Nama Kelompok 8:

1. Alfi Nur Faizah170342615558

2. Inayatul Hasanah 170342615527

Offering : I

Materi : Properties and Replication

Eksperimen Meselson dan Stahl

Watson dan Crick mengemukakan bahwa DNA bereplikasi secara semikonservatif

diterbitkan pada tahun 1958 oleh M.S Meselson dan F.W Stahl. Hasil mereka menunjukkan
bahwa kromosom dari basil / bakteri yang umumnya berada di usus, yaitu Escherichia coli
bereplikasi secara semikonservatif. Meselson dan Stahl menumbuhkan sel-sel E. coli dengan
banyak generasi dalam sebuah medium yang memiliki isotop padat dari nitrogen yang telah
disubstitusi untuk normal light isotop. Nitrogen tergandung di dalam basa purin dan pirimidin
dalam DNA. Dengan demikian, sel-sel DNA yang tumbuh pada medium yang mengandung
isotop padat dari nitrogen akan memiliki kepadatan lebih tinggi. Hal tersebut dikarenakan
adanya prosedur equilibrium density gradient centrifugation untuk molekul-molekul dari
kepadatan berbeda dapat dipisahkan. Meselson dan Stahl dapat membedakan antara tiga
kemungkinan cara replikasi DNA dengan mengikuti perubahan kepadatan DNA dari sel-sel
yang ditumbuhkan pada medium yang memiliki isotop padat dari nitrogen yang kemudian
dipindahkan ke medium normal light isotop untuk periode waktu yang berbeda-beda
(sehingga disebut density transfer eksperiments).
Autoradiografi Replikasi Bakteri Kromosom

Visualisasi replikasi kromosom pertama kali dilakukan oleh J Cairns pada tahun 1963
menggunakan teknik yang disebut autoradiografi. Autoradiografi adalah metode untuk
mendeteksi dan melokalisasi isotop radioaktif dalam preparasi sitologis atau makromolekul
dengan paparan emulsi fotografis yang peka terhadap emulsi fotografis yang sensitif terhadap
rendah radiasi -energi. Autoradiograf yang diamati ketika flms dikembangkan (Gambar 5 16)
menunjukkan bahwa kromosom E colf adalah struktur melingkar yang ada sebagai 6-bentuk
intermedlates selama replikasi. Autoradiographs menunjukkan lagi bahwa uniding dari dua
helai orangtua yang saling melengkapi. (yang diperlukan untuk pemisahan mereka) dan
replikasi semikonservatif mereka terjadi secara bersamaan atau digabungkan erat karena
heliks ganda orangtua harus berputar 360 ° untuk melepaskan setiap gyre heliks, ini
mengharuskan adanya putaran dalam kromosom yang ada bukti menunjukkan bahwa
transient single-strand break (pembelahan satu ikatan phodiester phosester dalam satu helai
heliks ganda) memberikan sumbu rotasi untuk memungkinkan penafsiran Cairns yang lepas
dari autoradiograf adalah bahwa replika semikonservatif dimulai pada sebuah situs pada
kromosom, yang ia sebut " asal, "dan berjalan secara berurutan dan tidak searah di sekitar
struktur lingkaran (Gbr. 516) Bukti berikutnya menunjukkan interpretasi aslinya tidak benar
pada satu titik replikasi sebenarnya menghasilkan dua arah, tidak secara tidak langsung
Setiap struktur berbentuk Y adalah garpu replikasi, dan garpu replikasi rwo bergerak dalam
arah yang berlawanan secara berurutan di sekitar kromosom melingkar.
Unique origins and bidirectional replication

Cairn belum bisa memberikan informasi bahwa penelitiannya pada titik awal replikasi
merupakan asal usul replikasi (situs tempat replikasi dimulai) adalah situs unik atau terjadi
secara acak pada kromosom. Selain itu, Hasil itu juga belum bisa memberikan perbedaan
antara yang unidireksional (satu arah) atau bidireksional (dua arah). Namun sekarang terdapat
fakta bahwa replikasi pada E. coli atau beberapa organisme lain diproses secara dua arah dari
asalnya yang khas. Bakteriofag lamda atau faga λ (T2) merupakan virus yang berkembang
pada E coli. Dia memiliki kromosom dan molekul DNA single linier yang panjangnya 17,5
µm.

M. Schnos dan R. B. Inman menggunakan metode pemetakan denaturasi

(denaturation mapping) yang dilakukan pada kromosom bakteriofag λ. Kromosom dari
bakteriofag λ tersebut memiliki sifat unik karena pada tiap ujung (kohesif) kromosom
memiliki untaian yang komplementer (saling melengkapi satu sama lain). Kromosom pada
bakteriofag λ ini muncul sebagai bentuk linier yang dapat berubah menjadi bentuk sirkuler
karena adanya ikatan hidrogen. Kemudian ikatan tersebut dapat berubah menjadi ikatan
kovalen yang menutup bentuk sirkuler tadi karena adanya katalisasi oleh enzim ligase
polinukleotida.
 Gambar 5.17 : Interkonversi dari lambda chromo-some linear dengan ujung
"kohesif" komplementernya, kromosom lambda kromosom yang diikat secara hidro, dan
kromosom lambda melingkar yang tertutup rapat. Bentuk linear kromosom akan tampak
sebagai adaptasi untuk memfasilitasi injeksi dari kepala fage melalui lubang kecil pada fage
tail ke dalam sel inang selama infeksi. Sebelum direplikasi dalam sel inang, kromom
dikonversi menjadi bentuk melingkar yang tertutup secara kovalen. Hanya ujung kromosom
virion dewasa yang diperlihatkan; garis vertikal bergerigi menunjukkan bahwa bagian tengah
kromosom tidak diperlihatkan. Panjang seluruh kromosom lambda adalah sekitar 45 x 101
nukleotida-pasangan.

