DASAR - DASAR MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

ISOLASI DAN ENUMERASI MIKROORGANISME

Nama Kelompok :
Dwi Satriyo Widodo 160216031
Esterita Yuniati 160216061
Girvan Parinussa 160216078
Yonatan Adi Candra 160216085

Tanggal Percobaan : 19 November 2018

Dosen Pembimbing:
Tuani Lidiawati Simangunsong S.T., M.T.

JURUSAN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS SURABAYA
2018
 BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Beberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang

terdapat pada suatu bahan. Cara yang paling sering digunakan adalah perhitungan
koloni pada lempeng biakan (plate count). Disamping itu terdapat juga perhitungan
langsung secara mikroskopis (direct count). Ada beberapa cara yang dapat
digunakan unttuk menghitung jumlah mikroba salah satunya adalah dengan
menghitung langsung. Cara ini pada mulanya dilakukan pada pemeriksaan bakteri
yang terdapat dalam air susu, tetapi dapat juga digunakan dalam penelitian yang
lain. dengan cara ini, yang terhitung adalah bakteri hidup dan mati. Sehingga
dengan cara ini tidak diketahui berapa jumlah bakteri hidup, tetapi waktu
pengerjaannya lebih cepat. Data dalam penelitian ini digunakan sebagai indikator
kualitas makanan serta memprediksi waktu simpan dari produk makanan tersebut.

I.2Tujuan
Agar mahasiswa dapat melakukan teknik isolasi dan perhitungan
mikroorganisme yang didapatkan dari tanah, kompos, air dan udara.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Secara alami, mikroorganisme di alam ditemukan dalam populasi campuran.

Hanya dalam keadaan tertentu saja populasi tersebut ditemukan dalam keadaan
murni. Mikroorganisme tersebut dapat dipisahkan melalui teknik isolasi dan
ditumbuhkan dalam medium di laboratorium. Isolasi mikroorganisme diperlukan
dalam penelaahan dan mengidentifikasi jenis-jenis mikroorganisme tertentu dalam
sampel.

Prinsip dari isolasi adalah memisahkan mikroorganisme tertentu dari habitat

dan dari campurannya sehingga didapatkan kultur murni. Dalam melakukan isolasi
mikroorganisme ada beberapa hal yang perlu diperhatikan, antara lain:

1. Sifat spesies mikroorganisme yang akan diisolasi

2. Tempat hidup atau asal mikroorganisme.
3. Medium untuk pertumbuhan yang sesuai.
4. Cara menanam mikroorganisme tersebut.
5. Cara inkubasi mikroorganisme.
6. Cara menguji bahwa mikroorganisme yang diisolasi telah berupa biakan
murni dan sesuai dengan yang dimaksud.
7. Cara memelihara agar mikroorganisme yang telah diisolasi tetap merupakan
kultur murni.

Beberapa metode untuk mengisolasi mikroorganisme adalah sebagai berikut:

1. Metode cawan gores (streak plate)

Inokulum digoreskan pada permukaan medium agar dalam cawan petri
menggunakan jarum inokulasi (oose) dengan cara zig-zag atau dapat
pula dengan cara kuadran hingga didapatkan koloni yang terpisah.
2. Metode swab
Inokulum digoreskan pada medium agar dalam cawan petri
menggunakan cotton buds dengan cara zig-zag atau dapat pula dengan
cara kuadran hingga didapatkan koloni yang terpisah.
 3. Metode cawan tebar (spread plate)
Inokulum dengan volume tertentu diteteskan di tengah-tengah medium
agar dalam cawan petri. Selanjutnya dengan menggunakan batang kaca
bengkok steril, inokulum disebarkan atau diratakan di permukaan
medium agar tersebut sehingga akan didapatkan koloni-koloni terpisah.
4. Metode cawan tuang (pour plate)
Dilakukan seri pengenceran terlebih dahulu pada bahan yang akan
diisolasi. Selanjutnya suspensi atau inokulum pada setiap seri
pengenceran dimasukkan ke dalam pteri steril dengan volume tertentu
dilanjutkan dengan penuangan medium agar kemudian dihomogenkan
dengan cara memutar petri membentuk angka delapan sebelum media
memadat.

Pengukuran kuantitatif mikroorganisme diperlukan dalam berbagai penelaahan

mikrobiologik. Umumnya pengukuran dasar populasi mikroorganisme dengan
penentuan jumlah sel, antara lain:

1. Perhitungan mikroskiopik langsung.

2. Hitungan cawan.
3. Secara elektronik dengan babtuan alat colony counter.
4. Menggunakan MPN (Most Probable Number).

Metode hitungan cawan atau TPC (Total Plate Count) didasarkan pada anggapan
bahwa setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi
jumlah koloni yang muncul pada medium agar merupakan suatu indeks bagi jumlah
mikroorganisme yang dapat hidup dan tergantung dalam suatu sampel. Teknik yang
harus dikuasai dalam metode ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan
hasil pengenceran tersebut.

