Artikel Penelitian

Desain Primer PCR Secara Manual untuk

Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri
dengan Masalah Homologi Sekuens DNA

Sunarno,1 Harly Novriani2

1
Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan, Badan Litbangkes, Jakarta
2
Puslitbang Sumber Daya dan Pelayanan Kesehatan, Badan Litbangkes, Jakarta

Abstrak
Pendahuluan: Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan pemeriksaan polymerase chain reaction
(PCR) adalah ketepatan susunan primer PCR yang digunakan. Beberapa software dapat digunakan untuk
merancang primer PCR secara cepat sesuai dengan kebutuhan.Namun, untuk beberapa kasus seperti adanya
masalah homologi sekuens DNA gen target dapat menjadi kendala tersendiri dalam desain primer. Salah
satu gen yang memiliki masalah homologi sekuens DNA adalah gen dtxatau tox yang merupakan penanda
toksigenisitas bakteri penyebab difteri. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan susunan primer PCR
yang tepat dalam identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri dengan PCR konvensional, termasuk
membedakan strain non-toxigenic tox gene bearing (NTTB) dari strain toksigenik.
Metode: Primer PCR didesain secara manual berdasarkan data sekuens DNA gen dtx dan ‘pseudo-
gene’bakteri penyebab difteri yang terdaftar di GeneBank atau dipubliksasi dalam jurnalilmiah.Sebanyak 26
sekuens gen dtx dan 10 ‘pseudogen’ di-align menggunakan program BioEdit. Penilaian terhadap daerah
yang berpotensi sebagai tempat penempelan primer dilakukan satu per satu. Kandidat primer yang diperoleh
diuji dengan program PerlPrimer untuk memprediksi kendala yang akan muncul.
Hasil: Analisis secara in silicomenunjukkan bahwa ada 3 pasang primer PCR yang dapat digunakan untuk
membedakan strain NTTB dari strain toksigenik,begitu juga strain non-toksigenikdari strain toksigenik
maupun NTTB. Ketiga pasang primer PCR tersebut diprediksi dapat diaplikasikan dalam sebuah reaksi
PCR multipleks. Strain NTTB akan menghasilkan 2 pita penanda, masing-masing 174 bp dan 517 bp atau
539 bp. Strain toksigenik akan menghasilkan 1 pita 174 bp sebagai penanda. Semntara itu, pada strain non-
toksigenik tidak tampak adanya pita 174 bp, 517 bp maupun 539 bp.
Kesimpulan: Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa primer baru untuk PCR konvensional yang
berhasil didesain dalam penelitian ini, secara Bioinformatika dapat digunakan untuk identifikasi toksigenisitas
bakteri penyebab difteri, termasuk membedakan strain NTTB dari strain toksigenik.
Kata Kunci: primer PCR, toksigenisitas, gen tox, difteri

Korespondensi: Sunarno
Email: no_nar@yahoo.com

544 J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016
 Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri

Manually PCR Primer Designto Amplify thedtx Gene of the

Bacteria Causing Diphtheria with DNA Sequences Homology Problem

Sunarno,1 Harly Novriani2

1
The Biomedical and Basic Health Tecnology, Health Research and
Development Centre, Jakarta
2
Resource Center and Balitbangkes Health Services, Jakarta

Abstract
Introduction: PCR primer sequences determine the successfulness of polymerase chain reaction
(PCR). Some software could be used for design of proper PCR primer sequences.Nevertheless, the
PCR primer design occasionally complicated by the sequences homology problem of target gene.
The dtxor tox gene that encoding diphtheria toxin synthesis is an example of thegene with DNA
sequences homology problem. This study targeted to get proper PCR primer for identification of
bacterial toxigenicity by conventional PCR, included non-toxigenic tox gene bearing (NTTB) and
toxigenic strains differentiation.
Methods: The PCR primer designed manually based on the sequences data of dtxgene and
‘pseudogene’of the bacteria causing diphtheria registered in GeneBank or the other scientific
publishing. Twenty six sequences of dtxgene and 10 sequences of ‘pseudogen’ alignedby BioEdit
program. PCR primer candidate tested in silico by PerlPrimer program to predict the
primerapplication onthe PCR processing.
Result: The study showed that 3 pairs of PCR primer could to distinguish NTTB strain from
toxigenic strain as well as non-toxsigenic strain distinguish from toxigenicand NTTB strains. The
3 pairs of PCR primer were predicted could beapplied on the conventional multiplex PCR. NTTB
strain marked by 2 bands (174 bp and 517 bp or 539 bp), whiletoxigenicstrain marked by 1 band
(174 bp). In other hand, non-toxigenicstrain marked by no band on 174 bp, 517 bp, or 539 bp.
Conclusions: The study was success to design 3 pairs of PCR primer for conventional multiplex
PCR application that could be used to identify the toxigenicity (toxigenic, non-toxigenic, and NTTB
differentiation) of bacteria causing diphtheria properly.
Keywords: PCR primer, toxigenicity, tox gene, diphtheria