Ujung beruntai tunggal ini, yang disebut ujung "kohesif" atau lengket ", saling
melengkapi satu sama ujung kohesif kromosom lambda lainnya sehingga dapat membentuk
pasangan berpasangan untuk membentuk struktur melingkar berikatan hidrogen. Salah satu
peristiwa pertama terjadi setelah kromosom lambda yang disuntikkan ke dalam sel inang
adalah konversinya menjadi molekul melingkar yang tertutup secara kovalen (Gambar 5.17)

Gambar 5.19. Penggunaan situs denaturasi kaya AT sebagai penanda fisik pada
kromosom fag untuk membuktikan bahwa replikasi dua arah, bukan searah. (A) Lokasi
gelembung denaturatlon terlihat dalam bentuk linear pada kromosom lambda 17,5 u panjang.
setelah perlakuan pH 11,05 selama 10 menit, suhu 25 ° C. Penggunaannya sebagai penanda
fisik pada bentuk melingkar kromosom lambda ditunjukkan pada (b). Sebuah grafik mikro
elektron dari kromosom A 6-ulangan yang terdenaturasi, berbentuk-ulang. ditunjukkan dalam
(c), dengan interpretasi yang ditunjukkan dalam bentuk linier di bawahnya. Panah bengkok
mengidentifikasi gelembung denaturasi 1 kecil di ujung kiri krom linear dan menunjuk ke
arah ujung kanan. Sepuluh gelembung denaturasi yang paling tidak jelas terlihat diberi label a
to i, untuk membantu dalam orientasi. Kedua garpu replikasi dilingkari. [Mikrografaf yang
ditunjukkan pada (c) direproduksi dengan izin dari M. Schnös dan RB Inman, Mol. Bio! 51:
61-73 , 1970 Hak Cipta ° 1970 oleh Acad emic Press, Inc. (London), Ltd.

Gambar 5.21 Penggunaan pemetaan denaturasi mikroskop elektron untuk

membedakan antara (a) mode searah dan (b) bldirectional dari replikasi kromosom. Perlakuan
kromosom pada pH 11,05 selama 10 menit pada 25 ° C dalam kondisi yang sesuai akan
denaturasi hanya daerah yang mengandung pasangan basa A-T konsentrasi tinggi.
"Gelembung denaturasi" ini dapat digunakan sebagai penanda fisik untuk lokasi spesifik pada
kromosom. Dengan memeriksa posisi garpu replikasi relatif terhadap penanda ini dalam
populasi kromosom replikasi, orang dapat membedakan antara replikasi dua arah dan dua
arah.

Secara umum replikasi molekul DNA pada eukariotik juga terjadi secara dua arah,
tetapi ada juga yang tidak seperti pada kromosom Coliphage P2. Titik awal suatu replikasi
selalu pada sisi tertentu, tetapi terkadang tidak diketahui tempatnya. Dan titik awal yang
inaktif (sekunder) umumnya akan muncul pada beberapa organisme, misalnya pada titik awal
primer replikasi phage T7 yang apabila dihapus atau hilang dari kromosom akan digantikan
fungsinya oleh sisi tertentu lain pada kromosom tersebut.

DNA Polimerase dan Sintesis DNA In-Vitro

Pertama kali dilakukan oleh Arthur Kornberg dan asistennya pada tahun 1957,
Kornberg berhasil mengisolasi sebuah enzim yang berasal dari bakteri E. coli yang awalnya
disebut sebagai DNA polimerase atau “Enzim Kornberg”. Hal tersebut dinakamakan DNA
polimerase I berfungsi dalam penambahan nukleotida secara kovalen untuk membentuk
kembali rantai DNA. Enzim itu membutuhkan masing-masing sebuah 5`-trifosfat dari ke 4
deoksiribonukleosida yang ada, yaitu: deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksitimidin
trifosfat (dTTP), deoksiguanosin trifosfat (dGTP), dan deoksitidin trifosfat (dCTP). Empat
enzim tersebut hanya dapat aktif jika terdapat ion Mg2+ dan DNA yang sudah ada
sebelumnya.

diagram situs fungsional enzim ditunjukkan pada Gambar 5.25 yang meliputi :
 1. DNA primer.
DNA polymerase I nya tidak dapat menginisiasi sintesis dari rantai DNA de novo.
Hanya dapat menambahkan nukleotida ke ujung 3`-hidroksil bebas pada rantai DNA
yang sudah ada sebelumnya. DNA polymerase I mengkatalisis susunan dari jembatan
fosfodiester diantara 3`-OH pada akhir rantai DNA primer dan 5`-fosfat pada
deoksiribonukleotida yang baru masuk. Arah sintesis dari proses tersebut menjadi
5` 3`.
2. DNA template.
DNA polymerase I tidak berisi untaian yang spesifik, pada enzimnya membutuhkan
rantai DNA template yang urutan basanya sudah didikte, melalui syarat pasangan basa
DNA, sintesis dari urutan basa yang saling membutuhkan sudah di sintesis
sebelumnya.

Pada DNA polimerase digolongkan menjadi DNA polimerase I, II, dan III yang
ditemukan pada bakteri khususnya E. coli dan B. subtilis. Selain itu juga ada DNA
polymerase α,β, dan γ yang sudah diidentifikasi dari beberapa eukariotik, dan ada polymerase
δ yang baru-baru ini ditemukan. DNA polimerase I berfungsi dalam perbaikan rantai DNA
juga bertanggung jawab dalam pemotongan RNA primer yang akan digunakan untuk
mensintesis DNA dan DNA polimerase III memiliki peran yang sangat penting dalam
replikasi DNA, sedangkan DNA polimerase II memiliki fungsi yang masih belum jelas, tetapi
saat DNA polimerase I dan III tidak ada maka DNA polimerase II akan menggantikan fungsi
kedua DNA polimerase tersebut.

