Laporan Praktikum

Mikrobiologi Dasar dan Lingkungan

IDENTIFIKASI MIKROBA DENGAN

KIT API 20E DAN TEKNIK MOLEKULER : PCR

TEKNIK DAN MANAJEMEN LINGKUNGAN

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2013
Pendahuluan
Biologi Molekular adalah cabang ilmu biologi tingkat molekul, Bahan
ajarannya mencakup biologi, kimia, partikel genetikm dan biokimia. Biologi
molekuler konsentrasi terutama pada pengertian interaksi antar beberapa
jenis sel, termasuk interaksi antara DNA, RNA, dan biosintesis protein.
 Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan
untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua
target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens
DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya
(Wahyudi 2001). Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Tekni penggandaan
DNA ini dapat membantu dalam identifikasi bakteri maupun virus yang
mencemari makanan. PCR adalah suatu teknik yang sangat menolong, setelah
dilakukan prosedur yang cukup rumit untuk mendapatkan urutan DNA yang
cukup. Teknik PCR inilah yang memungkinkan proses analisis DNA menjadi lebih
cepat dibandingkan dengan melakukan tes DNA dengan cara konvensional.
Dengan PCR, urutan DNA dapat digandakan (amplifikasi) hanya dalam waktu
beberapa jam sampai kuantitasnya cukup untuk sebuah proses analisis, hasil
penggandaan dapat divisualisasikan menggunakan elektrofores dan Gel
Documentation. (Harriganw 1998)
API-20E test kit untuk identifikasi bakteri enterik. menyediakan cara mudah
untuk menyuntik dan membaca tes yang relevan kepada anggota
Enterobacteriaceae keluarga dan organisme terkait. Sebuah strip plastik isinya dua
tabung mini uji diinokulasi dengan suspensi garam dari kultur murni. Proses ini
juga rehydrates media dessicated di setiap tabung. Beberapa tabung terisi penuh
dan beberapa tabung yang dilapis dengan minyak mineral sehingga reaksi
anaerobik dapat dilakukan.

Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui cara dan proses identifikasi DNA
mikroba yang baik dan benar dengan menggunakan metode KIT secara
konvensional dan molekuler.
 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah API 20E, Bunsen, tisu, pipet mikro, yellow
tip, blue tip, tabung evendorf, tabung PCR, thermal cycler, centrifuge portable,
vortex mixer, dan alat elektroforesis.
Bahan-bahan yang digunakan adalah biakkan bakteri dalam cawan petri,
akuades, gel agarose, TEA, dd H2O, primer F, primer R, d NTP (d GTP, d CTP, d
ATP, d TTP), buffer, taqpol, MgCl2, dan alkohol 70%. Bakteri. Kultur beku
Streptococcus pyogenes galur UAB200, CS24 dan M24, E coli DH 5α dan
Pseudomonas aeruginosa galur PAO sebagai kontrol diperoleh dari PPAU-
Bioteknologi ITB Bandung. Sebagai kontrol positif digunakan plasmid pD3 yang
merupakan plasmid rekombinan dengan gen emm 12 sebagai sisipannya dan
Streptococcus spp. galur B7. Media dan Bahan Kimia. Blood agar plate dari
Biofarma; media cair TSB (Tryptic Soy Broth); bufer Tris-HC1 10 mM pH 7,6
EDTA 1 mM, SDS 10%; larutan fenol: kloroform (1:1); natrium asetat 3 M;
agarosa (Promega Corporation, Madison, USA); TAE 50x (242 gr Tris base, 57,1
ml asam asetat glacial, 100 ml 0,5 M EDTA pH 8 dalam 1 liter aquades); etidium
bromida (10mg/ml); loading buffer (0,25% bromofenol biru 0,25% xylene cyanol
F.F, 15% ficol); larutan standar DNA yang direstriksi dengan l μM (urutan
nukleotida 5' GCC GCC.