Pendahuluan terjadinya proses amplifikasi DNA template pada proses PCR.

Sejak dikembangkan oleh Kary Banks Mullis tahun 1985,
Polymerase Chain Reactin (PCR) telah menunjukkan
peranan yang sangat besar dalam perkembanganilmu
pengetahuan, khususnya Biologi Molekular. Saat ini,
pemeriksaan PCR menjadi bagian yang tidak terpisahkan dari
kegiatan rutin di laboratorium pelayanan maupun penelitian
kesehatan. Serangkaian kelebihan yang dimiliki membuatnya
menjadi pilihan utama atau alternatif pemeriksaan untuk
diagnostik penyakit maupun tujuan lainnya. PCR cenderung
banyak dipilih karena relatif lebih mudah dan cepat dengan
sensitifitas dan spesifitaspemeriksaan yang sangat tinggi.1,2
Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan
pemeriksaan PCR adalah ketepatan susunan primer PCR yang
digunakan karena akan menentukan sensitifitas dan
spesifisitas pemeriksaan. Primer PCR atau dikenal sebagai
oligomer merupakan sepasang potongan pendek DNA untai
tunggal (biasanya 18-30 bp), terdiri dari forward primer (F)
dan reverse primer (R)yang digunakan untuk inisiasi
Selain untuk inisiasi, primer PCRjuga digunakan untuk
membatasi proses amplifikasi sehingga bisa ditentukan
seberapa panjang produk PCR (amplikon) yang dihasilkan.
Dengan demikian, setelah dilakukan elektroforesis, hasil
amplifikasi dapat dibaca dengan benar. Untuk dapat mencapai
tujuan tersebut maka sekuens primer PCR harus spesifik dan
terletak pada daerah lestari (tidak ada mutasi) atau conserve
sehingga tidak terjadi mismatch dan unmatch. Hibridisasi
dan amplifikasi harus terjadi pada semua variasi sekuens
DNA gen target dan sebaliknya tidak boleh terjadi hibridisasi
dan amplifikasi pada tempat yang tidak diinginkan (bukan
gen target).3,4
Primer PCR dapat didesain menggunakan bantuan pro-
gram komputer, baik online maupun offline, misalnya Primer
BLAST, IDT, PerlPrimer, Primer3 dan lain sebainya. Primer
PCR juga bisa didesain secara manual dengan tetap mem-
perhatikan beberapa ketentuan yang berlaku. Penggunaan
program komputer dapat mempermudah kita dalam merancang