Aktivitas DNA polimerase yang dipelajari khususnya pada prokariotik tidak hanya
meliputi aktivitas polimerase 5’3’ tetapi juga aktivitas eksonuklease (suatu enzim yang
membuang molekul nukleotida dari ujungnya) 3’5’ dan keduanya muncul dalam satu
makromolekul. Pada E. coli, ditemukan pula aktivitas eksonuklease 5’3’ yang muncul
mengkatalis reaksi 5’3’ polimerase dan reaksi eksonuklease 3’5’. Proses di atas berperan
penting dalam metabolisme DNA. Aktivitas eksonuklease 3’5’ memiliki peran yang sangat
penting pada replikasi DNA, yaitu sebagai “pengoreksi atau proofreading” jika terjadi
kesalahan pada pasangan basa DNA primer atau bahkan terdapat basa nukleotida yang tidak
berpasangan. Selain itu aktivitas eksonuklease 5’3’ juga sangat penting pada penghapusan
segmen DNA yang rusak, misalnya akibat sinar ultraviolet.
The “Growing-Point Paradox” dan sintesis DNA terputus

Karena helai komplementer dari heliks ganda memiliki polaritas yang berlawanan
(berkebalikan), ini berarti bahwa sintesis terjadi pada ujung 5’ dari ujung untaian lainnya
(atau 3'→5 ') dan ujung 3' dari ujung untaian lainnya (5'→3 '). Akan tetapi, sebagaimana
dibahas dalam bagian sebelumnya, semua polimerase yang dikenal memiliki persyaratan
mutlak untuk 3'-hidroksil bebas; mereka hanya melakukan sintesis 5'→3 '. Paradoks ini ada
selama banyak tahun selama biokimiawan mencari dengan Cuma-cuma polimerase baru yang
dapat melakukan sintesis 3'→5 '. Tidak ada polimerase seperti itu yang ditemukan. Sebagai
gantinya, bukti kuat telah mengakumulasikan yang menunjukkan bahwa semua sintesis
terjadi dalam arah 5→3 '. Resolusi paradoks dihasilkan dari menunjukkan bahwa sintesis satu
untai DNA adalah terputus.

Autoradiografi dan mikroskop elektron menunjukkan bahwa dua untai DNA yang
baru lahir yang disintesis pada setiap percabangan garpu diperluas ke arah yang sama pada
tingkat makromolekul. Karena untaian komplementer dari heliks ganda DNA memiliki
polaritas kimia yang berlawanan, satu untai cenderung ke arah keseluruhan 53 'dan untai
lainnya sedang diperpanjang dalam arah keseluruhan 3'5 (Gambar 528, atas). Pada tingkat
molekuler, namun sintesis sebenarnya terjadi dalam arah yang berlawanan (Gambar 5.28,
bawah). Pada tingkat molekuler, kedua untaian baru sedang disintesis dalam arah 53 '. Helai
yang diperluas dalam arah 35 'keseluruhan tumbuh dengan sintesis segmen pendek (disintesis
5'3'), dan penyatuan berikutnya dari segmen-segmen pendek ini dengan ligase polinukleotida.
Bukti untuk modus terputus-putus dari replikasi DNA ini datang dari studi di mana inter-
medlates dalam sintesis DNA secara radioaktif diberi label oleh pertumbuhan sel untuk waktu
yang sangat singkat dalam medium yang mengandung ('Hjthymidine Cpulse-labeling ")
Ketika sel-sel E coli berada berlabel nadi selama 15 detik, misalnya, semua label ditemukan
dalam potongan kecil panjang 1000-2000 nukleotida. Potongan kecil ini atau segmen DNA,
sering disebut "fragmen Okazaki setelah R Okazaki, yang pertama kali mengidentifikasi
mereka, lebih kecil, sekitar Panjang 100-200 nukleotida, pada eukariota. Ketika periode
pelabelan nadi yang lebih lama digunakan, lebih banyak label yang diperoleh dalam molekul
DNA besar - mungkin ukuran molekul yang mengandung semua DNA yang ada di
kromosom utuh. Dalam periode pelabelan nadi pendek, radioaktivitas hadir dalam "fragmen"
DNA pendek menjadi tergabung dalam molekul DNA seukuran kromosom selama
pertumbuhan sel selanjutnya pada media yang mengandung timidin nonradloaktif. Ini penting
karena ini menunjukkan bahwa "fragmen Okazaki" adalah perantara sejati dalam sintesis
DNA daripada beberapa jenis produk sampingan metabolisme. Bukti luas telah menunjukkan
bahwa sintesis DNA adalah kontinu untuk untai yang tumbuh dalam arah 5'3 'secara
keseluruhan (kadang-kadang disebut untai "terkemuka") dan tidak kontinyu untuk untai yang
tumbuh dalam arah keseluruhan 3'5' (kadang-kadang disebut the "lagging strand) seperti yang
ditunjukkan pada Gambar 5.28

