I.

JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein Dengan

Metode Biuret
II. HARI, TANGGAL PERCOBAAN : Rabu, 03 Oktober 2018
III. TUJUAN PERCOBOAN :
- Menenukan kadar protein yang ada pada daging ayam dengan metode
biuret.
IV. DASAR TEORI
A. Protein
Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan
ikatan peptide.molekul protein mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P, S dan
terkandang mengandung unsur-unsur sepert besi dan tembaga (Winarno,1992).
Protein termasuk dalam senyawa yang terpenting dalam organisme
hewan. Sesuai dengan peranan ini, kata proten berasal yang kata yunani
proteis , yang artinya “pertama”. Protein adalah poliamida dan hidrolisis
protein menghasilkan asam-asam amino. Hanya dua puluh asam amino yang
lazim dijumpai dalam protein tumbuhan dan hewan, namun kedua pluh asam
amino ini dapat digabungkan membentuk otot, urat, kulit, kuku, bulu, sutera,
hemoglobin, enzim, antibody dan banyak hormone (Fessenden, Ralp J dan
Joan S.Fessenden, 1989).
Protein merupakan zat gizi yang sangat penting karena yang paling erat
hubungannya dengan proses-proses kehidupan. Graldius mulder, mengisolasi
susunan tubuh yang mengandung nitrogen dan menamakannya protein, terdiri
dari satuan dasarnya yaitu asam amino (bias disebut jug a unit pembangun
protein) (Suharjo dan Clara,1992).
1. Struktur Protein
Protein mempunyai struktur umum :
Struktur Asam Amino

1
 Struktur protein ada 4 tingkatan, yaitu :
1. Struktur primer
Menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino dalam molekul
protein.
2. Struktur sekunder
Menunjukkan banyak sifat suatu protein ditentukan oleh orientasi
molekul sebagai suatu keseluruhan bentuk suatu molekul (spiral).
3. Struktur tersier
Menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida membentuk lipatan
tali gabungan.
4. Strukktur kuartener
Menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.
(Winarno 1992)
B. Denaturasi Protein
Struktur sekunder, tersier dan kuartener adalah struktur yang umumnya
memiliki energy van der wals rendah, karena itu dengan pemberian energy
cukup rendah saja maka stuktur sekunder, tersier, dan kuartener dari protein
dan dirusakkan, kejadian ini disebut denaturasi. Sebagai contoh sederhana,
telur yang dimasak setengah matang saja telah mengalami proses denaturasi
(Matsjeh,1994).
Jika proses denaturasi dilakukan dengan pemberian energy cukup kecil,
maka keadaan denaturasi dapat dikembalikan ke keadaan semula. Proses
semacam ini dinamakan proses denaturasi. Umumnya proses denaturasi
berjalan lambat (Matsjeh,1994).
C. Metode Biuret
Protei yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut air
(protein terlarut), karena yang diukuradalah jumlah ikatan peptide dalam
protein , maka tidak dapat mendeteksi nitrogen dari senyawa nonpeptida
sehingga yang terukur adalah protein sesungguhnya (Mannggas,2017).
Prinsip dari uji biuret ini yaitu ion Cu2+ akan bereaksi dengan ikatan
peptide dalam suasana basa (NaOH). Ion Cu2+ yang bereaksi dengan ikatan
peptide akan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu merupakan

2
indikator hasil uji positif pada uji biuret (Sudjadi,2008). Adapun reaksi yang
terjadi sebagai berikut :
CuSO4. 5 H2O(aq) + NaOH(aq) Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + H2O(l)
Cu(OH)2(aq) Cu2+ + 2OH-
O O

H H H
H O C C N C C NH2 + CuSO4(aq) + NaOH(aq)

R R

R R
OH
H
C C N C C NH
H H
O
O

Cu

H H
COOH C N C C NH
H

R R

Kompleks Ungu

Adapun penentuan kadar protei dapat dilakukan dengan beberapa

metode :
1. Metode Kjedhal
Kadar protein yang ditentukan berdasarkan cara Kjeldahl disebut sebagai
kadar protein kasar (crude protein) karena terikut senyawaan N bukan
protein. Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk
penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang
mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan
dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan
amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang
terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan
ditetapkan secara titrasi.
2. Metode Lowry
Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan
terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II)
akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen

3
 Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat
(phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue
akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino)
terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi
secara kolorimetri
3. Metode Bradford
Prinsip kerja dari metode Bradford didasarkan pada peningkatan secara
langsung zat warna Coomasie Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein
yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik
(tyrosine, tryptophan, dan phenilalanine) atau bersifat basa (arginine,
histidine, dan leusin). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecokelatan
(Imaks 465 nm), sedangkan dalam suasana basa reagen CBBG akan berada
dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru
(Imaks 595nm).
4. Metode Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan
formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini
berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi
antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi
perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.
5. Metode Dye Binding (Pengikatan zat warna)
Adanya gugus polar dalam protein dapat mengikat zat warna yang
bermuatan berlawanan dengan muatan protein membentuk komplek warna
yang tak larut. Zat warna yang sering digunakan ialah zat warna asidik
seperti Amino Black 10B (λ maks 615 nm) dan Orange G (λ maks 485 nm)
karena memiliki 2 gugus – SO3H (negatif) sehingga akan berikatan kuat
dengan gugus amina yang bersifat basa dari protein. Protein membentuk
kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi elektrostatik antar
molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut. Pewarna anionic
berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine,
arganine dan lysine) dan pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah

4
 pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks protein-pewarna
dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran
serapan.
D. Sprektofotometri
Sprektofotoetri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laju larutan berwarna pada
panjang gelombang spesfk dengan menggunakan monokromator prisma atau
kisi difraksi dengan detector fototube. Dalam analisis cara sprektofotometri
terdapat tiga daerah panjang gelombang elektromagnetik yang dgunakan,
yaitu daerah UV 9200-380 nm), daerah Visibel (380-700 nm), daerah
inframerah (700-3000 nm) (Sentrabd, 2007).
Prinsip kerja sprektofotometri berdasarkan hkum Lambert-Beer, bila
cahaya monokromatik (I0) melalui suatu media (larutan), maka sebagian
cahaya tersebut diserap (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It). Transmitans
adalah perbandingan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati sampel
(I0). Persyaratan hukum Lambert-Beer antara lain : radiasi yang digunakan
harus monokromatik, energy radiasi yang diadsorbsi oleh sampel tidak
menimbulkan reaksi kimia, sampel (larutan) yang mengabsorbsi harus
homogen, tidak terjadi flouresensi atau phosporesensi dan indeks refraksi
tidak berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan harus pekat (tidak encer)
(Day.JR., R.A. dan A.L Underwood, 1999).
Sprektofotometri UV-Vismerupakan gabungan antara sprektofotometri
UV dan Visibel menggunakan dua buah cahaya yang berbeda.sumber cahaya
UV dan Vsbel meskpun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
cahaya UV dan sumber cahaya visibel yaitu photodiode yang dilengkapi
dengan monokromator (Day, Jr., R. A. dan A.L. Underwood. 1999).
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan
paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan
baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi
ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV /
Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti
menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan (dekat ultraviolet (UV)

5
 dan dekat dengan inframerah (NIR)) kisaran. Penyerapan dalam rentang yang
terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di
wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi
elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi
berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state (Day, Jr., R. A. dan
A.L. Underwood. 1999).
Penyerapan sinar uv dan sinar tampak oleh molekul, melalui 3 proses
yaitu :

a. Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan electron anti ikatan.

b. Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks

c. Penyerapan oleh perpindahan muatan.

E. Kandungan Protein Daging Ayam

Salah satu sumber protein yang dianggap lebih menyehatkan adalah

dagng putih, terutama daging ayam. Ayam memang mengandung protein dan
sedikit lemak terutama jika tidak digoreng. Kandungan kalorinya cukup baik
dan tidak terlalu mengenyangkan . Bagian dada daging ayam seberat 85 gram
yang dimasak memiki sekitar 140 kalori, 3 gram lemak, dan 25 gram protein.
Bagian seperti paha mengandung kalori sedikit lebih banyak dan lemak. Jika
disertakan kulitnya, maka akan bertambah lemak sebanyak enam kali lipat
(Pratiwi, 2015).

V. ALAT DAN BAHAN

a. Alat-alat
- Tabung reaksi 12 buah
- Rak tabung reaksi 1 buah
- Tabung sentrifuge 1 buah
- Sentrifuge 1 buah
- Kaca arloji 1 buah
- Gelas kimia 100 mL 2 buah
- Mortal + alu 1 pasang

6
 - Pipet hisap 1 buah
- Pipet tetes 1 buah
- Waterbarth 1 buah
- Neraca Analitik 1 buah
- Spektrofotometri UV-Vis 1 set

b. Bahan
- Larutan standart protein 10 mL
- Sampel (daging ayam) 1 gram
- Reagen Biuret 40 mL
- Aquades secukupnya

VI. ALUR PERCOBAAN

a. Persiapan Sampel

1 gram Sampel

- Dihancurkan
- Ditambah 10 mL aquades
- Disentrifuge dengan kecepatan 3500
rpm selama 10 menit
- Didekantasi

Residu Filtrat (sampel)

7
b. Pembuatan Standart

Larutan induk protein 10 mg/mL

- Diencerkan menjadi beberapa

konsentrasi dengan menggunakan
rumus M1V1=M2V2 (menggunakan
labu ukur 10 mL

Larutan Larutan Larutan Larutan Larutan

protein protein protein protein protein

1 mg/mL 2 mg/mL 3 mg/mL 4 mg/mL 5 mg/mL

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
larutan larutan larutan larutan larutan
protein protein protein protein protein

1 mg/mL 2 mg/mL 3 mg/mL 4 mg/mL 5 mg/mL

- Dimasukkan kedalam 5 tabung reaksi

berbeda
- Ditambah 5 mL reagen biuret dan dikocok
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37⁰C,
didiamkan 30 menit pada suhu kamar sampai
terbentuk warna ungu stabil
- Diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm

A1 A2 A3 A4 A5

8
c. Penetapan Absorbansi Larutan Blangko

1 mL aquades

- Dimasukkan kedalam tabung reaksi

- Ditambah 5 mL reagen biuret
- Dikocok
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37⁰C,
didiamkan 30 menit pada suhu kamar
- Diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm

Absorbansi

d. Penetapan Absorbansi Larutan Sampel

1 mL sampel

- Dimasukkan kedalam tabung reaksi

- Ditambah 5 mL reagen biuret
- Dikocok
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37⁰C,
didiamkan 30 menit pada suhu kamar
- Diukur absorbansinya pada panjang gelombang
540 nm