J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016 545
Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri
primer secara cepat sesuai dengan kebutuhan, misalnya GC
Clamp, Tm, panjang primer, panjang produk dan lain
sebagainya. Akan tetapi, untuk beberapa kasus seperti pada
gen dengan karakteristik khusus, misalnya homologi sekuens
DNA yang sangat tinggi antar atau interspesies dan
variasisekuens yang sangat tinggi intraspesies
(target)menjadi hambatan tersendiri. Dalam hal ini, desain
primer PCR secara manual bisa menjadi pilihan, kendatipada
umumnya tetap membutuhkan bantuan program komputer
untuk analisis lebih lanjut.5,6,7,8
Salah satu gen yang memiliki karakteristik khusus adalah
gen tox/dtx, penyandi sintesis toksin difteri padabakteri
penyebab difteri (potentially toxigenic Corynebacteria),
meliputi C.diphtheriae, C.ulcerans dan C.pseudo-
tuberculosis.Gen dtx dikatakan spesial karena memiliki
sekuens DNA yang sangat bervariasidiantara ketiganya,
meskipun sama-sama mengkode sintesis toksin difteridan
dapat menimbulkan gejala penyakit yang serupa.9,10 Selain
itu, gen dtx memiliki kemiripan sekuens DNA dengan
“pseudogene”(gen dtxpada strain non-toxigenic tox gene
bearing atau NTTB) yang terbukti tidak mampu mengkode
sintesis toksin difteri, sebagaimana dikemukakan oleh Hall,
et.al dan Zakikhany, et al.11,12Dalam hal ini, PCR untuk
pemeriksaan difteri biasanya tetap akan mendeteksi
“pseudogene” tersebut sebagai gen dtx sehingga akan ada
perbedaan hasil antara pemeriksaan PCR yang berbasis
genotip dan metode konvensional yang berbasis fenotip.13
Penelitian ini bertujuan untukmendapatkan susunan
primer PCR yang tepat dalam pemeriksaan toksigenisitas
bakteri penyebab difteri dengan PCR konvensional. Primer
PCR tersebut diharapkan dapat digunakan untuk
membedakan gen dtxatau tox dari “pseudogene”strain
NTTB.Hal ini perlu dilakukan untuk meminimalisasi
perbedaan hasil PCR dengan metode konvensional sebagai
gold standard.
Metode Penelitian
Ada 3 pasang primer PCR (3 forward dan 2 reverse)yang
didesain pada penelitian ini untuk identifikasi toksigenisitas
bakteri penyebab difteri secara detil. Sepasang primer
digunakan untuk deteksi gen dtx atau tox (baik “true”
maupun “pseudogene”)seperti halnya primer PCR yang
sudah digunakan selama ini.13-17 Dua pasang primer yang
lain digunakan untuk membedakan gen dtx dari
“pseudogene”. Primer PCR didesain secara manual
berdasarkan data sekuens DNA gen dtxdan “pseudogene”
C.diphtheriae, C.ulcerans, dan C.pseudotuberculosis yang
terdaftar di GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) dan beberapa
literatur lainnya.11,12Seluruh data yang dibutuhkan diunduh
melalui jaringan internet. Alignment sekueans DNA
dilakukan menggunakan program BioEdit.18 Daerah spesifik
untuk “pseudogene” (beda dengan gen dtx) diamati satu
per satu agar dapat mendesain primer spesifik yang
membedakannya dari gen dtx.
546
Setelah ditemukan lokasi yang dapat digunakan untuk
tempat penempelan primer, dilakukan desain kandidat primer
PCR dengan menentukan panjang sekuens primer, panjang
amplikon dan mengubah salah satu primer dengan sekuens
reverse transcript. Kandidat pasangan primer yang diperoleh
diuji dengan program perlPrimer untuk menghitung besarnya
ikatan primer dimer, adanya run, Tm primer dan lain
sebagainya.19 Hal yang sama dilakukan dalam desain primer
untuk deteksi gen dtx secara umum. Pada akhirnya didapatkan
3 pasang primer PCR (3 forward dan 2 reverse) untuk
menentukan apakah bakteri yang diperiksa bersifat non-
toksigenik (tidak memiliki gen dtxdan tidak menghasilkan
toksin), toksigenik (memiliki gen dtx dan menghasilkan
toksin), atau NTTB (memiliki gen dtx tapi tidak menghasilkan
toksin).
Hasil Penelitian
Sebanyak 26 sekuens gen dtx dan 10 sekuens
“pseudogene” bakteri penyebab difteri yang terdaftar di
GenBank maupun terpublikasi dalam jurnal berhasil
dikumpulkan. Berdasarkan analisis sekuens DNA gen dtx
dan “pseudogene” (data tidak ditampilkan), ada beberapa
mutasi (substitusi dan delesi) basa nukleotida pada
“pseudogene”. Mutasi-mutasi tersebut dapat dimanfaatkan
sebagai referensi untuk mendesain primer PCR yang dapat
membedakan gen dtx dari “pseudogene”dengan cara deteksi
gen dtx tanpa “pseudogene” atau sebaliknya. Ada2 delesi
yang ditemukan pada “pseudogene”, masing-masing basa
ke-25 dan ke-55. Delesi basa ke-25 terlihat pada 4 dari 10
sekuens “pseudogene”,sementara delesi basa ke-55terlihat
pada 6yang lain dari 10 sekuens “pseudogene” yang
dianalisis. Mutasi berupa substitusi terlihat pada basa ke-60
(2 sekuens), ke-432 (1 sekuens), ke-651 (4 sekuens), ke-937 (4
sekuens), dan basa ke-1206 (4 sekuens).
Diantara tempat yang sudah didapatkan tersebut, hanya
delesi basa ke-25 dan ke-55 yang paling memungkinkan untuk
membedakan seluruh “pseudogene”dari gen dtx. Berdasarkan
kenyataan ini, basa ke-25 dan ke-55 dipilih untuk dijadikan
target penempelan ujung 3’ primer PCR. Permasalahan
selanjutnya muncul karena jarak keduanya sangat dekat
sehingga sulit untuk mendapatkan sepasang primer (forward
dan reverse) dari kedua daerah tersebut. Selain itu, di sekitar
lokasi basa tersebut tidak didapatkan daerah yang 100%
lestari (conserve).
Upaya yang paling memungkinkan untuk mendapatkan
pasangan primer PCR adalah menggunakan skema 2 forward
primer dan 1 reverse primer dengan panjang amplikon sedikit
berbeda. Perbedaan panjang amplikon sekitar 30 bp dari 2
forward yang berbeda tersebut “disamarkan” dengan
mendesain reverse primer yang terletak cukup jauh sehingga
menghasilkan amplikon >500 bp. Perbedaan panjang amplikon
30 bp akan samar pada visualisasi hasil PCR di gel
agarose.Dalam hal ini, kelestarian sekuens tidak dijadikan
prioritas pertama, dengan catatan masih bisa ditoleransi.
J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016
 Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri

Kandidat pasang primer PCR yang diperoleh adalah sebagai

berikut:

F1pseudo: 5’-GCAGAAA(AG)CTGTTTGCGTCAT-3’
F2pseudo: 5’- GCGCTACTG(GT)GGATAGGGC-3’
Rpseudo : 5’-CTTAACGCTTTCGCCTGTTCC-3’

Pada sekuens gen dtx, ketiga primer tersebut barada

pada posisi basa ke-5 sampai dengan basa ke-25 untuk
F1pseudo, basa ke-37 sampai dengan basa ke-55 untuk
F2pseudo serta basa ke-554 sampai dengan basa ke-534
untuk Rpseudo. Panjang amplikon yang terbentuk adalah
517 bp dan 539 bp.
Dua pasang kandidat primer yang terdiri dari 3 buah
tersebut diuji menggunakan software PerlPrimeruntuk
memprediksi masalah yang akan timbul jika diaplikasikan
pada pemeriksaan. Ringkasan hasil analisis primer
“pseudogene” dapat dilihat pada Tabel 1yang menunjukkan
bahwa 2 pasangan primer ‘pseudogene’ cukup baik sebagai
kandidat primer PCR, meskipun salah satu GC content primer
63%(sebaiknya 40 % - 60 %). GC clampterdapatpada 5 basa
ujung 3’, panjang primer antara 18-30 bp, Tm antara 55 oC –
65 oC, panjang produk PCR 517 bp dan 539 bp yang
akan‘samar’ bila diseparasi dengan gel elektroforesis. Selain
itu, ikatan primer-dimer tertinggi adalah – 5,27 kcal/mol. Ikatan
tersebut tidak termasuk jenis 3’ extensible sehingga
diharapkan tidak mempengaruhi proses amplifikasi. Selain
itu,beberapa literatur juga menyebutkan bahwa ikatan atau
delta G sampai -7 kcal/mol, bahkan sampai -9 kcal/mol masih
bisa dipakai untuk menjalankan sebuah reaksi PCR.20,21