\
 Metode TPC didasarkan pada metode penghitungan Standard Plate Count
(SPC). Penetapan SPC mengikuti aturan sebagai berikut:

1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka (a dan b)

2. Apabila didapatkan jumlah koloni kurang dari 30 koloni pada setiap
tingkat pengenceran, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran
terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30
(<30) dikalikan dengan besarnya pengenceran. Tetapi jumlah sebenarnya
dicantumkan dalam tanda kurung.
3. Apabila didapatkan jumlah koloni lebih dari 300 pada semua tingkat
pengenceran, maka jumlah koloni pada pengenceran tertinggilah yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 (>300) dikalikan
dengan besarnya pengenceran. Tetapi jumlah yang sebenarnya
dicantumkan dalam tanda kurung.
4. Apabila jumlah koloni antara 30-300, dipakai hasil yang terkecil jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah adalah >2 dan
ditentukan rata-ratanya apabila perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah adalah ≤ 2.
5. Apabila dilakukan duplo per pengenceran, maka dipakai data dari kedua
cawan tersebut.

Perhitungan jumlah mikroba (CFU/ml) dilakukan dengan menggunakan

persamaan sebagai berikut :
Persamaan Rumus 1 : Jumlah Mikroba Sampel Cairan (CFU/ml)

CFU x Faktor Pengenceran

CFU/ml =
Volume Inokulasi (ml)
 Mikroba dalam air buang
Dalam air baik yang kita anggap jernih, sampai terhadap air yang keadaannya
sudah kotor atau tercemar, di dalamnya akan terkandung sejumlah kehidupan, yaitu
misalnya yang berasal dari sumur biasa, sumur pompa, sumber mata-air dan
sebagai-nya, di dalamnya terdiri dari bakteri, yaitu :

1. Kelompok bakteri besi (misalnya Crenothrix dan Sphaerotilus) yang mampu

mengoksidasi senyawa ferro menjadi ferri. Gallionella merupakan bakteri
yang mampu mengoksidasi ion ferro Fe+2 ke ion ferri Fe+2 ,
Gallionella umumnya berdeposit bersama ion besi, mangan yang
mengandung ion klorida, bakteri Gallionella sering ditemukan pada
sambungan las, beberapa bakteri pengoksidasi besi lain yang dikenal antara
lain sphaerotilus, crenothrix dan lepthotrix. Bakteri
kemosintesis Thiobacillus dan Ferrobacillus memiliki sistem enzim yang
dapat mentransfer elektron dari ion ferro ke oksigen, menghasilkan ion ferri,
air, dan energi bebas untuk sintesis bahan organik dari karbondioksida.
Bakteri kemosintesis bekerja optimum pada pH rendah (sekitar 5). Akibat
kehadirannya, air sering berubah warna kalau disimpan lama yaitu warna
kehitam-hitaman, kecoklat-coklatan, dan sebagainya.

2. Kelompok bakteri belerang (antara lain Chromatium dan Thiobacillus yang

mampu mereduksi senyawa sulfat menjadi H2S. Bakteri pereduksi sulfat
memiliki ketahanan baik pada temperatur sampai dengan 80°C, bakteri ini
bekerja baik pada ph 5-9. Dalam pipa, proses perubahan secara biologis
terjadi selama transportasi air buangan. Perubahan ini memerlukan O2.
Apabila kandungan O2 tidak cukup dari aerasi natural udara dalam pipa,
terjadi reduksi sulfat dan terbentuk ion sulfida. S– akan berubah menjadi
H2S pada pH tertentu dan sebagian lepas ke udara di atas air buangan. Bila
pipa berventilasi baik dan dindingnya kering, hal ini tidak akan
menimbulkan masalah. Bila terjadi hal sebaliknya, keseimbangan
berkumpul pada dinding bagian atas pipa. H2S larut dalam air sesuai dengan
tekanan parsial udara dalam pipa dan bakteri akan mengoksidasi H2S
 menjadi H2SO4, yang dapat merusak beton (dikenal dengan ”crown” korosi)
(Yudi, 2015). Akibatnya kalau air disimpan lama akan tercium bau busuk
seperti bau telur busuk.

2. Kelompok mikroalge (misalnya yang termasuk mikroalga hijau, biru dan

kersik), sehingga kalau air disimpan lama di dalamnya akan nampak
jasad- jasad yang berwarna hijau, biru ataupun kekuning–
kuningan, tergantung kepada dominasi jasad jasad tersebut serta lingkungan
yang mempengaruhi.