Absorbansi

9
VII. HASIL PENGAMATAN

Hasil Pengamatan
No. Prosedur Percobaan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Sebelum Sesudah
1. Persiapan Sampel - Sampel : - Sampel Setelah disentrifuge akan terpisah Berdasarkan
daging dihancurkan antara filtrate dan residu percobaan
Sampel bentuk padatan ayam : berwarna didapatkan
- Aquades : putih
1 gram Sampel filtrat protein
lar.tidak kekuningan
berwarna - + 10 ml larut dalam air
- Dihancurkan yang tidak
aquades :
- Ditambah 10 mL aquades larutan berwarna dan
- Disentrifuge dengan kecepatan 3500 kekuningan residu
rpm selama 10 menit keruh berwarna putih
- Didekantasi - Disentrifuge kekuningan.
: terbentuk
dual apian
Residu Filtrat (sampel)  filtrate :
lar. tak
berwarna
 residu :
putih
kekuninga
n

10
2. Pembuatan larutan standar - Lar. standart - Larutan Dugaan : Berdasarkan
protein 10 standart - Terbentuk senyawa kompleks percobaan
Larutan induk protein 10 mg/m mg/mL : protein + antara Cu2+ dan ikatan peptida diketahui
lar. tidak reagen
- Diencerkan menjadi beberapa sehingga berwarna ungu dalam bahwa semakin
berwarna biuret :
suasana basa. besar
konsentrasi dengan menggunakan - lar. standart  Larutan
rumus M1V1=M2V2 (menggunakan protein (5, protein 1 - Nilai absorbansi (A) berbanding konsentrasi
labu ukur 10 mL) 4, 3, 2,1) mg/ml = lurus dengan konsentrasi protein
mg/mL : lar.  Semakin tinggi konsentrasi semakin besar
lar. tidak berwarna semakin pekat warna ungu yang nilai
berwarna ungu (+) dihasilkan absorbansinya
Larutan Larutan Larutan
- Aquades :  Larutan
protein protein protein
lar. tidak  Semakin tinggi konsentrasi ditandai dengan
protein 2
berwarna makin besar nilai semakin
1 mg/mL 3 mg/mL 5 mg/mL mg/ml =
- Pereaksi lar. absorbansinya. pekatnya warna
Larutan Larutan biuret : lar. berwarna ungu yang
protein protein biru jernih ungu (++) Reaksi : terbentuk ( 5 >
 Larutan  CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq) 4>3>2>1)
2 mg/mL 4 mg/mL protein 3  Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq)+ mg/mL dan
mg/ml = didapatkan
5H2O(l)
lar.
 Cu(OH)2(aq)  Cu2+ +2OH- nilai R2 =
berwarna
ungu 0,9926, dengan
(+++) persamaan
 Larutan linier y
protein 4 =0,0348x +
mg/ml = 0,0268
lar.

11
 berwarna
1 mL 1 mL 1 mL ungu
larutan larutan larutan (++++)
protein protein protein  Larutan + CuSO4(aq) + NaOH(aq) 
1 mg/mL 3 mg/mL 5 protein 5
mg/mL mg/ml =
lar.
1 mL 1 mL
larutan larutan
berwarna
protein protein
ungu
(+++++)
2 4 mg/mL - Diinkubasi
mg/mL
pada suhu
- Dimasukkan kedalam 5 tabung 37oC : lar.
reaksi berbeda tidak
- Ditambah 5 mL reagen biuret dan
dikocok berubah
- Diinkubasi selama 10 menit pada warna
Senyawa kompleks biru keunguan
suhu 37⁰C, didiamkan 30 menit - Didiamkan
pada suhu kamar sampai
30 menit :
terbentuk warna ungu stabil
- Diukur absorbansinya pada lar. tidak
panjang gelombang 540 nm berubah
warna
- Diukur
A1 A2 A3 A4 A5
absorbansin

12
 ya pada
panjang
gelombnag
540 nm
- Nilai
absorbansi :
- Konsentrasi
1 mg/ml =
0,065
- Konsentrasi
2 mg/ml =
0,091
- Konsentrasi
3 mg/ml =
0,135
- Konsentrasi
4 mg/ml =
0,161
- Konsentrasi
5 mg/ml =
0,204

13
3. Penetapan Absonbansi Larutan Blanko - Aquades = - aquades + Reaksi : Larutan blanko
larutan reagen CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq) digunakan
1 mL aquades tidak biuret = lar.  Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq)+ sebagai larutan
berwarna berwarna
5H2O(l) pembanding
- Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Reagen biru
- Diinkubasi dengan nilai
- Ditambah 5 mL reagen biuret biuret =
37oC = lar. absorbansi 0.
- Dikocok
larutan biru berwarna
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu
biru
37⁰C, didiamkan 30 menit pada suhu jernih
- didiamkan
kamar 30 menit :
- Diukur absorbansinya pada panjang lar.
gelombang 540 nm berwarna
biru
Absorbansi - Nilai
absorbansi
=0

14
4. Penentuan Absorbansi Larutan Sampel - filtrate - Filtrat - Kadar protein teoritis di dalam Diperoleh
sampel : lar. sampel + daging ayam sebesar 22 mg/100mL kadar protein
1 mL sampel tak reagen Reaksi : dalam dagng
berwarna biuret =  CuSO4.5H2O(aq) + 2NaOH(aq) ayam sebesar
- Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Reagen larutan  Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq)+ 2,937 g/mL dan
- Ditambah 5 mL reagen biuret berwarna
biuret = lar. 5H2O(l) 29,37 % dalam
- Dikocok ungu (++)
biru jernih - Diinkubasi  Cu(OH)2(aq)  Cu2+ +2OH- 1 gram sampel.
- Diinkubasi selama 10 menit pada suhu
37oC =
37⁰C, didiamkan 30 menit pada suhu
larutan
kamar berwarna
- Diukur absorbansinya pada panjang ungu (++) + CuSO4(aq) + NaOH(aq) 
gelombang 540 nm - didiamkan
30 menit :
Absorbansi larutan
berwarna
ungu (++)
- Nilai
absorbansi
= 0,129