Prosedur Kerja
Metode yang digunakan untuk identifikasi mikroba pada praktikum kali ini
ada dua jenis, yaitu dengan KIT secara konvensional dan KIT secara molekuler.
Metode KIT secara konvensional dilakukan dengan menggunakan API 20 E.
sedangkan untuk metode KIT secara molekuler dilakukan dengan teknik PCR.
 Metode pertama yang dilakukan adalah KIT secara konvensional. Pertama
kotak API 20 E dibuka dan disiapkan cawan petri berisi biakkan mikroba yang
akan digunakan (dalam hal ini digunakan E. Coli sebagai sampel). Setelah itu API
NaCl 5 ml diambil dan dibuka tutupnya dengan cara tutupnya ditekan ke bawah.
Kemudian biakkan diambil sebanyak 1 swap, dimasukkan API NaCl 5 ml, dan
dihomogenkan. Diambil wadah yang mirip jajaran sepatu-sepatu kecil dan wadah
tutupnya. Tulisan di bawah sepatu-sepatu tersebut diperhatikan. Bila ada garis
bawahnya, diisi larutan NaCl + biakkan (larutan sampel) setengah dari sepatu dan
ditambah mineral oil (digunakan gliserol sebagai pengganti). Bila ada tanda di
bawah tulisannya, diisi sampel hingga penuh. Jika sudah ditutup dengan tutup
wadahnya dan diinkubasi selama 48 jam. Selama proses pengerjaan, dilakukan di
dekat api Bunsen agar steril.
Langkah pertama untuk ekstraksi DNA adalah sel dikumpulkan dengan cara
sentrifugasi cairan kultur 8000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Setelah itu
supernatant yang terbentuk dibuang dan pelletnya ditambahkan 1 ml akuades.
Selanjutnya larutan suspense yang terbentuk dipindahkan dalam tabung evendorf
dan disentrifugasi pada kecepatan maksimal. Supernatant dibuang kembali,
ditambahkan 1 ml CTAB 2%, diaduk, dan diinkubasi selama 30 menit.
Disentrifugasi pada kecepatan maksimum dalam tabung evendorf sentrifugasi.
Kemudian supernatant dipindahkan ke tabung evendorf baru, ditambahkan
kloroform-isoamil alkohol 24:1, dan dihomogenkan dengan cara membuat angka 8
selama 1 menit. Disentrifugasi kembali 13000 rpm pada 4°C selama 30 detik. Hasil
supernatant dipindahkan ke tabung baru dan dilakukan kembali langkah
penambahan, penghomogenan, dan sentrifugasi. Setelah itu supernatant
dikumpulkan pada tabung baru dan ditambah 1/10 volume dari 7,5 M ammonium
asetat. Ditambahkan 2 volume etanol mutlak dingin (-20°C), dihomogenkan, dan
didiamkan selama 5 menit. Disentrifugasi dalam evendorf sentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatant dibuang, pellet DNA dicuci
dengan 0,5 ml etanol 70% dingin. Pellet dibiarkan kering selama kira-kira 15
menit, terakhir ditambah akuabides 0,5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung PCR.
Penyiapan gel agarosa. Agarosa 1% dan 1,5 % dibuat dalam bufer 1x TAE,
didinginkan sampai suhu 600C, kemudian ditambahkan 1 μl larutan etidium
bromida (10 mg/ml), lalu diaduk. Larutan agar dituangkan kedalam plat. Kemudian
ditambahkan 10 μl sample DNA dicampur dengan 2 μl loading buffer dimasukkan
kedalam sumur. Marker DNA yang ukurannya diketahui (λ n film kecepatan
tinggi.