Mikroorganisme yang paling umum digunakan sebagai petunjuk atau indikator

adanya pencemaran dalam air adalah Escherichi coli (E. coli), serta bakteri dari
kelompok koliform. Mikroorganisme dari kelompok koliform secara keseluruhan
tidak umum hidup atau terdapat di dalam air, sehingga keberadaanya dalam air
dapat dianggap sebagai petunjuk terjadinya pencemaran kotoran dalam arti luas,
baik dari kotoran hewan maupun manusia. Bakteri koliform meliputi semua
bakteri berbentuk batang, gram negatif, tidak membentuk spora, dan dapat
memfermentasi laktosa dengan memproduksi gas dan asam pada suhu 370°C
dalam waktu kurang dari 48 jam. Adapun bakteri E. coli selain memiliki
karakteristik seperti bakteri koliform pada umumnya, juga dapat menghasilkan
senyawa indole di dalam air pepton yang mengandung asam amino triptofan, serta
tidak dapat menggunakan natrium sitrat sebagai satu – satunya sumber karbon
(Purnawijayanti, 2001). Escherichia coli adalah salah satu bakteri yang tergolong
koliform dan hidup secara normal di dalam kotoran manusia maupun hewan, oleh
karena itu disebut juga koliform fekal. Bakteri koliform lainnya berasal dari
hewan dan tanaman mati dan disebut kolifrom non fekal, misalnya Entrobacter
aerogenes.
 BAB III
MATERI DAN METODE PRAKTIKUM

III.1 Materi Praktikum

Materi praktikum berupa air buangan yang diambil dari saluran air got
di depan Fakultas Farmasi Universitas Surabaya.

III.1.1 Alat yang digunakan

1. Tabung reaksi 9. Cawan petri
2. Mikro pipet 10. Mikro tip
3. Erlenmeyer 11. Vortex mixer
4. Neraca/timbangan 12. Jarum oose
5. Botol semprot 13. Plastik
6. Api spirtus 14. Cotton buds
7. Botol sampel 15. Cetok
8. inkubator 16. spidol

III.1.2 Bahan yang digunakan

1. Medium PCA (Plate Count Agar)

2. Sampel air buangan
3. Etanol 70%
4. Kapas
5. Akuadest steril
6. Spirtus

III.2 Metode Praktikum

A. Pengambilan sampel air

Sampel air yang digunakan adalah air selokan atau sumur. Sampel air diambil
secara komposit pada 3 titik pengambilan sampel. Sampel air itu dimasukkan dalam
1 botol sampel steril dan ditutup rapat.
B. Isolasi Mikroorganisme dari sampel Tanah, Kompos, dan Air

Isolasi mikroorganisme dari sampel tanah, kompos, dan air dilakukan dengan
metode cawan tuang. Sebanyak 15 gr atau 15 ml sampel yang telah dihomogenkan
ditimbang/ dipipet kemudian dimasukkan ke dalam 135 ml akuades steril secara
aseptis. Suspensi kemudian dihomogenkan dengan cara divortex. Suspensi tersebut
merupakan suspensi dengan tingkat pengenceran 10-1. Suspensi pada tingkat
pengenceran 10-1 selanjutnya dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan pada 9 ml
akuades steril sehingga didapatkan suspensi dengan tingkat pengenceran 10-2.
Pengenceran bertingkat dilakukan hingga didapatkan suspensi dengan tingkat
pengenceran 10-8.

Suspensi pada masing-masing tingkat pengenceran dimasukkan pada cawan

petri sebanyak 1 ml. Selanjutnya media PCA dituangkan ke dalam cawan dan
kemudian cawan diputar membentuk angka delapan agar suspensi homogen.
Cawan petri selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (25-30˚C) selama 1-4 hari

C. Perhitungan koloni dengan metode SPC

Pengamatan dilakukan setelah waktu inkubasi yang ditentukan dan koloni yang
terbentuk pada setiap pengenceran selanjutnya diukur berdasarkan metode TPC
yang mengacu pada standar SPC. Perhitungan harus dilakukan dengan cermat agar
data yang diperoleh dapat mencerminkan kondisi biotop yang sesungguhnya.

