3. Memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel
organisme prokariot maupun eukariot hingga
DNA rekombinan dapat bereplikasi dan bahkan
dapat diekspresikan.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
4. Jadi, DNA rekombinan merupakan kumpulan
teknik atau metoda yang digunakan untuk
mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung
reaksi.
• Teknik-teknik tersebut meliputi :
- Teknik untuk mengisolasi DNA
- Teknik untuk memotong DNA
- Teknik untuk menggabung DNA
- Teknik untuk memasukkan DNA ke dlm sel hidup
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• KLONING GEN
• Langkah-langkah dasar dalam kloning gen :
1. Fragmen DNA : mengandung gen yang akan
diklon diinsersikan pada molekul DNA sirkuler
yang disebut vektor/plasmid untuk
menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan.
2. Vektor bertindak sebagai wahana yang
membawa gen masuk ke dalam sel tuan rumah
(host) yang biasanya berupa bakteri.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
3. Di dalam sel host, vektor mengadakan
replikasi, menghasilkan banyak kopi atau
turunan yang identik, baik vektornya sendiri
maupun gen yang dibawanya.

4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA

rekombinan diwariskan pada progeni dan
terjadi replikasi vektor selanjutnya.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan
sel, maka dihasilkan koloni atau klon sel host
yang identik.
Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu
kopi atau lebih molekul DNA rekombinan.
Dengan dmkn dikatakan bhw gen yang dibawa
oleh molekul rekombinan telah diklon.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
1. Enzim Restriksi
digunakan untuk memotong DNA.
ex. Restriksi endonuklease, yg diisolasi dari
E. Coli RY13 yg dinamakan EcoRI.
enzim ini mengenal bagian DNA yg mempunyai
urutan spesifik yg “Palindromik (bila mengenai
kedua untai, maka pd tiap untai akan terbaca
dalam arah yg sama)” yg tdd atas enam pasang
basa dan memotong antara guanin dan adenin
pd setiap untai DNA.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Beberapa Rekstriksi Endonuklease Tipe II
BAKTERI ENZIM LOKUS

