Penentuan Kadar Tablet Asetosal dengan Menggunakan HPLC

Anniesah Rahayu Sakinah

260110150138

Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor,

Sumedang

Abstrak

Uji optimasi dilakukan dengan menggunakan fase gerak metanol dan air yang
dibuat dalam 9 kondisi berbeda. Fase gerak metanol dan air dengan konsentrasi 10
ppm dan perbandingan 30 : 70, laju alir 0,75 ml/menit, pH 2,98 dipilih karena
memiliki syarat sebagai kesesuaian sistem yang meliputi resolusi, theoritical plates,
dan presisi atau %RDS untuk pengukuran asetosal. Kurva kalibrasi dengan
menggunakan larutan baku asetosal dengan konsentrasi (10, 20, 40, 60, 80) ppm.
Penetapan kadar tablet pada HPLC dengan konsentrasi 40 ppm menggunakan fase
gerak yang dipilih. Didapatkan hasil kadar asetosal sebesar 107,066%. Hasil ini
memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia bahwa kadar asetosal dalam tablet
yaitu tidak kurang dari 90% dan tidak lebih dari 110%.

Kata kunci : asetosal, HPLC, fase gerak, kadar, optimasi.

Asetosal Assay using HPLC Instruments

Abstract

The optimization have done by using methanol and water as mobile phase that made
in 9 different condition. The mobile phase of methanoland water with a
concentration of 10 ppm and a ratio of 30 : 70, flow rate of 0,75 ml/min, pH 2,98
was chosen because it has a siutability system requirements which include the
resolution, theoritical plates, and precision or %RSD measurefor asetosal. The
calibration curves using standard solution with a concentration of aspirin (10, 0, 40,
60, 80) ppm. HPLC assay on a tablet with a concentration of 40 ppm using the
selected mobile phase. The result of asetosal level are 107,066%. The results is
suitable with indonesian pharmacopeia that the level of asetosal in tablet are not
less than 90% and not more than 110%.

Keyword: asetosal, HPLC, mobile phase, level, optimization.