Senyawa kompleks biru keunguan

15
VIII. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
Pada percobaan dengan judul “Penentuan Kadar Protein dengan Metode
Biuret” bertujuan untuk menentukan kadar protein yang terkandung dalam
daging ayam dengan metode biuret. Protein adalah polimer dari asam amino
yang dihubungkan dengan ikatan peptide,.molekul protein mengandung unsur-
unsur C, H, O, N, P, S dan terkandang mengandung unsur-unsur sepert besi
dan tembaga (Winarno,1992).
Metode yang digunakan dalam menentukan kadar protein pada daging
ayam yaitu metode biuret. Pinsip kerja dari uji biuret yaitu ion Cu2+ akan
bereaksi dengan ikatan peptide dalam suasana basa membentuk senyawa
kompleks berwarna ungu dalam suasana basa. Adanya warna ungu dar
senyawa kompleks yang terbentuk merupakan indkator hasil uji positif pada
uji biuret. Selain dengan metode biuret, uji protein dapat dlakukan dengan
beberapa metode antara lain, metode Kjedhal, metode Lowry, metode
Bradford, metode Formol, metode Dye Binding. Alasan digunakannya metode
biuret dalam penentuan kadar protein dikarenakan metode biuret mampu
mengidentifikasi ikatan peptide dengan sempurna sehigga dapat diperoleh
kadar protein total yang larut dalam air (protein terlarut). Pada metode biuret
kadar protein diukur berdasarkan ikatan peptide sehingga hanya mendeteksi
nitrogen dari senyawa peptide sedangkan nitrogen non peptide tidak dapat
terdeteksi sehingga yang terukur merupakan protein sesungguhnya. Adapun
kelebhan dar metode biuret antara lain, murah, cepat (30 menit),
penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan metode lain,
sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi, N dari non peptide dan non
peptide tidak terdeteksi (Maninggar, Maning. 2017).
Alasan tidak digunakannya metode penentuan protein yang lainnya
seperti metode kjeldhal misalnya, dikarenakan pada metode ini mendeteksi
nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung
nitrogen sehingga semua jenis protein akan terhitung walapun bukan nitrogen
dari protein. Sedangkan metode lowry memiliki kesensitifan yang tinggi
dalam mengidentifikasi protein, selain itu metode ini juga sangat sensitive
terhadap zat pengotor sehingga ikut terbaca dalam analisis protein dan warna
yang dihasilkan dari metode ini sangat bervariasi tergantung pada jenis protein

16
yang diuji. Maka dari itu, kemungkinan akan terjad kesalahan saat dibaca nilai
absorbansinya. Dapat dikatakan bahwa pada uji biuret telah dilakukan
analysis kualitatif dari terbentuknya warna ungu yang dihasilkan dari reaksi
anatara ikatan peptide dengan Cu2+. Sedangkan untuk analisis kuantitatif
dilakukan dengan bantuan alat sprektofotometri, dimana alat tersebut akan
membaca nilai absorbansi dari hasil uji biuret pada larutan protein, dari nilai
absorbansi tersebut dapat dketahui konsentrasi larutan protein sehingga dapat
dicari kadar protein dalam sampel.
Adapun tahapan-tahapan yang harus dilalalui dalam penentuan kadar
protein dalam sampel adalah sebagai berikut :
1. Persiapan Sampel
Dalam tahapan percobaan kali ini, sampel yang digunakan adalah
daging ayam. Sebelum dilakukan pengujian kadar protein pada sampel,
mula-mula daging ayam tanpa kulit yang telah dibersihkan dipotong
kecil-kecil, kemudian daging tersebut ditimbang 1 gram dengan neraca
analitik. Setelah itu, potongan daging tersebut dihaluskan dengan mortal
dan alu dan diperoleh sampel daging ayam yang telah halus dengan warna
putih kekuningan. Selanjutnya sampel yang telah dihaluskan ditambahkan
dengan aquades (tidak berwarna) 10 mL dan menghasilkan larutan keruh
kekuningan .Fungsi dari dilarutkannya sampel dalam aquades yaitu agar
dihasilkan larutan protein yang berasal dari protein daging ayam yang
dapat terlarut dalam air. Sedangkan tujuan dari dihaluskannya daging
ayam agar saat ditambahkan dengan aquades protein yang dapat larut
dalam aquades bisa terserap sempurna. Sampel yang telah dilarutkan
dengan aquades kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3500 rpm
selama 10 menit untuk memisahkan filtrat dan residu yang tidak larut
dalam larutan sampel. Pemisahan tersebut juga dapat meminimalisir
adanya komponen lain yang terdapat dalam larutan sampel yang akan diuji
kadar proteinnya. Filtrat sampel yang dihasilkan tidak berwarna sedangkan
endapan nya berwarna putih kekuningan berada di dasar tabung sentrifuge.
Setelah itu hasil dari sentrifuge didekantasi untuk memisahkan antara