Tabel 1. Ringkasan Hasil Analisis Primer “pseudogene”

dengan Pearl Primer

Forward 1 : 21 basa GC 47 % Tm 62,83 oC

Forward 2 : 19 basa GC 63 % Tm 62,99 oC
Reverse : 21 basa GC 52% Tm 62,61 oC
Panjang Produk : 539 bp dan 517 bp
Ikatan Primer dimer : Extensible primer-dimers tertinggi
-4.30 kcal/mol
Non-extensible primer-dimers tertinggi
- 5.27 kcal/mol
Run> 4 : Tidak ditemukan Gambar 1. Analisis Pasang Primer ‘dtx’dengan PerlPrimer
Repeats> 3 : Tidak ditemukan

Beberapa daerah lestari yang cukup panjang untuk tempat

Setelah primer untuk membedakan gen tox dan
‘pseudogene’ diperoleh, desain primer PCR dilanjutkan untuk
deteksi gen dtx secara keseluruhan. Dalam hal ini termasuk
‘pseudogene’yang akan dideteksi karena titik perbedaan
kedua gen telah digunakan pada desain primer sebelumnya.
Desain primer yang kedua ini bertujuan untuk membedakan
antara strain non-toksigenik dengan strain toksigenik
maupun NTTB. Alignment sekuens DNA gen dtx dan
‘pseudogene’sebagaimana terlihat pada Gambar 1
menunjukkan bahwa sangat sulit mendapatkan daerah yang
100% lestari diantara 3 spesies bakteri penyebab difteri.
penempelan primer, seperti basa ke-757 sampai dengan ke-
784 dan basa ke-1141 sampai ke-1169 tidak memenuhi syarat
sebagai tempat penempelan kandidat primer PCR yang baik.
Hal ini dikarenakan pada daerah tersebut terdapat run dan
GC content sangat rendah.
Dua daerah yang pada akhirnya dipilih sebagai tempat
penempelan kandidat primer adalah basa ke-1263 sampai
dengan ke-1287 untuk forward primer dan basa ke-1436
sampai dengan basa ke-1410 untuk reverse primerdengan
panjang amplikon 174 bp. Pada daerah tersebut terdapat
mutasi (substitusi) basa, namun masih dapat ditoleransi.