Pendahuluan sekaligus pengukuran (Ree and Stoa,

2011). Kromatografi merupakan
Asetosal atau aspirin memiliki
teknik yang mana solut atau zat – zat
khasiat sebagai analgesik, antipiretik,
terlarut terpisah oleh perbedaan
dan antiinflamasi pada penggunaan
kecepatan elusi, dikarenakan solut –
dosis besar (Annuryanti, et al, 2013).
solut ini melewati suatu kolom
Khsiat lain yang dimilikiasetosal pada
kromatografi (Gandjar and Rohman,
penggunaan dosis kecil adalah
2007).
sebagai anti platelet yang dapat
mengurangi kemungkinan terjadinya Sebelum melakukan analisis
infark miokard pada orang dengan dengan instrumen KCKT, perlu
resiko tinggi stroke atau ischemia dilakukan tahapan optimasi kondisi
cerebral, sehingga asetosal diproduksi HPLC untuk sampel asetosal, uji
dengan dosis sediaan 80 dan 160 kesesuaian sistem KCKT, dan
mh/tablet dengan aturan pakai 1 validasi metode analisis. Optimalisasi
tablet/hari (Sweetman, 2002). berhubungan dngan penentuan
kondisi yang memberikan
Tujuan dari praktikum ini
kemungkinan respons terbaik
adalah untuk mengetahui kondisi
(Rohayati, et al, 2015). Dalam
optimumdan parameter kesesuaian
validasi metode analisis ada beberapa
dalam aplikasi instrumen HPLC dan
parameter yang harus diperhatikan,
menentukan kadar dari sampel tablet
yaitu kecermatan, kesaksamaan,
asetosal dengan menggunakan
selektivitas, liniearitas, ketangguhan
metode HPLC.
(ruggedness), kekuatan (robustness),
HPLC memiliki prinsip batas deteksi dan batas kuantitasi
kromatografi, yang didalamnya (Harmita, 2004).
terdapat proses pemisahan dan
 Prinsip percobaan kali ini
adalah adsorpsi. Adsorpsi merupakan
peristiwa akumulasi substansi
Metode
Alat yang digunakan dalam
percobaan ialah perangkat HPLC, pH
meter, beaker gelas, gelas ukur, vial,
kertas saring dan pipet volume.
Sementara bahan yang digunakan
dalam percobaan meliputi aquadest,
asam asetat glasial P, larutan baku
asetosal, metanol serta tablet asetosal
sebagai sampel.
Prosedur pembuatan Fase
Gerak, pertama campurkan 30 bagian
metanol dengan 70 bagian air. pH fase
gerak disesuaikan dengan terlebih
dahulu membuat pH air menjadi 2.98
menggunakan asam asetat glasial.
Asam asetat glasial ditambahkan ke
sebagian besar volume air (56
bagian) hingga pH menjadi 2.98 lalu
ditambahkan air hingga volume
menjadi 70 bagian (Waliszewski, et
al., 2007).
Pembuatan Larutan Pengencer,
gunakan larutan pengencer berupa
metanol (Bhusari & Dhaneshwar,
2012). Preparasi Baku Asetosal,
larutkan asetosal dengan larutan
adsorbat pada permukaan adsorben
(Oscik, 1982).
pengencer hingga didapatkan
konsentrasi 500 ppm (Depkes RI,
1995). Optimasi Variasi
Perbandingan Metanol:Air, larutan
asetosal 20 ppm diinjeksikan ke
dalam sistem dengan menggunakan
fase gerak metanol:air dalam
beberapa perbandingan (100:0; 90:10;
80:20; 70:30; 60:40; 50:50; 40:60;
30:70; 20:80; 10:90; dan 0:100)
(Bhusari & Dhaneshwar, 2012).
Untuk optimasi variasi laju alir,
Pengujian HPLC dilakukan berulang
dengan membuat variasi laju alir
yakni 0.75 ml/min; 0.80 ml/min; 0.85
ml/min; 0.90 ml/min; 0.95 ml/min;
dan 1.00 ml/min (Sivakumar, et al.,
2007).
Uji Kesesuaian Sistem, sistem
yang telah dioptimasi diuji
kesesuaiannya dengan melakukan 6
kali penginjeksian larutan baku. Hasil
AUC tiap penginjeksian dicatat lalu
dihitung standar deviasinya (Depkes
RI, 1995). Prosedur pembuatan kurva
baku, pertama dilakukan pengenceran
terhadap larutan baku 100 ppm
menjadi 80 ppm, 60 ppm, 40 ppm dan
20 ppm. Kemudian dilakukan
optimasi sistem HPLC dengan
mengatur laju alir sebesar 1 ml/menit,
fase gerak metanol:air (62:38) serta
pada panjang gelombang 278 nm dan
227 nm. Kemudian, membuat kurva
baku respon instrumen atau respon
puncak (luas puncak atau tinggi
puncak) terhadap variasi konsentrasi
standar yang akan menghasilkan
persamaan garis linier.
Pada preparasi sampe, tablet asetosal
sebanyak 20 tablet ditimbang lalu
diserbukkan. Serbuk yang terbentuk
ditimbang sebanyak 100 mg dan
melarutkannya dalam sebagian
metanol (±13 ml) sebagai larutan
pengencer. Larutan tersebut dikocok
kuat selama 10 menit lalu disonikasi
dan ad hingga 20 ml. Kemudian,
dilakukan pengenceran hingg 60 ppm
menggunakan pelarut metanol.
Untuk prosedur penetapan
kadar, HPLC dalam keadaan
optimum dengan laju alir 1 ml/menit,
fase gerak metanol:air (62:38) dan
panjang gelombang 278nm serta 227
nm lalu menginjeksikan sampel
kedalam HPLC dan diamati respon
puncak utama yang akan digunakan
dalam penatapan kadar asetosal, lalu
menghitung kadar asetosal dalam
tablet.
Hasil