Gambar5.28

Inisiasi dan "Masalah Primer

Seperti yang telah ditekankan sebelumnya, semua poli DNA yang diketahui memiliki
persyaratan mutlak untuk OH 3 'bebas pada primer DNA ditambah untai templat DNA yang
sesuai untuk aktivitas Dengan demikian, tidak ada satu pun DNA polimerase yang dapat
memulai sintesis dari untaian DNA baru. Karena sintesis setiap "fragmen Okazaki"
memerlukan peristiwa inisiasi, mekanisme inisiasi rantai yang efisien sangat penting untuk
replikasi DNA yang sedang berlangsung. RNA polimerase, enzim kompleks yang
mengkatalisis sintesis molekul RNA dari templat DNA, telah lama diketahui mampu
memulai sintesis rantai RNA baru di lokasi spesifik pada DNA.Ketika ini terjadi, hibrid
RNA-DNA terbentuk di mana RNA yang baru lahir terikat hidro-gen ke templat DNA Sejak
DNA poli merase mampu memperluas rantai polinukleotida yang mengandung primer RNA
dengan 3'-OH bebas, para ilmuwan di beberapa laboratorium mulai menguji gagasan bahwa
sintesis DNA diprakarsai oleh primer RNA. sekarang bukti definitif mendukung proposal
bahwa sintesis DNA diprioritaskan oleh segmen sbort RNA yang kemudian dihapus oleh
exonuclease 53 'dan diganti oleh DNA sebelum penyegelan kovalen oleh ligase
polynucleotide (Gbr. 5.29) Dalam E col, primer RNA dieksisi oleh aktivitas eksonuklease 5-3
'dari DNA polimerase L Ini terjadi secara bersamaan dengan sintesis untai DNA baru
(menggantikan untaian primer RNA yang dieksisi) dengan 5-3' aktivitas poliolase dari enzim
ini (Gambar 5.29) Sintesis primer RNA dikatalisis oleh enzim yang disebut primase, yang
memiliki propertles yang sangat berbeda dari polimerase RNA. E coli primase adalah produk
dari gen dnaG. Pada prokariota, primer RNA adalah 10-60 nukleotida. Dalam eukariota
mereka cukup pendek, sekitar 10 nukleotida panjang. Penggunaan primer RNA hampir pasti
merupakan mekanisme yang paling umum digunakan untuk memulai sintesis DNA. Namun
demikian, beberapa virus tampaknya memiliki berevolusi mekanisme yang sangat berbeda
untuk inisiasi sintesis DNA.

THE COMPLETE “REPLICATION APPARATUS” IS COMPLEX

Ketika Watson dan Crick meneliti struktur DNA heliks ganda, DNA memiliki sifat
komplementer yang menjadi dasar duplikasi materi genetic yang sama. Penelitian yang
dilakukan oleh Markelson dan Stahl dari kromosom E. coli menguatkan konsep bahwa dua
helai heliks ganda berfungsi sebagai templat untuk sintesis untaian komplementer. Dengan
demikian, heliks ganda induk mengarahkan sintesis dua heliks ganda keturunan yang identik.
Isolasi Kornberg terhadap enzim, DNA polimerase I, Mampu mensintesis DNA in vitro
menunjukkan hubungan akhir dalam apa yang dianggap sebagai mekanisme sederhana untuk
tidak terjadi.

Replikasi DNA dilakukan oleh kompleks multienzim, sering disebut alat replikasi
atau replisome. dalam eukariota, Replikasi DNA membutuhkan banyak protein berbeda,
Sebagai contoh, replikasi DNA dalam E coli membutuhkan setidaknya dua lusin produk gen
yang berbeda. Gen ini telah dimurnikan dan perannya dalam replikasi DNA terjadi secara in
vitro. Gambar 5.30 menunjukkan keterlibatan beberapa protein E coli ini dalam replikasi
DNA.

Pertama, dua untaian komplementer dari heliks ganda orangtua harus dipotong dan
dipisahkan sehingga berfungsi sebagai templat untuk sintesis untaian anak perempuan baru.
Pelepasan dan gerakan garpu replikasi terjadi secara progresif dengan untaian yang sementara
dilepaskan di depan garpu bergerak sepanjang kromosom. Tiga jenis protein yang berbeda
tampaknya berkontribusi untuk melepaskan helaian heliks ganda. (1) Protein pengurai DNA
atau helikase DNA terlibat langsung dalam mengkatalisasi ikatan heliks ganda. Dalam E.
coli, dua helik berbeda terlibat. Satu helikase, produk dari gen rep, mengikat dan merangsang
pemisahan untai yang memiliki polaritas 3 'sampai 5' dalam arah replikasi gerakan garpu. (2)
Protein berikat single-strand DNA (SSBPs) berikatan erat dengan daerah beruntai tunggal
DNA yang dihasilkan oleh aksi helikase dan membantu menstabilkan templat beruntai
tunggal beruntai yang dibutuhkan untuk polimerisasi. SSBP mengikat DNA sebagai tetramer,
dan pengikatannya menunjukkan kerja sama (yaitu, pengikatan satu tetramer merangsang
pengikatan tetramer tambahan ke segmen yang berdekatan dari DNA beruntai tunggal).
Pengikatan SSBP dengan single-stranded DNA cenderung menahan DNA itu dalam
konfigurasi yang diperluas dan mencegahnya melipat kembali dengan sendirinya. DNA
beruntai tunggal yang jenuh dengan SSBP terikat bereplikasi lebih dari 100 kali lebih cepat
daripada DNA beruntai tunggal tanpa in vitro. untaian tunggal tunggal dari DNA membentuk
struktur sekunder yang mengganggu pergerakan DNA polimerase atau komponen lain dari
kompleks replikasi di sepanjang molekul dengan cara proses normal. (3) Akhirnya, girase
DNA, yang mengkatalisasi pembentukan superkoil negatif dalam DNA (lihat Gambar 5.36),
sangat penting untuk replikasi dan memainkan peran kunci dalam proses pelepasan.
Supercoiling telah diusulkan untuk membantu "mendorong" proses pelonggaran. DNA girase
dapat berfungsi dengan mengeluarkan superkoil positif yang terakumulasi di depan garpu
replikasi saat heliks melepaskan heliks ganda.