17
 filtrate dengan residunya kembali, dimana filtrat sampel yang akan
digunakan untuk uji kadar protein.
2. Pembuatan Standart
Tahapan kedua dalam praktikum kali ini yaitu pembuatan strandart
yang digunakan untuk mencari kurva standart yang diperoleh dari
absorbansi pada tiap konsentrasi larutan standart. Setelah diperoleh kurva
standart , diccari nilai regresi dan persamaan liniernya. Dari persamaan
tersebut dapat dicari kadar protein dalam sampel. Langkah pertama yang
dilakukan adalah larutan standart protein (tidak berwarna) 10 mg/mL
diencerkan menjadi beberapa konsentrasi dengan persamaan :
M1xV1 = M2xV2
Pengenceran larutan standart protein dilakukan dalam beberapa
konsentrasi :
a. Konsentrasi 5 mg/mL, dilakukan dengan memasukkan larutan standart
10 mg/mL sebanyak 5 mL kedalam labu ukur 10mL kemudian
ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas meniskus pada labu
ukur.
b. Konsentrasi 4 mg/mL, dilakukan dengan memasukkan larutan standart
5 mg/mL sebanyak 8 mL kedalam labu ukur 10mL kemudian
ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas meniskus pada labu
ukur.
c. Konsentrasi 3 mg/mL, dilakukan dengan memasukkan larutan standart
4 mg/mL sebanyak 7.5 mL kedalam labu ukur 10mL kemudian
ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas meniskus pada labu
ukur.
d. Konsentrasi 2 mg/mL, dilakukan dengan memasukkan larutan standart
3 mg/mL sebanyak 6,67 mL kedalam labu ukur 10mL kemudian
ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas meniskus pada labu
ukur.
e. Konsentrasi 1 mg/mL, dilakukan dengan memasukkan larutan standart
2 mg/mL sebanyak 5 mL kedalam labu ukur 10mL kemudian

18
 ditambahkan dengan aquades sampai tanda batas meniskus pada labu
ukur.
Dari pengenceran larutan standart protein 10mg/mL, dihasilkan
larutan protein dengan berbagai konsentrasi yang tidak berwarna.
Selanjutnya masing-masing larutan dari berbagai konsentrasi diambil 1
mL dan dimasukkan dalam 5 tabung reaksi yang berbeda. Kemudian
kelima tabung yang telah berisi larutan standart protein ditambahkan
dengan 5 mL larutan biuret (berwarna biru). Fungsi dari penambahan
reagen biuret untuk mengidentifikasi ikatan peptide yang terdapat pada
larutan sampel yang ditandai dengan perubahan warna larutan menjadi
ungu. Dimana Cu2+ akan berikatan dengan ikatan peptide protein
menghasilkan senyawa kompleks berwarna ungu dalam suasana basa.
Suasana basa tersebut dari NaOH dari reagen biuret yang terdiri dari
senyawa NaOH dan CuSO4. Adapun reaksi yang terjadi antara reagen
biuret sebagai berikut :
CuSO4. 5 H2O(aq) + NaOH(aq) Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + H2O(l)
Cu(OH)2(aq) Cu2+ + 2OH-
Sedangkan reaksi yang terjadi antara reagen biuret dengan ikatan
peptide pada protein adalah sebagai berikut :
O O

H H H
H O C C N C C NH2 + CuSO4(aq) + NaOH(aq)

R R

R R
OH
H
C C N C C NH
H H
O
O

Cu

H H
COOH C N C C NH
H

R R

Kompleks Ungu

Dari reaksi di atas dapat diketahui bahwa saat reagen biuret bereaksi
dengan ikatan peptide akan dihasilkan senyawa kompleks yang berwarna

19
ungu. Warna ungu yang dihasilkan akan berbeda, tergantung pada
konsentrasi protein, semakin tinggi konsentrasi protein maka warna ungu
yang dihasilkan akan semakin pekat. Semakin pekat warna yang
dihasilkan menandakan bahwa semakin banyak senyawa kompleks ungu
yang terbentuk.
Kemudian larutan protein yang telah ditambahkan reagen biuret
diingkubasi selama 10 menit pada suhu 370C dan didiamkan selama 10
menit. Fungsi dilakukannya inkubasi pada larutan protein pada suhu 37oC
untuk mengetahui apakah reaksi antara reagen dengan peptide telah
bereaksi sempurna dan pada suhu 37oC merupakan suhu optimum untuk
ikatan peptide bereaksi dengan Cu2+ yang ditandai dengan terbentuknya
warna ungu stabil pada larutan sampel. Sedangkan fungsi larutan
didiamkan selama 30 menit untuk mendingankan larutan dan
menghentikan reaksi agar tidak mempengaruh saat dilakukan uji dengan
sprektofotometri UV-Vis untuk diketahui nilai absorbansinya. Adapun
warna ungu yang dihasilkan pada masing-masing konsentrasi larutan
protein sebagai berikut :
- Konsentrasi 1 mg/mL = larutan berwarna ungu
- Konsentrasi 2 mg/mL = larutan berwarna ungu +
- Konsentrasi 3 mg/mL = larutan berwarna ungu ++
- Konsentrasi 4 mg/mL = larutan berwarna ungu +++
- Konsentrasi 5 mg/mL = larutan berwarna ungu ++++
Setelah itu, masing-masing larutan standart protein dilakukan uji
dengan alat sprektofotometri pada panjang gelombang 540 nm, dimana
panjang gelombang tersebut merupakan panjang gelomang maksimum
larutan protein dapat menyerap cahaya foton. Dalam uji dengan
sprektofotometri juga melbatkan larutan blangko sebagai larutan
pembanding. Adapun nilai absorbansi yang diperoleh adalah sebagai
berikut :
- Konsentrasi 1 mg/mL = 0,065
- Konsentrasi 2 mg/mL = 0,091
- Konsentrasi 3 mg/mL = 0,135