Tabel 1. Optimasi Sistem dengan Variasi Perbandingan metanol:air dan laju alir

Sistem Rs k N %RSD
Fase Gerak 1.071 0.384 N1 = 199.970 115.224%
Metanol:Air N2 = 129.31
Fase
(70:30); Gerak
Laju 1.5533 0.315 378.6916
Navg = 164.64 -
Metanol:Air
Alir 0.75ml/min;
(70:30); Laju
Panjang Gerak
Fase Rs1 = 0.66 k1 = 0.40 N1 = 84681 15%
Alir 0.75ml/min;
Gelombang
Metanol:Air 227 Rs2 = 1.33 k2 = 0.24 N2 = 126176
Panjang
nm.
Fase
(70:30); Gerak
Laju Rs = 0,0232= kk1avg
Rs1avg = 0.22
= 0.32 N = 84681
N1avg = 105428.5 0.7185%
Gelombang
Metanol:Air 278
Alir 1ml/min; Rs 2 = 0,0123 k2 = 0.24
0.995 N2 = 126176
nm.
Fase
(70:30);
Panjang Gerak
Laju -Rsavg = kk1avg= 0.413 N1avg
= 0.23 N = 157.1678
= 105428.5 -
Metanol:Air
Alir 1ml/min;
Gelombang 227 0.01775 k2 = 0.423 N2 = 148.76
Fase
(67:33);
Panjang
nm. Gerak
Laju - kk1avg= 0.4083 N1avg= =148.76
= 0.418 N 152.9639 -
Metanol:Air
Alir 0.75ml/min;
Gelombang 278 k2 = 0.437 N2 = 147.36
Fase
(67:33);
Panjang
nm. Gerak
Laju - kk1avg= 0.43 = N
N1avg= =148.13
147.91 -
Metanol:Air
Alir 0.75ml/min;
Gelombang 227 k0.4226
2 = 0.45 N2 = 150.2
(67:33);
Panjang
nm. Laju k3 = 0.46 N3 = 181.82
Fase Gerak - k1 = 0.45 N1 = 116.064 -
Alir 1ml/min;
Gelombang 278 kavg = 0.447 Navg = 160.05
Metanol:Air k2 = 0.344 N2 = 185.036
Panjang
nm.
(67:33); Laju k3 = 0.44 N3 = 157.97
Gelombang 227
Alir 1ml/min;
Fase Gerak 1.04 kavg
0.473 = 79,67
Navg = 153.23 -
nm.
Panjang
Metanol:Air 0.4113
Gelombang
(65:35);
Fase 278
LajuGerak
Alir 1.25 1.552 203,905 0,100%
nm.
0.75ml/min;
Metanol:Air
Panjang Laju Alir
(65:35);
Gelombang 227
0.75ml/min;
nm.
Panjang
Gelombang 278
nm.
Fase Gerak 1.178 0.4967 106,5 -
Metanol:Air
(65:35);
Fase Laju
Gerak 1.281 0.499 206,63 0,100%
Alir 1ml/min;
Metanol:Air
Panjang
(65:35);
Fase Laju
Gerak R1= 2,79 K1 =0,88 N1 = 218,44 % SD Tr1
Gelombang
Alir 227
1ml/min;
Metanol:Air (62:38); R2= 1,407 K2 = 0.856 N2 = 24, 6333 = 43,2 %
nm.
Panjang
Laju Alir 0,75 R3 = 1,518 K3 = 0.889 N3 = 65, 110 % SD Tr2
Gelombang
ml/min; 278
Panjang ravg= 1,905 K rat =0.875 Navg = 102.7277 = 44,91 %
nm.
Gelombang 227nm. % SD Tr3
= 42,97 %

% SD
AUC
= 120,39
Grafik 1 Grafik 2
% SD
1. Jumlah Lempeng Total
AUC
𝑡𝑅 2 𝑡𝑅 2
𝑁 = 16 × ( ) 𝑁 = 16 × ( ) = 105,6 %
𝑊 𝑊
119,18 2 116,7 2
𝑁 = 16 × ( ) 𝑁 = 16 × ( )
33,740 41,050
𝑁 = 199,970 𝑁 = 129,31
2. Faktor Kapasitas
- 𝑡1−𝑡0
K’ = 𝑡0

116,7−84,3
K’ = 84,3

K’ = 0,384

3. Resolusi
2 𝑥 (𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1 )
Rs = (𝑊1 +𝑊2 )
 2 𝑥 (116,7 – 84,43)
Rs = (41,050+19,161)

Rs = 1,071
4. %RSD
1⁄
100 ∑𝑛
𝑖 =1(𝑥1 −𝑥̅ )
2
SR(%) = [ ]
𝑥 𝑛−1
279998+2743144
𝑥̅ = 2