PENGENALAN
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G*GATCC
Bacillus globigii BglII A*GATCT
Escherichia coli RY13 EcoRI G*AATTC
Haemophillus aegyptius HaeIII GC*CC
Kleibsiella pneumoniae KpnI GGTAC*C
Providencia stuartii PstI CTGCA*G
Serratia marcescens SmaI CCC*GGG
Xanthomonas malvacearum XmaI C*CCGGG
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
2. Enzim DNA Ligase
digunakan untuk menyambung DNA
Di dlm sel, fungsi Ligase DNA adalah untuk
mereparasi tempat putusnya untai tunggal
(diskontinyuitas) yg terjadi pd molekul DNA untai
ganda yg mungkin tjd pd waktu replikasi DNA.
Ligase DNA yg berasal dari kebanyakan
organisme juga akan menyambung dua fragmen
DNA untai ganda.
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
3. Plasmid (vektor kloning)
digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan
gen atau mengklonkan fragmen DNA atau
mengubah sifat bakteri.
Plasmid bakteri biasanya mrpk molekul DNA
untai ganda dg ukuran 1 kb – 200 kb.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
3. Plasmid (vektor kloning)
Sifat yg diperlukan sbg vektor kloning :
a. Berukuran kecil shg mudah diisolasi dan menaikkan
efisiensi transformasi ke dlm E. Coli. Efisiensi
transformasi ini menurun sesuai dg kenaikan ukuran
plasmid.
b. Mempunyai lokus tunggal restriksi endonuklease
tertentu utk penyisipan DNA yg di klon.
c. Mempunyai 1 atau lbh penanda genetik seleksi sbg
identifikasi sel yg telah membawa plasmid
rekombinan.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
3. Plasmid (vektor kloning)
pada umumnya, plasmid ditandai dg p yg
berarti plasmid dan singkatan seperti BR yg
menunjukkan pembuatnya : F. Bolivar dan R.
Rondrigues.
 TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• PERANGKAT YANG DIPERLUKAN
4. Pustaka Genom/ bank gen
- digunakan untuk menyimpan gen atau
fragmen yg di klonkan.
- sekumpulan klon (bakteri) transforman yg
mengandung potongan set DNA (cDNA) dari
sebagian atau keseluruhan set genom lengkap
organisme (bakteri, virus, tumbuhan, hewan,
manusia).
- Pustaka DNA yg baik adalah yg mengandung semua
bagian DNA genom.
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
KLONING MAGE-1
 PEMURNIAN DNA
• GEN STRUKTURAL PROKARIOT
- DNA target merupakan bagian kecil dari total
DNA kromosom (kurang dari 0,02%).
- sel inang prokariot tidak dpt menghilangkan
intron dari molekul pre-mRNA. Akibatnya
pre-mRNA tdk ditranslasi dg benar dlm sel
bakteri, shg perlu sekuen pengendali transkripsi
dan translasi prokariot supaya terekspresi.
 PEMURNIAN DNA
• GEN STRUKTURAL EUKARIOT
- mRNA eukariot sudah tdk ada intron, pd
ujung 5’ ada tudung G, sdk pd ujung 3’ ada
poli A.
- Adanya poli A ini dpt digunakan utk
memisahkan molekul mRNA dari molekul
lain seperti rRNA dan tRNA.
 PEMURNIAN DNA
• GEN STRUKTURAL EUKARIOT
- Ekstrak sel eukariot yg mengandung mRNA
yg diinginkan dialirkan mll kolom dg fasa
diam selulosa yg telah ditempeli poli-T
sekitar 15 nukleotida.
- Poli-a dari mRNA akan menempel pd poli-T,
sdk r RNA dan tRNA yg tdk mpy poli-A
hanya akan lewat kolom saja. Kmd mRNA yg
nempel dielusi dg buffer yg memecah ikatan
hidogen A:T.
APLIKASI TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 REKAYASA GENETIK
• BIDANG KEDOKTERAN
1. Insulin sintetis oleh Genentech (1982)
keunggulan :
- pengadaan lebih mudah
- menghilangkan resiko penyebaran penyakit
yg disbbkn oleh patogen yg tdp pd hewan.
- lbh murah
 REKAYASA GENETIK
• BIDANG KEDOKTERAN IMUNOLOGI
1. Hormon Polipeptida
ex. hCG, FSH, LH, GH, prolaktin
2. Penanda tumor/ kit/ marker
ex: Ag karsinoembrionik, Ag prostat,
Reseptor interleukin
3. Penyakit Infeksi
ex : Chlamydia, herpes, rubela, hepatitis B, HIV
 REKAYASA GENETIK

• BIDANG KEDOKTERAN PENYAKIT GENETIK

1. Sickle-cell Anemia (anemia sabit) mrpk penyakit
gentik yg dpt dilihat dg adanya bentuk sel darah
merah pipih panjang spt bulan sabit.
2. Ovalositosis mrpk penyakit bawaan yg
diturunkan secara dominan autosomal dg sel
darah merah berbentuk oval. Dasar
molekulernya adalah perubahan protein band-3
eritrosis krn adanya delesi 27 pb, dg akibat tdk
ada 9 residu asam amino (400-408) pd batas
antara bagian sitoplasmik dan membran.
 REKAYASA GENETIK
• BIDANG KEDOKTERAN PENYAKIT GENETIK
3. Thalasemia : penyakit genetik yg berhubungan dg
hemoglobin diartikan bahwa jumlah molekul yg dibuat
dlm jumlah normal ttp fungsinya mengalami
perubahan krn perubahan asam amino.
4. Sidik Jari DNA : dg menggunakan analisis restriction
fragment length polymorphism (RFLP). Analisis RFLP
sering digunakan untuk mendeteksi lokasi genetik
dalam kromosom yang menyandikan penyakit yang
diturunkan (Orita et al., 1989).
 REKAYASA GENETIK
• BIDANG PERTANIAN
• Tumbuhan transgenik menggunakan bakteri
Agrobacterium tumefaciens
• Kelebihan tumbuhan transgenik :
- Buah lambat masak/rusak
- Tumbuhan tahan penyakit
- Tumbuhan tahan racun
 REKAYASA GENETIK
• BIDANG PETERNAKAN
1. Transgenik
- hewan ternak/ potong bobot menjadi lbh
berat dan besar.
- tahan penyakit
2. Vaksin penyakit mulut dan kuku
- VP1 dan VP2
TERIMA KASIH