20
 - Konsentrasi 4 mg/mL = 0,161
- Konsentrasi 5 mg/mL = 0,204

Nilai absorbansi yang didapatkan menunjukkan bahwa semakin

besar konsentrasi larutan protein dalam sampel maka semakin besar pula
nilai aborbansi. Nilai absorbansi diperoleh dari akumulasi cahaya foton
yang diserap oleh larutan sampel dikurangi dengan cahaya yang diteruskan
ke larutan blangko, dari akumulasi tersebut dapat diketahui nilai
absorbansi dari analit dalam sampel. Kenaikan nilai absrbansi seiring
dengan naiknya konsentrasi sesuai dengan Hukum Lambert-Beer
menyatakan hubungan linieritas antara absorbansi dengan konsentrasi
larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan.
Dari nilai absorbansi larutan standart protein yang diperoleh dapat
dibuat kurva standart sebagai berikut :

Grafik Absorbansi Larutan

Standart Proten
0.25
0.2 y = 0.0348x + 0.0268
R² = 0.9926
0.15
A

0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6
C

Berdasarkan pada kurva standart di atas dapat diketahui bahwa

nilai aborbansi larutan standar protein berbanding lurus dengan
konsentrasinya dan hal tersebut juga sesua dengan semakn pekatnya warna
ungu yang dihasilkan sehingga penyerapan larutan terhadap cahaya foton
semakin maksimum sehingga nilai absorbansinya semakin besar. Dari
kurva diatas diperoleh persamaan linier y = 0,0348x + 0,0268 dengan
nilai regrasi sebesar R2 = 0,9926. Akan tetapi pada konsentras 1 mg/mL

21
 dan 2 mg/mL, nilai absorbansi yang didapat tidak sampai pada 0,1.
Berdasarkan teoritisnya, nilai absorbansiyang baik adalah antara 0,1 – 1.
Hal tersebut menunjukkan bahwa dalam melakukan praktikum terdapat
beberapa faktor yang menyebabkan hal tersebut antara lain kurang nya
keakuratan dalam melakukan pengenceran, ada pengotor atau kontamnan
dalam larutan sampel yang ikut bereaksi sehingga dapat mempengaruhi
nilai absorbansi, atau saat penggunaan kuvet kaca sprektofotemri masih
kurang bersih daerah sekitar luar kuvet, sehingga dapat mengganggu
penyerapan cahaya.
3. Penetapan Absorbsi Larutan Balngko
Pada tahapan ini dilakukan pembuatan larutan blangko yan
digunakan sebagai larutan pembanding terhadap pelarut dalam pereaksi
yang digunakan pada larutan sampel protein. Untuk membuat larutan
blangko dibutuhkan 1 mL aquades (tidak berwarna) dimasukkan ke dalam
tabung reaksi, kemudian ditambahkan 5 mL reagen biuret (berwarna biru)
dan dikocok menghasilkan warna larutan biru. setelah itu, larutan blangko
tersebut diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC dan didiamkan
selama 30 menit pada suhu ruang, dan dihasilkan larutan blangko yang
berwarna biru. tidak adanya perubahan warna pada larutan sampel
membuktikan bahwa dalam larutan blangko tidak terdapat protein yang
akan menghasilkan warna ungu saat direaksikan dengan reagen biuret.
Setelah itu, larutan blnagko diuji dengan alat sprektofotometri UV-Vis
pada panjang gelombang 540 nm sama dengan panjang gelombang pada
larutan protein sampel. Sebelum dilakukan uji, kuvet kaca
sprektofotometri yang akan digunakan dibilas dengan aquades untuk
menghindarkan dari sisa-sisa larutan bekas pemakaian sebelumnya yang
dapat menjadi kontaminan terhadap larutan yang akan diuji. Kuvet kaca
pertama diisi dengan larutan blangko dan kuvet kaca kedua diisi dengan
larutan aquades sebagai pembanding setelah itu dibaca nlai absorbansinya.
Dari pengukuran tersebut diperoleh nilai absorbansi sebesar 0, (karena
ddalam larutan blangko tidak terdapat campuran protein sehingga larutan