Pembahasan
Dalam KIT API 20 E terbaca pada strips yang terisi penuh yaitu CIT, VP,
dan CEL semua berubah warna kecuali VP, karena VP hanya menghasilkan
gelembung kecil. Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh hasil identifikasi
bakteri yaitu Serratia fecaria. Keakurasian identifikasi sampel mencapai 98,9%.
Hasil ini bertentangan dengan sampel yang telah diketahui yaitu Esserchia coli.
Kemungkinan terjadi kontaminasi padaa saat penentuan atau kesalahan terdapat
pada pelabelan.
Identifikasi bakteri dapat dilakukan dengan cara konvensional dan caraKIT
identifikasi. Cara konvensional meliputi fisiologis maupun biokimia. Cirifisiologi
ataupun biokimia merupakan kriteria yang penting di dalam identifikasispesies
bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang
berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yangmemadai
mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin
dilakukan.. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe mediamemproduksi tipe
metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikrobadengan reagen test
yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray2005).
Isolasi Kromosom Bakteri Patogen Streptococcus pyogenes galur UAB200,
CS24 dan M24. Streptococcus pyogenes adalah bakteri gram positif yang
mempunyai dinding sel tebal sehingga sukar untuk dilisis. Untuk itu lisis dilakukan
dengan dua cara yaitu dengan metode Bollet (Kaufhold et al,1994) dan dengan
tambahan perlakuan 3 kali proses cair-beku kemudian baru dilisis dengan
microwave. Ternyata dengan penambahan tahap pencucian dengan aquades steril
dan tahap freeze-thaw, didapatkan jumlah kromosom yang lebih banyak. DNA
hasil isolasi kromosom dengan metode Bollet, dipresipitasi denganetanol dengan
tujuan untuk pemekatan sekaligus Deteksi Streptococcus pyogenes dengan PCR 3
pemurnian kromosom. Endapan pelet putih dilarutkan dalam 25 μl aquabides steril.
Larutan diuji keberadaan DNA-nya dengan elektroforesis agarosa. Pada lisis
kromosom cara pertama (metode Bollet) data elektroforesis menunjukan bahwa
pada supernatan terdapat kromosom galur UAB200, CS24 dan M24 (Gambar 1a).
Sedangkan pada endapannya tidak dijumpai kromosomnya (data tidak
ditunjukkan) Ini mungkin disebabkan karena konsentrasi kromosomnya relatif
rendah sehingga tidak dapat meningkatnya jumlah produk non spesifik. Jika
konsentrasi primer terlalu rendah, hasil dari produk PCR akan rendah. mPCR dapat
dilakukan walaupun hanya menggunakan sampel tanpa isolasi DNA, tetapi DNA
templat yang dipersiapkan pada percobaan mengandung SDS dan deterjen yang
menghambat mengendap. Untuk mendapatkan jumlah kromosom yang banyak
digunakan lisis cara kedua. Cara ini lebih baik, hasilnya dapat dilihat pada Gambar
1b. Amplifikasi Gen emm6, Penempelan primer yang terjadi pada temperatur
rendah tidak spesifik sehingga akan menghasilkan amplifikasi dengan spesifisitas
rendah. Spesifisitas rendah juga menurunkan sensitifitas karena adanya kompetisi
antara produk spesifik dan nonspesifik (Retnoningrum 1997). Primer yang
digunakan adalah 0,5 μM, karena jika konsentrasi primer terlalu tinggi dapat
terjadi mispriming yang mengakibatkan enzim Taq DNA polimerase sehingga
dapat menurunkan efisiensi PCR. Untuk itu perlu dilakukan presipitasi dengan
etanol sekaligus untuk pemekatan kromosom. Deteksi Produk PCR dengan Metode
Elektroforesis Agarosa. Hasil elektroforesis produk amplifikasi PCR sebanyak 30
siklus melalui tiga tahap yaitu denaturasi, penempelan dan polimerisasi dapat
Menurut hasil yang dipublikasi bahwa ukuran panjang gen emm6 adalah
1452 pb. Dari hasil elektroforesis ukuran panjang gen emm6 adalah 1495 pb. Hasil
ini mendekati ukuran panjang gen emm6 yang telah dipublikasi (Hollingshead et
al, 1986). Produk PCR gen emm12 mempunyai ukuran panjang antara 1600 pb dan
1800 pb. Ukuran panjang gen emm12 yang telah dipublikasi yaitu 1693 pb. Hasil
elektroforesis produk PCR gen emm12 adalah 1700 pb. Hasil ini mendekati ukuran
panjang gen emm12 yang telah dipublikasi (Robbins et al, 1987). Pada percobaan
ini juga digunakan kromosom galur M24 sebagai templat. Setelah diamplifikasi
dengan teknik PCR dan produknya dielektroforesis ternyata tidak berhasil
diperoleh produk PCR. Ini mungkin disebabkan karena adanya inhibitor
amplifikasi atau primer yang digunakan tidak dapat menempel dengan efisien pada
templat. Menurut hasil yangdipublikasi (Mouw et al, 1988) bahwa ukuran panjang
gen emm24 adalah 1617 pb.

Kesimpulan
 isolasi kromosom galur UAB200, CS24 dan M24 sebagai templat telah
berhasil dengan baik . Setelah amplifikasi diperoleh produk PCR gen emm6
dengan ukuran panjang 1495 pb, sedangkan gen emm12 adalah 1700 pb.
Bakteri yang teridentifikasi dari dalam peralatan KIT API 20E adalah
Serratia fecaria, dan tidak sesuai dengan sampel.

Daftar Pustaka
Erlich HA . 1989. PCR Technology: Principles and Applications for DNA
Amplification. New York (US) : M stockton press.
Harriganw F . 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. New York (US)
Academic Press Ltd
Hollingshead SK, Fischetti VA & Scott JR. 1986. Complete nucleotide
sequence
of type M protein of the group a Streptococcus. J. Biol. Chem. 261:
1677-1688.
Kaufhold A, Podbielski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J. & Schouls L, 1994.
Rapid typing of group a streptococci by the use of DNA amplification and
nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology
Letters 119: 9-26.
Mouw, A.R., Beachey, E.H. & Vickers, B. 1988. Molecular evolution of
Streptococcus M protein cloning and nucleotide sequence of type 24 M
protein gene and relation to other gene of Streptococcus pyogenes. J.
Bacteriol. 170: 676- 684.
Murray RK, DK Granner, PA Mayes and VW Rodwell. 2000. Biokimia
Harper.Edisi25.Buku Kedokteran. Jakarta (ID) : EGC
Retnoningrum DS .1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk
diagnosis penyakit infeksi [Skripsi]. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung:
ITB.
Robbins JC, Spanier JG, Jones SJ, Simpson WJ & Cleary, P.P. 1987.
Streptococcus
pyogenes type 12M protein gene regulation by upstream sequences. J.
Bacteriol. 169: 5633-5640.
Email ThisBlogThis!Share to TwitterShare to Facebook