Untai DNA yang baru kemudian melakukan inisiasi dengan penggunaan primer RNA
oleh mekanisme sebelumnya (lihat Gambar 5.29). Sintesis primer RNA dikatalisis oleh enzim
primase. Aktivitas primase membutuhkan pembentukan kompleks primase dan setidaknya
enam protein lainnya. Selain primase, primosom mengandung protein i, n, n ', dan n "plus
produk-produk gen dnaB dan dnaC (Tabel 5.4). Primosome melakukan reaksi priming awal
pada untai utama dan pengulangan priming sintesis "fragmen Okazaki" untuk untai lagging
(disintesis secara terputus-putus dalam keseluruhan arah 3 'ke 5' tetapi 5 'ke 3' pada tingkat
molekuler, lihat Gambar 5.28).

Perpanjangan kivalen (Lihat Gambar 5.26) dari rantai DNA prima selama replikasi
kromosom di E. coli dilakukan oleh DNA polimerase III tidak seperti DNA polymerase I dari
E. coli (yang merupakan polipeptida tunggal; lihat Gambar 5.25), DNA polimerase III adalah
enzim kompleks yang mengandung tujuh polipeptida yang berbeda (Gambar 5.31), dan
semua polipeptida ini harus ada untuk fungsi replikasi yang tepat. Aktivitas polimerase 5
'sampai 3' dan aktivitas eksonuklease 5 'sampai 3' keduanya ada pada polipeptida DNA
polimerase III. Aktivitas proofreading 3 'sampai 5' (lihat Gambar 5.27) dari polimerase III
ada pada e polipeptida. Setelah aktivitas DNA polimerase III pada garpu replikasi, DNA
polimerase I mengkatalisis penghilangan primer RNA dengan aksi dari aktivitas exonuclease
5 'sampai 3' dan aktivitas polimerase 5 'ke 3', dan DNA ligase mengkatalisasi penutupan
kovalen dari "nick" untai tunggal yang dihasilkan (Gbr. 5.30).

Beberapa komponen penting untuk repkikasi DNA telah diidentifikasi secara genetik,
yaitu strain E. coli yang membawa mutasi yang mengakibatkan ketidakmampuan untuk
mereplikasi DNA dalam kondisi tertentu. Mutasi dikarakterisasi secara genetik pada
serangkaian gen (ditunjuk sebagai DNA, DNA, dll.) Yang produknya diperlukan untuk
sintesis DNA in vivo. Produk dari beberapa gen ini diketahui. Misalnya, dnaE, dnaN, dnax,
dan dnaZ kode untuk empat dari tujuh subunit (polipeptida) dari enzim DNA polimerase III
lengkap, dan dnaG menentukan primase.
Replikasi Phage px174 dan "LingkaranBergulir"

Bacteriophage px174 merupakan virus kecil menyimpan informasi genetic mereka dalam
molekul DNA melingkar beruntai tunggal. Ketika virus menginfeksi sel inang, E. coli pada
px174, virus beruntai tunggal. DNA (disebut "untaian positive) dikonversi menjadi bentuk
heliks ganda (disebut bentuk replikatif, RE) dengan sintesis untai negatif "komplementer. RF
orang tua berganda ini kemudian bereplikasi beberapa kali untuk menghasilkan populasi
Molekul RF (beruntai ganda), yang pada gilirannya mereplikasi asimetris untuk
menghasilkan populasi besar virus progeny untai (+) . Helai virus progeny kemudian
dimasukkan kedalam mantel protein untuk menyelesaikan siklus reproduksi. Replikasi
kromosom X174 dapat dibagi menjadi tigat ahap: (1) RF strand parental (+), (2) RF progeny
orangtua, dan (3) progeny keturunan RF (+) (Gambar 5.32). Di dua yang terakhir tahap-
tahap, sintesis DNA terjadi oleh mekanisme berbeda yang disebut replikasi "lingkaran
bergulir". Dalamkasusini, bagaimanapun, struktur replikatif adalah molekul DNA sirkular
dengan untai tunggal (Gambar 533). Replikasi lingkaran bergulir dimulai ketika aktivitas
endonuclease spesifik-sekuendari fag oX174. Sebuah protein membelah untaian positif RF
orang tua pada asal replikasi (Gambar 532): Aktivitas endonuclease memotong px174
cromosome hanya di satu situs organ replika. Ini menghasilkan 3'-OH dan 5'-fosfat termini di
situs potongan untai (+); untai (-) tetap utuh. Ujung 5 'dari untai (+) tidak rusak. sedangkan
untai berputar pada sumbunya. W. Gilbert dan D. Dressler, model lingkaran bergulir dari
replikasi DNA termasuk enzims pesifik, yang disebut "transferase," yang menempel ujung 5
'dari (+) untai kesitus tertentu pada membran sel. Ujung 5 'dipindahkan, DNA polymerase
mengkatalisasi ekstensi kovalen di ujung lainnya (3'-OH).