22
 tersebut tidak mampu menyerap cahaya foton secara maksimum pada
panjang gelombang 540 nm).
4. Penentuan Absorbansi Larutan Sampel
Tahapan terakhir dari percobaan ini adalah penentuan nilai
absorbasi dari larutan fltrat protein sampel dari daging ayam. Nilai
absorbansi tersebut nantinya akan digunakan untuk mengetahui kadar
protein dalam daging ayam. Langkah pertama yang dilakukan adalah 1 mL
larutan filtrat sampel yang tidak berwarna dimasukkan dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan 5 mL reagen biuret yang berwarna biru dan
dicampurkan dengan sempurna sehingga dihasilkan warna larutan ungu
(++). Bila warna larutan tersebut dibandingkan dengan warna ungu pada
larutan standart diketahui bahwa warna ungu pada larutan filtrat sampel
berada diantara konsentrasi 2 mg/mL-3mg/mL. adanya perubahan warna
tersebut membuktikan bahwa dalam larutan sampel terdapat ikatan peptide
yang berikatan dengan Cu2+ membentuk ikatan kompleks berwarna ungu
pada suasana basa . suasana basa tersebut berasal dari reagen biuret yang
mengandung senyawa CuSO4 dan NaOH sebagai pemberi suasana basa.
Setelah itu larutan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37oC dan
didiamkan selama 30 menit dalam suhu ruang dan dihaslikan larutan yang
berwarna ungu stabi l (++). Fungsi dilakukannya inkubasi pada larutan
protein pada suhu 37oC untuk mengetahui apakah reaksi antara reagen
dengan peptide telah bereaksi sempurna dan pada suhu 37oC merupakan
suhu optimum untuk ikatan peptide bereaksi dengan Cu2+ yang ditandai
dengan terbentuknya warna ungu stabil pada larutan sampel. Sedangkan
fungsi larutan didiamkan selama 30 menit untuk mendinginkan larutan dan
menghentikan reaksi agar tidak mempengaruhi saat dilakukan uji dengan
sprektofotometri UV-Vis untuk diketahui nilai absorbansinya. Adapun
reaksi yang terjadi antara reagen biuret sebagai berikut :
CuSO4. 5 H2O(aq) + NaOH(aq) Cu(OH)2(aq) + Na2SO4(aq) + H2O(l)
Cu(OH)2(aq) Cu2+ + 2OH-
Sedangkan reaksi yang terjadi antara reagen biuret dengan ikatan
peptide pada protein adalah sebagai berikut :

23
 O O

H H H
H O C C N C C NH2 + CuSO4(aq) + NaOH(aq)

R R

R R
OH
H
C C N C C NH
H H
O
O

Cu

H H
COOH C N C C NH
H

R R

Kompleks Ungu

Setelah itu dilakukan pengujian dengan sprektofotemetri pada

panjang gelombang 540 nm, panjang gelombang tersebut merupakan
panjang gelombang maksimum dimana protein dapat menyerap cahaya
foton yang dipancarkan. Sebelum dilakukan uji, kuvet kaca dibersihkan
dengan aquades untuk menghilangkan larutan sisa yang dapat menjadi
pengotor yang dapat mempengaruhi nilai absorbansi. Kuvet pertama diisi
dengan larutan sampel sedangkan kuvet kedua disi dengan larutan
pembanding yaitu larutan blangko yang telah dibuat. Setelah itu baru
dibaca nilai absorbansinya.
Dari pengujian dengan spretofotometri didapatkan nilai ansorbansi
sebesar 0,129. Dari nilai tersebut dapat dicari konsentrasi protein dalam
sampel dengan menggunakan persamaan regresi linier yang didapat dari
kurva larutan standart yaitu y = 0,0348x + 0,0268. Dari persamaan
tersebut didapatkan konsentrasi protein dalam larutan sampel sebesar
2,937 g/mL. Dari konsentrasi tersebut dapat dicari kadar protein dalam
sampel dengan menggunakan persamaan :
𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 = 𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 100%
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

Dari persamaan tersebut didapatkan kadar protein dalam daging

ayam sebesar 29,37 %. Hasil tersebut mendekati kadar teorits kandungan
protein pada daging ayam sebesar 22 mg/100mL. perbedaan kadar tersebut

24
 dapat dipengaruhi dengan penggunaan daging ayam yang berbeda jenisnya
atau pengambilan daging ayam dari bagian tubuh ayam yang berbeda.

IX. KESIMPULAN
Berdasarkan pada percobaan yang telah dilakukan, maka dapat
disimpulkan :
1. Nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi, semakin tinggi
konsentrasi larutan maka akan semakin tinggi nilai absorbansinya yang
ditandai dengan semakin pekatnya warna larutan seiring dengan
meningkatnya konsentrasi.
2. Dari kurva standart larutan protein diperoleh persamaan regresi linier y =
0,0348x + 0,0268 dengan n y = 0,0348x + 0,0268la y = 0,0348x + 0,0268
dengan nilai regresi, R2 = 0,9926.
3. Larutan blanko dapat digunakan sebagai larutan pembanding terhadap
pelarut dalam pereaksi dengan nilai absorbansi 0.
4. Nilai absorbansi dari larutan sampel daging ayam sebesar 0,129, dengan
konsentrasi sebesar 2,937 g/mL dan kadar hasil dari perhitungan sebesar
29,37 % sedangkan secara teoritis seharusnya kadar protein ikan lele
adalah sebesar 22 mg/100 mL.

X. JAWABAN PERTANYAAN
1. Buatlah kurva standart konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva
standart tersebut tentukan kadar protein sampel !

Grafik Perbandingan Absorbansi

Dengan Konsentrasi Pada Larutan
Standar Protein
0.25
0.2 y = 0.0348x + 0.0268
absorbansi

0.15 R² = 0.9926
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6
konsentrasi

25
 Konsentrasi sampel
y = 0,0348x + 0,0268
0.129 = 0,0348x + 0,0268
0,129− 0,0268
x = 0,0348

x = 2,937 mg/mL
Kadar 100 gram = 2,937 mg x 100 g/ 1 g
= 293,7 mg/ 100 gram
= 0,2937 g/ 100 gram
Kadar protein di dalam sampel daging ayam
𝑔
0,2937
𝑚𝐿
Kadar = 𝑥 10 𝑚𝐿 𝑥 100%
1𝑔