𝑥̅ = 1511571

1⁄
100 ∑𝑛
𝑖 =1(𝑥1 −𝑥̅ )
2
SR(%) = [ ]
𝑥 𝑛−1
100
% = 1511571 1741707,2396525

% = 115,24%

(𝑥1 − 𝑥̅ )2 = (279998 − 1511571)2

(𝑥1 − 𝑥̅ )2 = 1516772054329

(𝑥2 − 𝑥̅ )2 = (2743144 − 1511571)2

(𝑥2 − 𝑥̅ )2 = 1516772054329

Grafik Rs K’ N
I 1,071 - 199,970
II - 0,384 129,31

Tabel 2. Pembuatan Kurva Baku

No Perlakuan Hasil
1 Larutan stok 200 ppm dipipet Larutan asetosal 80 ppm
sebanyak 4 ml lalu ad metanol 10 ml
 2 Larutan stok 200 ppm dipipet Larutan asetosal 60 ppm
sebanyak 8 ml lalu ad metanol 10 ml
3 Larutan stok 200 ppm dipipet Larutan asetosal 40 ppm
sebanyak 2 ml lalu ad metanol 10 ml
4 Larutan stok 200 ppm dipipet Larutan asetosal 20 ppm
sebanyak 1 ml lalu ad metanol 10 ml
5 Menginjeksikan larutan stok ke dalam Didapatkan respon puncak utama
sistem HPLC dengan laju alir
1ml/menit, fase gerak metanol:air
(62:38) dan panjang gelombang 278
nm serta 227 nm
6 Dibuat kurva baku respon puncak atau Pada 278 nm
respon instrumen terhadap variasi R2=0.9989
konsentrasi y= 2745.1 x + 12305
Pada 227 nm
R2=0.9855
y= 37852 x + 273492

Pengenceran larutan baku

a. 80 ppm, 10 ml c. 60 ppm, 10 ml
V1 . N1 = V2 . N2 V1 . N1 = V2 . N2
10 . 80 = X . 200 10 . 60 = X . 200
X = 4 ml X = 3 ml

b. 40 ppm, 10 ml d. 20 ppm, 10 ml
V1 . N1 = V2 . N2 V1 . N1 = V2 . N2
10 . 40 = X . 200 10 . 20 = X . 200
X = 2 ml X = 1 ml
Kromatogram kurva baku :

Kurva baku :

AUC
C AUC 1 AUC 2
Rata"
20 64368 69666 67017
40 126332 121729 124030.5
60 186838 160643 173740.5
80 225350 241560 233455
 278 nm
90
80 y = 0,0004x - 4,4217
70 R² = 0,9989
60
50
40
30
20
10
0
0 50000 100000 150000 200000 250000

Tabel 3. Preparasi Sampel

No Perlakuan Hasil
1 20 tablet asetosal (sampel) ditimbang Berat rata rata tablet = 0,2686
gram / tablet
2 Tablet digerus hingga halus dan 100 mg serbuk tablet asetosal
dtimbang 100 mg
3 Serbuk dilarutkan dalam 20 ml Larutan asetosal sebanyak 20ml
metanol (serbuk dilarutkan dalam (500 ppm)
labu ukur 20 ml yang telah terisi
sebagian metanol, masukkan serbuk
dan ad metanol hingga tanda batas)
4 Dilakukan pengenceran hingga Larutan uji asetosal 60 ppm
konsentrasi sampel menjadi 60 ppm sebagai sampel (duplo)

Tabel 4. Penetapan kadar

No Perlakuan Hasil
1 Mengoptimasi sistem HPLC dengan Sistem HPLC keadaan optimum
fase gerak metanol:air (62:38), laju
alir 1ml/menit dan panjang
gelombang 278 nm
2 Menginjeksi baku dan sampel secara Sampel telah diinjeksikan pada
terpisah ke dalam kromatogram HPLC
sebanyak 1 µL
3 Megukur respon puncak utama Didapatkan AUC sampel
4 Menghitung kadar asetosal Kadar asetosal 107,335%

AUC Sampel (1) = 86902 X = 23,97 µg/ml

AUC Sampel (2) = 69308
5000 𝑝𝑝𝑚 𝐶 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑜𝑠𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
Rata-rata = 78105 =
60 𝑝𝑝𝑚 23,97