Selama replikasi, untai positif yang baru digunakan sebagai template untuk sintesis
terputus dari untaian negatif komplementer. Dalam beberapa kasus, sintesis untai
komplementer dapat terputus putus pada ekor beruntai tunggal sebelum sintesis untai pertama
telah selesai. Dalam kasus seperti itu, ekor beruntai ganda akan diproduksi. Peralihan dari
sintesis DNA RF untai ganda ke sintesis DNA untai tunggal (+) terjadi ketika protein spesifik
dari mantel virus diproduksi di dalam sel. Replikasi lingkaran bergulir terus berlanjut, tetapi
ketika untai virus dipindahkan, protein lapisan ini mengikatnya dan mencegah sintesis
untaian komplementer (-) (Gbr. 5.32) Fase gen DX174 Fase Sebuah protein adalah protein
utama dalam replikasi X174>. Ia memiliki serangkaian ketidakaktifan yang luar biasa. (1)
Gene A protein memiliki aktivitas endonuclease khusus lokasi yang membelah untai positif
pada awalnya. (2) Gene A protein kemudian mempertahankan energy dari ikatan fosfodiester
yang terpotong dengan cara menempel secara kovalendari terminal 5'-fosforil kedirinya
sendiri. (3) Gene A protein tetap terikat pada 5-terminus untai positif dan kereplikasi garpu
sementara garpu melintasi templat minus-untai melingkar lengkap. (4) Ketika untai positif
lengkap telah disintesis, protein A gen memotong asal baru, ligate 3-hidroksil dan 5-fosforil
termini, dan sekali lagi menjadi co-valently terkait dengan terminal untai 5-positif yang baru
dihasilkan. Siklus aktivitas gen A protein ini diulang sampai populasi RF progeni (stadium II)
atau untai positif progeni (stadium III) diproduksi. bukti replikasi lingkaran bergulir (1) virus
DNA untai tunggal seperti px174, (2) replikasi yang terkait dengan chromo-acteria (lihat Bab
8), dan (3) replikasi molekul DNA ekstrachromosomal kecil yang membawa kelompok gen
rRNA selama oogenesis dalam amfibi

RETROVIRUSES

Retrovirus merupakan virus yang berkembang aatau berasal dari proses Retrotranspososn.
Retrotransposon merupakan transkipsi terbalik, yaitu reaksi dimana yang biasanya DNA
akan melakukan transkipsi sehingga menghasilkan RNA tetapi justru RNA melakukan
transkipsi sehingga menghasilkan DNA. Proses transkipsi terbalik ini berperan pernting
dalam siklus hidup virus. Ketika salah satu dari virus ini menginfeksi sebuah sel, RNA virus
disalin ke dalam DNA beruntai ganda. Karena informasi genetik bergerak dari RNA ke DNA,
virus ini disebut retrovirus. Penelitian mengenai retrovirus diawali oleh David Baltimore dan
Howard Temin pada tahun 1970. Berbagai jenis retrovirus telah diisolasi dan diidentifikasi.
Dan ditemukan human immunodeficiency virus (HIV) yang menyerang sistem kekebalan
tubuh sehingga menyebabkan AIDS. AIDS ditularkan dari satu orang ke orang lain melalui
cairan tubuh seperti darah atau air mani yang telah terkontaminasi dengan HIV. Gejala awal
dari penyakit ini seperti flu, demam dan kelelahan.
Gambar diatas merupakan mekanisme dari virus menginfeksi sel host. Pada awalnya virus
untuk memasuki sel host akan berinteraksi dengan protein reseptor spesifik yaitu CD4
reseptor. Interaksi ini dimediasi oleh glikoprotein disebut gp120, yang tertanam di dalam
lipid membran yang mengelilingi partikel virus. Setelah gp120 menempel pada CD4 reseptor,
membran virus berfusi sehingga partikel virus masuk ke dalam sel. Di dalam sel, membran
lipid dan mantel protein yang mengelilingi partikel virus dihapus, dan bahan-bahan di dalam
inti virus dilepaskan ke dalam sitoplasma sel. Inti ini mengandung dua molekul RNA untai
tunggal yang identic dengan genom virus dan sejumlah kecil protein yang memfasilitasi
replikasi genom, termasuk dua molekul reverse transcriptase dari virus, dan terikat pada
untai RNA virus. Reverse transcriptase mengkatalisasi sintesis DNA virus dari RNA virus
dalam sitoplasma. Integrase mengkatalisasi penyisipan DNA virus ke dalam DNA seluler di
dalam nukleus. Molekul DNA kemudian masuk ke dalam kromosom sel yang terinfeksi,
akibatnya mengisi genom sel itu dengan banyak salinan virus genom. RNA polimerase
seluler mentranskripsi DNA virus menjadi RNA virus. RNA virus berfungsi untuk
mengarahkan sintesis protein virus dan menyediakan RNA genomik untuk perakitan partikel
virus baru. Beberapa RNA virus berfungsi sebagai mRNA untuk sintesis protein virus.
Beberapa RNA virus membentuk genom virus progeni. Partikel virus progeni berkumpul di
dekat membran sel. Partikel virus baru dikeluarkan dari sel melaui proses perkembangan
tunas pada membrane. Partikel yang keluar dapat menginfeksi sel lain dengan berinteraksi
dengan Reseptor CD4 pada permukaannya. Dengan cara ini, materi genetik HIV direplikasi
dan disebarkan melalui populasi sel imun yang rentan.
Genom HIV, panjangnya sedikit lebih dari 10 kilobase, mengandung tiga gen yaitu
gag, pol, dan env. Gen gag mengkode protein dari partikel virus; gen pol mengkodekan
reserve transkriptase dan integrase, yang mengkatalisis penyisipan DNA dari genom HIV ke
dalam kromosom sel inang; dan gen env mengkodekan glikoprotein yang tertanam dalam
membrane lipid virus.