= 29,37 %
2. Apakah peptide akan memberikan reaksi positif terhadap reaksi biuret?
Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang
tercampur dengan peptide?
Jawaban : Iya peptide akan memberikan reaksi positif terhadap reaksi
biuret, karena reaksi biuret merupakan salah satu metode yang
digunakan untuk mengidentifikasi adanya kandungan protein dalam
larutan, yang ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna ungu
yang merupakan hasil reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptide pada
protein. Selain itu reaksi biuret juga merupakan metode kuantitatif
untuk menentukan kadar protein dengan dibantu alat spektrofotometri
UV-VIS dalam menentukan nilai absorbansi, yang dapat digunakan
untuk menghitung konsentrasi dan kadar protein dalam larutan. Cara
penentuan kadar protein yang tercampur dengan peptide dapat
dilakukan dengan menambahkan reagen biuret yang dapat membentuk
kompleks berwarna ungu, dan selanjutnya diukur nilai absorbansinya
dengan alat spektrofotometri UV-VIS untuk menghitung konsentrasi
dan kadar protein yang terkandung dalam larutan tersebut.

XI. DAFTAR PUSTAKA

Day, Jr., R. A. dan A.L. Underwood. 1999. .Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi
VI. Erlangga. Jakarta.

26
Fessenden. Ralp dan Joan Fessenden. 1989. Kimia Organik ed 3. Jakarta :
Erlangga.
Hendayana, Semar. Asep Kadarohman, A.A Sumarna, dan Asep Supriatna.
1994. Kimia Analitik Instrumen. IKIP Semarang : Press Semarang.
Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996.
Kimia Organik II. Jakarta : Depdikbud.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius.
Suharjo & Clara, M. K. 1992. Prinsip-prinsip Ilmu Gizi. Yogyakarta : Kasinus.
Sentrabd. 2007. Spectophotometer Absobsi UV/VIS.
http ://sentrobd.com/main/info/Insi ght/Spectrofotometer. html.
Tanggal akses 5 Oktober 2018.
Tim Dosen Kimia. 2017. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya : Unesa.
Winarno, F. G. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : Gramedia.

27
HASIL ABOSRBANASI MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER UV-
VISIBLE

Grafik Perbandingan Absorbansi Dengan Konsentrasi

Pada Larutan Standar Protein
0.25
y = 0.0348x + 0.0268
0.2
R² = 0.9926
absorbansi

0.15

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6
konsentrasi

28
 LAMPIRAN PERHITUNGAN
Pengenceran

Diketahui :

M induk protein : 10 mg/mL

- Protein 5 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
10 x V1 = 5 x 10
V1 = 5 mL

- Protein 4 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
5 x V1 = 4 x 10
V1 = 8 mL

- Protein 3 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
4 x V1 = 3 x 10
V1 = 7,5 mL

- Protein 2 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
3 x V1 = 2 x 10
V1 = 6,67 mL

- Protein 1 mg/mL
M1 x V1 = M2 x V2
2 x V1 = 1 x 10
V1 = 5 mL

Konsentrasi sampel
y = 0,0348x + 0,0268
0.129 = 0,0348x + 0,0268
0,129− 0,0268
x = 0,0348

29
x = 2,937 mg/mL

Kadar 100 gram = 2,937 mg x 100 g/ 1 g

= 293,7 mg/ 100 gram
= 0,2937 g/ 100 gram

Kadar protein di dalam sampel daging ayam

𝑔
0,2937
𝑚𝐿
Kadar = 𝑥 10 𝑚𝐿 𝑥 100%
1𝑔
= 29,37 %

30
 Dokumentasi Praktikum

No Gambar Keterangan
1 Alat dan bahan dalam percoban
penentuan kadar protein dengan
metode biuret. Terdiri dari dan bahan
diantaranya:
1. Gelas ukur 10 mL
2. Labu ukur 10 mL
3. Tabung reaksi
4. Gelas Kimia 100 mL
5. Mortar dan Alu
6. Tabung sentrifuge
7. Cawan petri
8. Reagen biuret
9. Larutan standart albumin 10 mg/mL
10. Daging Ayam

2 Sampel Daging Ayam

3 Sampel daging ayam yang telah diris

tipis ditimbang menggunakan neraca
analitik seberat 1 gram

31
4 Sampel daging yang telah dilarutkan
dalam air disentrifuge untuk
memisahkan residu daging ayam dan
diperoleh filtrat larutan protein daging
ayam

5 Larutan sampel yang telah disentrifuge

menghasilkan residu dan supernatant

6 Pembuatan larutan standart albumin 1,

2, 3, 4, dan 5 mg/mL untuk menentukan
kurva standart dengan melakukan
pengenceran bertingkat

7 Larutan standart albumin 1, 2, 3, 4, 5

mg/mL dan larutan protein daging
ayam sebanyak 1 mL

32
8 Reagen biuret sebanyak 5 mL
ditambahkan pada tabung reaksi larutan
standart dan larutan sampel

9 Reaksi antara reagen biuret dengan

larutan protein dari larutan standart dan
larutan sampel menghasilkan warna
ungu dengan berbagai intensitas
bergantung pada konsentrasi protein
didalamnya

10 Larutan standart dan larutan sampel

yang telah ditambahkan reagen biuret
ditempatkan pada waterbath selama 15
menit dengan suhu 37 derajat Celcius.

11 Dilakukan pengukuran absorbansi

larutan standart dan larutan sampel
menggunakan spektrofotometer UV-
Vis pada panjang gelombang 680 nm.

33
12 Diperoleh nilai Absorbansi beserta
grafik dari larutan standart dan nilai
absorbansi larutan sampel.

34