J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016 547
Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri
Sekuens kandidat primer untuk deteksi gen dtx dan
‘pseudogene’ secara keseluruhan adalah sebagai berikut :
Fdtx : 5’-CAGTTGGAACACTGTTGAAGATTCG-3’
Rdtx : 5’-CCATTTACGGAAATATGAGTCTTGGAC-3’
Gambaran analisis pasang primer ‘dtx’dengan software
PerlPrimer dapat dilihat pada Gambar 1. Pada gambar 1
menunjukkan bahwa kedua primer tersebut cukup baik untuk
diaplikasikan dalam pemeriksaan. Hal ini terlihat dari Tm
primer yang berdekatan, panjang primer 18-30 basa, dan GC
content 40-60 %. Risiko ikatan primer-dimer juga tidak ada
yang lebih dari negatif dari -7 kcal/mol dan tidak ditemukan
adanya run serta repeats.
Tiga pasang (5 buah) primer PCR yang berhasil didesain
dapat diuji coba dalam aplikasi PCR konvensional untuk
identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri dengan
teknik PCR multipleks.Gambaran interpretasi hasil
pemeriksaan PCR multipleks dapat dilihat pada Gambar 2.
1 kbp
900 bp
800 bp
700 bp
539 bp
600 bp
517 bp
500 bp
400 bp
300 bp
200 bp
M 1 2 3 4
Gambar 2. Interpretasi Hasil Pemeriksaan PCR Multipleks:
Marker 100 bp (M), Strain NTTB (1), Strain NTTB
(2), Strain Toksigenik (3), dan Strain Non-toksi-
genik (4).
Gambar 2 menunjukkan adanya 4 interpretasi hasil dari
aplikasi 3 pasang kandidat primer yang berhasil didesain.
Pada strain NTTB akan terdeteksi 2 target primer PCR
(pseudogene) di lokasi yang berbeda. Pada strain toksigenik
akan terdeteksi 1 target primer PCR (gen dtx). Pada strain
non-toksigenik tidak terdeteksi gen target. Dengan demikian
dapat dibedakan ketiga jenis toksigenisitas bakteri tersebut
dengan pemeriksaan PCR.
548
Pembahasan
Gen dtx merupakan penyandi produksi toksin difteri
pada 3 spesies bakteri penyebab difteri yang dikenal dengan
potentially toxigenic Corynebacteria. Gen ini dibawa oleh
Corynephage yang masuk (terinsersi) ke dalam materi genetik
bakteri. Pada Corynephage, tempat khusus untuk
bergabungnya meteri genetik ini disebut dengan attP site,
sedangkan pada bakteri disebut attB site. Dalam 1 strain
bakteri dapat diinsersi oleh lebih dari 1 faga dan tidak semua
faga tersebut membawa gen tox. Faga yang membawa gen
tox disebut phage tox+ dan yang tidak membawa gen tox
disebut phage tox-.22,23 Dalam menjalankan perannya, gen
dtx diregulasi oleh gen lain dalam kromosom bakteri yang
dikenal dengan gen dtxR dengan Fe sebagai ko-faktor.Fe
akan berikatan dengan protein dtxR yang akan menghambat
sintesis toksin pada proses transkripsi. Meskipun demikian,
kadar Fe bukanlah satu-satunya faktor yang mempengaruhi
produksi toksin difteri.Faktor lain, diantaranya kultur berulang
di laboratorium, mutasi gen dan beberapa hal yang belum
jelas mekanismenya terbukti dapat mempengaruhi produksi
toksin difteri.24-26
Penemuan ‘pseudogene’pada 4 isolat C.diphtheriae di
Jepang oleh Hall, et.al. menjadi menarik. Hal ini karena
keempatnya memiliki sekuens DNA yang sangat mirip dengan
gen dtx, namunbersifat nontoksigenik.11Sebaliknya, meskipun
beberapa sekuens gen dtx C.diphtheriae, C.ulcerans dan
C.pseudotuberculosis bervariasi, sebagaimana terlihat pada
Gambar 1, ketiganya mampu memproduksi toksin difteri
(toksigenik).27-29 Oleh karena itu, desain primer PCR untuk
amplifikasi seluruh variasi gen dtx dari ke-3 spesies poten-
tially toxigenic Corynebacteriatersebut tanpa amplifikasi
‘pseudogene’ cukup rumit. Selain variasi antar ke-3 spesies
yang cukup tinggi, variasi antar strain dalam masing-masing
spesies juga harus diperhatikan.
Beberapa persyaratan yang perlu diperhatikan dalam
desain primer PCR antara lain GC content 40 %-60%, Tm 55-
65oC, GC Clamp pada 5 basa ujung 3’, panjang primer 18 – 30
bp, tidak ada hairpindan pengulangan (run dan repeat) lebih
dari 4 basa.3,4 Khusus untuk PCR multipleks, panjang masing-
masing produk PCR harus dibuat sedemikian rupa sehingga
bisa dibedakan satu sama lain. Ada beberapa masalah yang
harus diperhatikan dengan kandidat primer ’pseudogene’
yang diperoleh bila menggunakan sekuens asli yang sama