Pada gambar dibawah ini dijelaskan proses katalisasi reserve transcriptase yang
diawali dengan proses sintesis DNA untai tunggal dengan RNA dari genom virus. tRNA
primer berkomplementer dengan sekuens yang disebut PBS (primer binding site) terletak di
sebelah kiri pusat dalam RNA HIV. TRNA terikat dengan PBS di inti HIV. Setelah reserve
transcriptase mengkatalisasi sintesis DNA virus dari ujung 3', ribonuklease H (RNase H)
mendegradasi RNA genomik dalam dupleks RNA-DNA. Degradasi ini meninggalkan urutan
berulang (R) dari untai DNA yang baru untuk hibridisasi dengan urutan R pada 3' akhir RNA
HIV. Hasilnya adalah wilayah R dari untai DNA yang baru "melompat" dari 5' akhir RNA
HIV ke 3' akhir dari RNA HIV. Reverse transcriptase selanjutnya memperluas salinan DNA
dengan menggunakan 5' wilayah RNA HIV sebagai template. Pada langkah 5, RNaseH
mendegradasi semua RNA dalam dupleks RNA-DNA kecuali saluran polipurin (PPT), yang
sebagian besar terdiri dari purin adenin dan guanin. Saluran polipurin ini digunakan untuk
sintesis untaian DNA kedua bagian dari genom HIV. Setelah tRNA dan RNA genom hadir,
dupleks RNA-DNA dihilangkan dengan "lompatan" DNA kedua yang terjadi selama PBS di
5' ujung untai DNA kedua berhibridisasi dengan komplementer PBS di 5' akhir untai DNA
pertama. 3' -Hidroksil dari dua untai DNA kemudian digunakan untuk menyelesaikan sintesis
DNA utama DNA HIV beruntai ganda .
 Konversi virus RNA ke DNA virus menghasilkan urutan sama di kedua ujung
molekul DNA. Urutan ini, disebut long terminal repeats (LTRs), diperlukan untuk integrasi
genom virus ke dalam DNA sel inang.
Integrasi dari DNA virus dikatalisis oleh enzim integrase, yang memiliki aktivitas
endonuklease. Integrase pertama kali diawali pada 3' ujung DNA HIV dengan membuat
potongan beruntai tunggal di dekat ujung kedua LTR. Selanjutnya digunakan untuk katalisis
integrase pada ikatan fosfodiester dalam urutan target dalam DNA sel inang. Proses ini
menghasilkan pembentukan hubungan fosfodiester baru antara 3 ujung DNA HIV dan 5
fosfat dalam DNA inang. Pada tahap akhir integrasi, enzim perbaikan DNA sel inang mengisi
celah untai tunggal untuk menghasilkan genom DNA HIV secara kovalen
dimasukkan ke dalam DNA kromosom sel inang. Perhatikan urutan target di situs integrasi
digandakan. Genom HIV terintegrasi setelahnya menjadi bagian permanen dari
genom sel inang, bereplikasi seperti segmen inang lainnya DNA. Retrovirus terintegrasi dari
berbagai jenis hadir dalam vertebrata genom, termasuk kita sendiri. Karena retrovirus ini
direplikasi bersama dengan sisa DNA, mereka ditransmisikan ke anak perempuan sel selama
pembelahan, dan jika mereka terintegrasi dalam sel garis kuman, mereka juga diturunkan ke
generasi berikutnya melalui gamet. Ahli genetika sebut urutan DNA yang diturunkan yang
diturunkan dari transkripsi terbalik dan integrasi genom virus retrovirus endogen. Untuk
sebagian besar, urutan ini telah kehilangan kemampuan mereka untuk menghasilkan infeksi
partikel virus; karena itu, mereka adalah sisa-sisa virus kuno yang tidak berbahaya infeksi.
HIV bukanlah retrovirus endogen, tetapi jika itu harus hilang potensi mematikan dan
ditransmisikan dalam bentuk terintegrasi melalui kuman baris, itu bisa menjadi satu. Kami
sekarang mengalihkan perhatian kami ke dua kelas retrotransposon: the elemen seperti
retrovirus, yang menyerupai bentuk retrovirus yang terintegrasi, dan retroposons, yang
merupakan salinan DNA dari polyadenylated RNA
 .
RETROVIRUS SEPERTI ELEMEN
Retrovirus memiliki wilayah pengkodean pusat yang diapit oleh LTR, yang berorientasi pada
arah yang sama. Urutan yang diulang biasanya beberapa ratus pasangan nukleotida panjang.
Setiap LTR, pada gilirannya, biasanya dibatasi oleh pengulangan terbalik seperti yang
ditemukan pada jenis transposon lainnya. Wilayah pengkodean elemen retrovirus berisi
jumlah gen, biasanya hanya dua. Gen-gen ini homolog dengan
gen gag dan pol ditemukan dalam retrovirus. Dalam elemen retrovirus, gag dan protein pol
memainkan peran penting dalam proses transposisi. Salah satu elemen mirip retrovirus yang
paling banyak dipelajari adalah transposon Ty1 dari ragi Saccharomyces cerevisiae. Elemen
ini memiliki panjang 5,9 kilobase; panjangnya sekitar 340 pasangan basa, dan menciptakan
duplikasi situs target 5-bp saat dimasukkan ke dalam kromosom. Sebagian besar strain ragi
memiliki sekitar 35 salinan elemen Ty1 di genom mereka. Elemen Ty1 hanya memiliki dua
gen, TyA dan TyB, yang homolog dengan gen gag dan pol dari retrovirus. Biokimia
penelitian telah menunjukkan bahwa produk dari kedua gen ini dapat membentuk seperti
virus partikel dalam sitoplasma sel ragi. Transposisi Ty1 elemen melibatkan transkripsi
terbalik RNA. Setelah RNA disintesis dari DNA Ty1, sebuah transkriptase terbalik yang
dikodekan oleh gen TyB menggunakannya sebagai templat untuk membuat DNA beruntai
ganda, mungkin dalam partikel seperti virus. Kemudian DNA yang baru disintesis
dipindahkan ke nukleus dan dimasukkan di suatu tempat dalam genom, menciptakan elemen
Ty1 baru. Unsur-unsur mirip retrovirus juga telah ditemukan di Drosophila. Salah satu yang
pertama yang diidentifikasi disebut copia, dinamakan demikian karena menghasilkan jumlah
berlebihanRNA. Elemen copia secara struktural mirip dengan elemen ragi Ty1. Gipsi itu
unsur, retrotransposon Drosophila lain, lebih besar dari unsur copia karena itu mengandung
gen yang mirip dengan gen env dari retrovirus. Keduanya copia dan unsur-unsur gipsi
membentuk partikel mirip virus di dalam sel Drosophila; namun, hanya partikel yang
mengandung RNA gipsi yang dapat bergerak melintasi membran sel, mungkin karena mereka
juga mengandung produk gen env gypsy. Elemen gipsi. Oleh karena itu tampaknya menjadi
retrovirus asli. Banyak keluarga lain di
transposon mirip retrovirus telah ditemukan di Drosophila, tetapi aktivitasnya kurang
dipahami.
RETROPOSONS
Retroposons, atau retrotransposon non-LTR. Elemen ini bergerak melalui molekul RNA yang
ditranskripsi terbalik ke dalam DNA, Biasanya protein dikodekan oleh elemen itu sendiri.
Mereka mampu melakukan duplikasi situs target ke dalam kromosom tanpa pengulangan
terbalik. Retroposon menunjukkan asal mereka sebagai transkrip kebalikan dari RNA
polyadenylated. Dalam Drosophila, retroposon khusus ditemukan di ujungnya (telomer)
kromosom, di mana mereka melakukan fungsi kritis pengisian DNA yang hilang karena
replikasi kromosom yang tidak lengkap. Dengan setiap putaran replikasi DNA, kromosom
menjadi lebih pendek. Memendekkan terjadi karena DNA polimerase hanya dapat bergerak
dalam satu arah, menambahkan nukleotida ke 3' akhir primer. Biasanya, primernya adalah
RNA, dan ketika itu dihapus, daerah beruntai tunggal dibiarkan di ujung DNA dupleks. Pada
putaran replikasi berikutnya, untai yang kurang menghasilkan dupleks itu lebih pendek dari
aslinya. Ketika proses ini berlanjut, siklus demi siklus, kromosom kehilangan bahan dari
ujungnya. Untuk mengimbangi kehilangan ini, Drosophila telah mengembangkan mekanisme
yang aneh melibatkan setidaknya dua retroposon yang berbeda, satu disebut HeT-A dan yang
lainnya disebut TART (untuk retrotransposon terkait-telomer).
 1. Bagaimana “Enzim Kornberg” atau disebut juga DNA polimerase I dapat aktif ?
Inayatul Hasanah (170342615527)
Jawab: DNA polimerase I berfungsi dalam penambahan nukleotida secara kovalen
untuk membentuk kembali rantai DNA. Enzim itu membutuhkan masing-masing
sebuah 5`-trifosfat dari ke 4 deoksiribonukleosida yang ada, yaitu: deoksiadenosin
trifosfat (dATP), deoksitimidin trifosfat (dTTP), deoksiguanosin trifosfat (dGTP), dan
deoksitidin trifosfat (dCTP). Empat enzim tersebut hanya dapat aktif jika terdapat ion
Mg2+ dan DNA yang sudah ada sebelumnya.
14 15
2. Bagaimanakah N dan N dapat didistribusikan di dalam DNA bakteri E.Coli
selama satu generasi pada eksperimen Meselson-Stahl?
Inayatul Hasanah (170342615527)
Jawab: Pada prinsipnya DNA akan bereplikasi secara semikonservatif. Hal tersebut
14
menyebabkan untaian parental dari DNA yang mengandung N akan dikonservasi
dan nantinya digunakan sebagai template untuk mensintesis untaian komplementer
15
baru yang mengandung N. Jadi, masing-masing DNA yang double helix akan
mengandung satu “light” strand atau untaian ringan(14N), dan satu “heavy” strand
atau untaian berat(15N).
3. Bagaimana proses katais transcriptase
Alfi Nur Faizah (170342615558)