Persamaan
= 1997,5 ppm

Y = 2745,1 X +
5000 ppm → terdapat 100
12305
mg sampel
78105 = 2745,1 X +
1997,5 ppm → x mg
12305
asetosal dalam sampel
2745,1 X = 65800
 𝑥= X =
100 𝑥 1997,5 39,95 𝑥 268,675
= 39,95 𝑚𝑔 =
5000 100

asetosal dalam sampel 107, 335 𝑚𝑔

Berat 20 tablet = 5,3735 Kadar asetosal =

gram → 1 Tab = 0,268 gr 107,335 𝑚𝑔
𝑥 100%
100 𝑚𝑔
Asetosal dalam tablet =
=
100 𝑚𝑔 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
= 107,335%
268,675 𝑚𝑔
39,95 𝑚𝑔 𝑎𝑠𝑒𝑡𝑜𝑠𝑎𝑙
𝑥

Pembahasan N akan maksimal bila H minimal,

ukuran partikel sekecil mungkin,
Sebelum melakukan
flowrate diperkecil, menipiskan
penetapan kadar sampel tablet
ketebalan fase diam, dan menhurangi
asetosal dilakukan terlebih dahulu
viskositas misalnya dengan
optimasi. Optimasi adalah untuk
penambahan senyawa organik. Nilai
merancang metode HPLC yang akan
N yang bagus adalah >2000.
memungkinkan untuk melakukan
pemisahan sampai baseline dengan Untuk percobaan ini
waktu seminimal mungkin dan digunakan pemisahan fase terbalik.
menghasilkan resolusi yang bagus Fase gerak yang digunakan adalah
yaitu 1,5, yang meliputi optimasi campuran metanol dan air, karena
efesiensi kolom, optimasi selektifitas fase gerak yang paling sering
dan optimasi kapasitas agar digunakan untuk pemisahan dengan
memperoleh kondisi yang optimal fase terbalik adalah campuran larutan
untuk melakukan pengukuran sampel. bufer dengan metanol atau campuran
Optimasi efesiensi kolom adalah air dengan asetonitril. Sedangkan
jumlah keterulangan interaksi. untuk pemisahan dengan fase normal,
Efisiensi kolom dapat diukur N, yaitu fase gerak yang paling sering
kemampuan memberikan small bath. digunakan adalah campuran pelarut-
pelarut hidrokarbon dengan pelarut
yang terklorisasi atau menggunakan
pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini
kurang umum dibanding dengan fase
terbalik. pH fase gerak adalah asam
yaitu 2,98 karena harus disesuaikan
dengan sampel asetosal yang bersifat
asam, jika pH basa maka sampel akan
terionisasi dan peak akan membentuk
dua puncak yang berdekatan (tidak
terpisah secara sempurna).
Optimasi dilakukan dalam
perbedaan kondisi, dimana fase gerak
dibuat dalam perbandingan volume
yang berbeda dan dengan laju alir
yang berbeda pula. Salah satunya
pada kondisi perbandingan metanol :
air = 62 : 38 dan dengan laju alir 1
ml/menit. Hasil dari proses optimasi
adalah kurang baik karena dianggap
kurang memenuhi persyaratan
kesesuaian sistem dimana nilai nilai N
< 2000 ; resolusi < 1,5 ; % RSD > 1%
dan puncak mengalami tailing
sehingga nilai tailing factor besar
yaitu > 2. Fase gerak ini dipakai untuk
membuat kurva kalibrasi
melakukan penetapan kadar tablet
asetosal. Laju alir yang dipilih adalah
1 ml/menit karena semakin kecil laju
alir / flowrate yang digunakan, maka
hasil optimasi akan semakin bagus.
Pembuatan kurva baku
dilakukan dengan membuat larutan
baku asetosal dengan 4 konsentrasi
berbeda yaitu, 20 ppm, 40 ppm, ppm,
60 ppm dan 80 ppm. Masing - masing
larutan diinjeksikan sebanyak 2 kali
ke dalam HPLC agar memperoleh
hasil yang akurat. Hasil AUC dari
masing-masing larutan dibuat kurva
kalibrasinya terhadap konsentrasi.
Sumbu y sebagai nilai UAC dan
sumbu x sebagai nilai konsentrasi.
Dari kurva kalibrasi dihasilkan kurva
yang menunjukkan garis lurus dan
memberikan persamaan garisnya
yaitu y = 0,0004x – 4,4217 yang
kemudian akan digunakan untuk
perhitungan kadar sampel asetosal
tablet.
Penetapan kadar sampel tablet
asetosal dilakukan dengan membuat
larutan sampel dengan konsentrasi
500 ppm dengan cara menyerbukkan
20 tablet asetosal, kemudian timbang
serbuk sebanyak 100 mg dan larutkan
dan
dengan 20 ml larutan pengencer.
Kemudian larutan disonikasi dengan
menggunakan sonikator selama 5
menit, tujuannya untuk memisahkan Simpulan
sampel dari eksipiennya. Ambil
Dapat mengetahui kondisi optimum
larutan sebanyak 6 ml kemudian
asetosal, yaitu fase gerak metanol : air
ditambahkan sebannyak 4 ml larutan
(62 : 38), laju alir 1 ml/menit, dan
pengencer sehingga larutan sampel
panjang gelombang 278 nm dengan
konsentrasinya menjadi 60 ppm.
hasil Rs = 2,625 dan %RSD = 0,35
Larutan disaring dengan
yang memenuhi syarat. Serta
menggunakan kertas saring,
mengetahui kadar dari tablet asetosal
tujuannya agar larutan bebas dari
sampel yang ditentukan dengan
partikel-partikel kecil yang nantinya
metode HPLC yaitu 107,335%. %
akan merusak kolom dan menggangu
kadar tersebut memenuhi persyaratan
proses pengukuran. Selain itu, adanya
di FI yaitu tidak kurang dari 90% dan
gas dalam fase gerak juga harus
tidak lebih dari 110% dari jumlah
dihilangkan, sebab adanya gas akan
yang tertera pada etiket.
berkumpul dengan komponen lain
terutama di pompa dan detektor Daftar Pustaka