D. Hasil pengamatan

Hasil penghitungan koloni pada tiap cawan ditulis, dilanjutkan penghitungan

berdasarkan standar penghitungan koloni (SPC) hingga didapatkan jumlah koloni
tiap sampel. Hasil dari tiap metode yang dilakukan, dicatat dan dibahas sebagai
hasil praktikum.
III.2.1 Cara Kerja

15 ml sampel dihomogenkan ke 1 ml hasil pengenceran

dalam 135 ml aquades steriil dihomogenkan ke dalam 100ml
(Pengenceran 10-1) aquades steril (pengenceran 10-3)

Memasukkan masing- masing 1

Melakukan pengenceran bertingkat
ml suspensi dengan tingkat
hingga didapat suspensi dengan
pengenceran 10-6 hingga 10-10
tingkat pengenceran 10-10
ke dalam cawan petri

Memasukkan media PCA ke dalam

Menginkubasi dalam suhu ruang
cawan petri dan menghomogenkan
dengan menggerakkan cawan (25-30˚C) selama 1-4 hari
membentuk angka 8

Melakukan pengamatan dan

perhitungan koloni bakteri pada
inkubasi hari ke- 1 hingga ke- 3

III.2.2 Tanggal dan Tempat Praktikum

Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioproses dan Proses

Lingkungan (TBPL) pada tanggal 19 November 2018.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Data Hasil Percobaan

Data berikut adalah data pengamatan bakteri per hari setelah inkubasi selama 3
hari.

Tingkat Pengenceran
Hasil pengamatan
10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

A 176 1 0 0 0 0
Hari ke-1
B 168 2 0 0 0 0

A 180 27 7 1 2 51
Hari ke-2
B 170 ∞ 10 5 1 3

A 170 33 11 3 2 34
Hari ke-3
B 172 ∞ 11 5 1 3
IV.2 Perhitungan

Pada pengenceran menggunakan metode duplo pada tiap pengenceran

sehingga digunakan kedua data pengamatan dengan diambil nilai rata-ratanya.

Jumlah koloni rata-rata Jumlah koloni

Tingkat
rata-rata
pengenceran Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3 dalam 3 hari

10-5 172 175 171 173x 105

10-6 2 27 33 62 x 106

10-7 0 8,5 11 10 x 107

10-8 0 3 4 4 x 108

10-9 0 1,5 1,5 1,5 x 109

10-10 0 27 18,5 44 x 1010

Setelah diinkubasi, dilakukan perhitungan bakteri dengan menggunakan

metode Total Plate Count (TPC). Syarat perhitungan bakteri dengan metode TPC
adalah jumlah koloni dalam petri berisi 25−250 koloni (SNI No. 01−2332.3−2006
2006)

Jumlah koloni yang memenuhi standart yang dapat dihitung dengan

perhitungan Total Plate Count (TPC) 25-250 koloni adalah pengenceran untuk 10-
5
, 10-6, dan 10-10.

𝐻𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑡𝑒𝑟𝑡𝑖𝑛𝑔𝑔𝑖 44 x 1010

Perhitungan Ratio = 𝐻𝑎𝑠𝑖𝑙 𝑡𝑒𝑟𝑒𝑛𝑑𝑎ℎ = = 25433,526
173 𝑥 105

Apabila jumlah koloni antara 25-250, dipakai hasil yang terkecil jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah adalah >2. Sehingga didapatkan
jumlah koloni dalam 1 ml adalah 17x106 cfu/ml.
IV.3 Pembahasan

Pada percobaan ini, digunakan sampel air buangan dari saluran air got. Air
got yang sudah kami dapatkan, diencerkan sampai 10-10. Lalu kami masukan 1 ml
air sample mulai dari konsentrasi 10-5 sampai 10-10 ke dalam plate dengan metode
pour plate. Setelah itu bakteri dimasukan ke dalam inkubator dan dibuat kondisi
anaerobik dimana ditaruh didalam cawan petri dan ditutupi oleh kertas. Cawan petri
diamati dari hari ke 2 sampai hari ke 4. Dari pengamatan pada hari ke 2 sampai ke
4, terlihat koloni yang ada di cawan petri. Hal ini bisa dibuktikan dengan munculnya
bintik-bintik berwarna putih dan kuning. Koloni bakteri yang terlihat bisa berasal
dari bakteri, maupun mikroalga yang ada di dalam air buangan kami.

Mikroorganisme yang ada di air buangan terdiri dari bakteri dan mikroalga.
Jumlah rata-rata koloni untuk 10-5,10-6,10-7,10-8,10-9, dan 10-10 berturut turut adalah
173x 105, 62 x 106, 10 x 107, 4 x 108,, 1,5 x 109, dan 44 x 1010. Perhitungan rasio yang
didapat 25433,526, jumlah koloni yang terdapat dalam 1 ml adalah 17x106 cfu/ml. Angka
ini menunjukan banyaknya mikroalga dan bakteri yang terdapat di dalam sampel
air buangan dari saluran air got kami.