proses katalisasi reserve transcriptase yang diawali dengan proses sintesis DNA untai tunggal
dengan RNA dari genom virus. tRNA primer berkomplementer dengan sekuens yang disebut
PBS (primer binding site) terletak di sebelah kiri pusat dalam RNA HIV. TRNA terikat
dengan PBS di inti HIV. Setelah reserve transcriptase mengkatalisasi sintesis DNA virus dari
ujung 3', ribonuklease H (RNase H) mendegradasi RNA genomik dalam dupleks RNA-DNA.
Degradasi ini meninggalkan urutan berulang (R) dari untai DNA yang baru untuk hibridisasi
dengan urutan R pada 3' akhir RNA HIV. Hasilnya adalah wilayah R dari untai DNA yang
baru "melompat" dari 5' akhir RNA HIV ke 3' akhir dari RNA HIV. Reverse transcriptase
selanjutnya memperluas salinan DNA dengan menggunakan 5' wilayah RNA HIV sebagai
template. Pada langkah 5, RNaseH mendegradasi semua RNA dalam dupleks RNA-DNA
kecuali saluran polipurin (PPT), yang sebagian besar terdiri dari purin adenin dan guanin.
Saluran polipurin ini digunakan untuk sintesis untaian DNA kedua bagian dari genom HIV.
Setelah tRNA dan RNA genom hadir, dupleks RNA-DNA dihilangkan dengan "lompatan"
DNA kedua yang terjadi selama PBS di 5' ujung untai DNA kedua berhibridisasi dengan
komplementer PBS di 5' akhir untai DNA pertama. 3' -Hidroksil dari dua untai DNA
kemudian digunakan untuk menyelesaikan sintesis DNA utama DNA HIV beruntai ganda .