sehingga akan mengacaukan analisis. Annuryanti, F., J. Moechtar., and A.

Larutan sampel diinjeksikan ke dalam Darmawati. 2013.
HPLC selama 15 menit sebanyak 2 Kandungan Salisilat Bebas
kali agar lebih akurat. AUC sampel dalam Tablet Asetosal
kemudian dimasukkan ke dalam yang Beredar di Surabaya.
persamaan kurva baku dan dihitung Berkala Ilmiah Kimia
kadar asetosal dalam tablet. Hasil Farmasi, Vol. 2, No. 2.
rata-rata kadar asetosal tablet adalah
Bhusari, V., dan Dhaneshwar, S. 2012.
sebesar 107,335%. Kadar asetosal
Validated HPLC Method
tersebut memenuhi persyaratan
for Simultaneous
Farmakope Indonesia bahwa kadar
Quantitation of
asetosal dalam tablet yaitu tidak
Amlodipine Besylate,
kurang dari 90% dan tidak lebih dari
Atenolol and Aspirin in
110%.
Bulk Drug and
 Formulation. Journal of 2015. Optimasi Kondisi
Pharmaceutical and Pemisahan Glibenklamid
Biomedical Sciences, Kombinasi Metformin
17(17), pp. 1-6. dalam Plasma Darah
Menggunakan KCKT.
Depkes RI. 1995. Farmakope
IJPST, Vol. 2, No. 3.
Indonesia Edisi IV. Jakarta:
Departemen Kesehatan Shivakumar, T., Manavalan, R.,
Republik Indonesia. Marapdharan, C., dan
Valliappan, K. 2007.
Gandjar, I. G., and A. Rohman. 2007.
Multi-Criteria Decision
Kimia Farmasi Analisis.
Making Approach and
Yogyakarta: Penerbit
Experimental Design as
Pustaka Pelajar.
Chemometric Tools to
Harmita. 2004. Validasi Metode Optimize HPLC
Analisis. Majalah Ilmu Separation of
Kefarmasian, 1, 117-135. Domperidone and

Oscik, J. 1982. Adsorption. Chicester: Pantoprazole. Journal of

John Wiley. Pharmaceutical and

Biomedical Analysis, Vol.
Ree, M., and E. Stoa. 2011.
43, p. 1342-1848.
Stimultaneous
Determination of Sweetman, S. C, editor. 2009.

Aspartame, Benzoic Acid, Martindale the Complete

Caffeine, and Saccharine in Drug Reference 36th

Sugar-Free Beverages Edition. London:

Using HPLC. Concordia Pharmaceutical Press.

College Journal of Waliszewski, K., Pardio, V., dan

Analytical Chemistry. 2 (12) Orando, S. 2007. A Simple
pp. 73-77. and Rapid HPLC

Rohayati, A., A. N. Hasanah., N. M. Technique for Vanilllin

Saptarini., A. D. Aryanti. Determination in Alcohol
Extract. Food Chemistry,
101 (3), p. 1059-1062.