dengan sekuens “pseudogene”. Pada primer ’F1pseudo’
terdapat daerah palindromik yang berrisiko membentuk hair-
pin dan dapat mengganggu proses hibridisasi.
Selain itu pada primer tersebut terdapat run (AAAA)
yang sebaiknya dihindari pada desain primer PCR. Kedua
masalah tersebut dapat diatasi dengan melakukan modifikasi
sekuens dengan mengganti basa A menjadi basa G seperti
terlihat dalam kurung. Pada primer ’F2pseudo’ juga terdapat
run (GGGG) dan GC content sangat tinggi. Hal ini dapat
menyebabkan terjadinya penempelan primer tidak pada
J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016
 Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri
tempatnya (mismatch). Oleh karena itu salah satu basa G
dimodifikasi menjadi basa T seperti terlihat dalam kurung.
Pada sekuens DNA yang menjadi tempat penempelan ketiga
pasang primer didapatkan beberapa mutasi basa, dengan kata
lain bahwa daerah tersebut kurang conserve. Namun demikian,
mutasi tersebut masih bisa ditoleransi karena umumnya hanya
1 basa dan tidak terletak pada ujung 3’ primer. Mutasi pada
ujung 3’ primer akan menyebabkan kegagalan amplifikasi
sekuens karena tidak terjadi elongasi atau pemanjangan.30
Kesimpulan dan Saran
Penelitian ini berhasil mendesain primer baru untuk PCR
konvensional yang secara Bioinformatika dapat digunakan
untuk identifikasi toksigenisitas bakteri penyebab difteri,
termasuk membedakan strain NTTB dari strain toksigenik.Uji
yang dilakukan baru sebatas perhitungan dengan software
Bioinformatika (in silico)sehingga masih membutuhkan uji
lebih lanjut untuk aplikasi langsung di mesin PCR. Aplikasi
PCR dengan primer baru membutuhkan optimasi prosedur
yang disesuaikan dengan reagen maupun mesin yang
digunakan.
Ucapan Terima Kasih
Ungkapan terima kasih kami sampaikan kepada seluruh
pihak yang telah berperan dalam penelitian dan publikasi ini.
Daftar Pustaka
1. Budiarto BR. Polymerase Chain Reaction (PCR): Perkembangan
dan perannya dalam diagnostik kesehatan. BioTrends. 2015;
6(2):29-38.
2. Sing A, Berger A, Schneider-Brachert W, Holzmann T, Reischl U.
Rapid detection and molecular differentiation of toxigenic
Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans
Strains by LightCycler PCR. J Clin Microbiol. 2011;49(7):2485-
2489.
3. Yuryev A. Editor. Methods in Molecular Biology: PCR Primer
Design. 2007; New Jersey: Hummana Press.
4. Garibyan L & Avashia N. Research techniques made simple: Poly-
merase Chain Reaction (PCR). J Invest Dermatol. 2013;133(3):
e6.doi:10.1038/jid.2013.1
5. Ye J, Coulouris G, Zaretskaya I, Cutcutache I, Rozen S and Mad-
den TL. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers
for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics 2012,
13:134
6. Patel NK & Prakash N. Principle and tools for primer design.
Atmiya Spandan. 2013;1(1):79-95
7. Nakamura S, Masuda T, Mochizuki A, Konishi K, Tokumaru S,
Ueno K and Yamaguchi T. Primer Design for Identifying eco-
nomically Important Liriomyza Spesies (Deptera: Agromyzidae)
by Multiplex PCR. Mol. Eco. Resources. 2013;13:96-102.
8. Srivastava GP, Hanumappa M, Kushwaha G, Nguyen HT and
Dong X. Homolog-specific PCR Primer Design for Profiling
Splice variants. Nucleic Acid Research. 2011;1-11.
9. Sekizuka T, Yamamoto A, Komiya T, Kenri T, Takeuchi F,
Shibayama K, Takahashi M, Kuroda M, and Iwaki M.Coryne-
bacterium ulcerans 0102 carries the gene encoding diphtheria
toxin on a prophage different from the C. diphtheriae NCTC
13129 prophage. BMC Microbiology. 2012;12:72
10. Komiya T, Seto Y, De Zoysa A, Iwaki M, Hatanaka A, Tsunoda
A, Arakawa Y, Kozaki S, and Takahashi M. Two Japanese Coryne-
J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016
bacterium ulcerans isolatesfrom the same hospital: ribotype,
toxigenicity and serum antitoxin totre. JMM. 2010;59:1497-
1504.
11. Hall AJ, Cassiday PK, Bernard KA, Bolt F, Steigerwalt AG, Bixler
D, Pawloski LC, et.al. Novel Corynebacterium diphtheriae in
Domestic Cats. Emerg Infect Dis. 2010; 16(4):688-691.
12. Zakikhany K, Neal S, and Efstratiou. Emergence and molecular
characterization of non-toxigenic tox gene-bearing Corynebac-
terium diphtheriae biovar mitis in the United Kingdom, 2003-
2012. Euro Surveill. 2014;19(22):1-8.
13. Efstratiou A, Engler KH, Dawes CS, and Sesardic D. Comparison
of Phenotypic and Genotypic Methods for Detection of Diph-
theria Toxin among Isolates of Pathogenic Corynebacteria. J.Clin.
Microbiol.1998;36(11):3173-3177.
14. Torres LdeF. Ribeiro D, Hirata Jr R, Pacheco LG, Souza MC, dos
Santos LS, dos Santos LS, Salah M, Costa MM, Ribeiro MG, Selim
SA, Azevedo VA, Mattos-Guaraldi AL. Multiplex polymerase
chain reaction to identify and determine the toxygenicity of
Corynebacterium spp with zoonotic potenticl and an overview
of human and animal infections. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2013;108(3):272-279.
15. Sunarno, Sariadji K, Wibowo HA. Potensi Gen dtx dan dtxR
Sebagai Marker untuk Deteksi dan Pemeriksaan Toksigenisitas
Corynebacterium diphtheriae. Bul.Penelit. Kesehat. 2013;41(1):1-
10.
16. Pimenta FP, Hirata R, Rosa ACP, Milagres LG and Mattos-Guaraldi
AL. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Coryne-
bacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic
and toxigenic isolates. JMM.2008:1438-1439.
17. Schuhegger R, Lindermayer M, and Kugler R. Detection of toxi-
genic Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans
strains by a Novel Real-Time PCR.J Clin Microbiol.
2008;46(8):2822-2823.
18. Hall T. BioEdit: An important software for molecular biology.
GERF Bulletin of Biosciences. 2011;2(1):60-61.
19. Marshall OJ. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer de-
sign for standard, bisulphate and real-time PCR. Bioinformatics
Appl Note. 2004;20(15):2471-1472.
20. Abu-Almaali HM, Alkhatabi HA, Nasr-Allah HA, and Al-Khafaji
ZM. Duplex PCR primer for detection of Helicobacter pylori
DNA directly from gastric biopsy samples. Kerbala J Phar Sci
2012;3:201-211.
21. Dwivedi B, Schmieder R, Goldsmith DB, Edwars RA, and Breitbart
M. PhiSiGns: an online tool to identify signature genes in phages
and design PCR primers for examining phage diversity. BMC
Bioinformatic. 2012;13:37.
22. Sangal V & Hoskisson PA. Corynephages: Infections of the In-
fector. In: Burkovski A, Editor. Corynebacterium diphtheriae
and Related Toxigenic Species. 2014. Springer. http://libgen.org/
(Accessed 27 February 2015).
23. Seto Y, Komiya T, Iwaki M, Kohda T, Mukamoto M, Takahashi
M and Kozaki S. Properties of Corynephage Attachment site and
molecular epidemiology of Corynebacterium ulcerans isolated
from humans and animals in Japan. Jpn. J. Infect. Dis.
2008;61:116-122.
24. Mercant AT & Spatafora GA. A role for the DtxR family of
metalloregulators in gram-positive pathogenesis. Molecular Oral
Microbiology. 2014;29:1-10.
25. Tao D’Aquino JA, Tetenbaum-Novatt J, White A, Berkovitch,
and Ringe D. Mechanism of metal ion activation of the diphthe-
ria toxin repressor dtxR. PNAS. 2005;102(51):18408-18413.
26. Holmes RK. Biology and Molecular Epidemiology of Diphtheria
Toxin and the tox Gene. JID. 2000;181(Suppl 1)1:S156–S167.
27. Wagner KS, White JM, Lucenko I, Mercer D, Crowcroft NS,
Neal S, and Efstratiou A. Diphtheria in the Postepidemic Period,
Europe, 2000-2009. EID. 2012;18(2):217-225.
28. Dias AASO, Santos LS, Sabbadini PS, Santos CS, Silva FCJr,
549
Desain Primer PCR Secara Manual untuk Amplifikasi Gen dtx Bakteri Penyebab Difteri

Napoleao F, Nagao PE, Villas-Boas MHS, Hirata RJr, Guaraldi
ALM. Corynebacterium ulcerans diphtheria: an emerging zoonosis
in Brazil andworldwide. Rev Saude Publica. 2011;45(6):1-16.
29. Selim SA, Mohamed FH, Hessain AM, and Moussa IM. Immuno-
logical characterization of diphtheria toxin recovered from
Corynebacterium pseudotuberculosis. Saudi J Biol Sci.
2016;23(2):282-287.
30. Lorenz TC. Polymerase Chain Reaction: Basic protocol plus
troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp.
2012;e3998,doi:10.3791/3998.

550 J Indon Med Assoc, Volum: 66, Nomor: 12, Desember 2016