Penuntun Praktikum

BIOKIMIA
BLOK V
Metabolisme Karbohidrat, Lipid dan Protein

Oleh

Drs. Sadakata Sinulingga, Apt. M.Kes

dr. Yanti Rosita M.Kes
dr. H. Safyuddin, M.Biomed

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PALEMBANG
2010
UJI HASIL METABOLISME
KARBOHIDRAT, LIPID DAN PROTEIN
Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 0
TEORI
Hasil-hasil pemecahan pada metabolisme, terbanyak dikeluarkan dari tubuh
lewat ginjal bersama urine. Ini terutama berlaku untuk akhir metabolisme protein
yang mengandung nitrogen. Pada keadaan sakit, sebagian metabolisme terganggu,
ginjal mengeluarkan hasil-hasil pemecahan metabolisme yang terganggu tersebut,
dan asalkan fungsi ginjal cukup baik. Demikian Juga banyak racun-racun dan obat-
obat yang dikeluarkan lewat urine, baik dalam keadaan tak di ubah atau hasil
pemecahannya. Sehingga dapat ditarik kesimpulan penting dari pemeriksaan urine.
Pemeriksaan urine tidak hanya memberikan gambaran tentang ada tidaknya
penyakit-penyakit ginjal dan saluran-saluran pembuangannya, namun pada fungsi
ginjal yang baikpun dapat juga diperoleh data penting mengenai penyakit-penyakit
yang terdapat ditempat-tempat lain dalam tubuh. Karena dari setiap pasien untuk
pemeriksaan kimiawi selalu dapat diperoleh jumlah urine yang cukup banyak.
Pemeriksaan urine seharusnya diutamakan daripada pemeriksaan kimiawi darah,
yang selalu hanya tersedia jumlah sample yang sedikit.
Pengeluaran bahan-bahan kebanyakan boleh dikata tidak tergantung dari
diuresis contoh : seseorang mengeluarkan setiap jam 25 ml urine dengan kadar
protein 10%. Sesudah minum air terjadilah diuresis air dan urin jernih banyak
dikeluarkan dengan berat jenis rendah, dalam urin ini kadar protein akan turun
sampai 0,5%, karena pengeluaran protein per jam tetap misalnya dalam contoh ini
¼ gram.
Pengeluaran hasil-hasil pemecahan rupanya sepanjang hari konstan. Hal ini
berlaku untuk kreatinin, sepanjang kadarnya dalam darah konstan, Bahan lain
seperti glukosa, protein, kalsium dan fosfor menunjukkan irama, pada malam hari
pengeluaran bahan-bahan tersebut lebih sedikit dari pada siang hari.

CARA MENGAMBIL URIN

Untuk pemeriksaan rutin laki-laki, urin dapat diambil dengan jalan biasa , yaitu
orang tersebut disuruh kencing, sebaiknya porsi urin yang dikeluarkan awal
dibuang, dan porsi selanjutnya ditampung.
Untuk wanita juga berlaku hal yang sama, porsi urin yang dikeluarkan awal
dibuang dan baru porsi akhir ditampung.
Semua ini dmaksudkan untuk menghindarkan pencemaran yang berasal dari
saluran kencing sendiri. Pengambilan urin dengan kateter hanya dilakukan bila ada
indikasi karena resiko infeksi saluran kencing yang besar pada kateterisasi

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 1

 1. Uji glukosa dalam urin secara Benedict
Tujuan :
Menetapkan kadar gula urin secara semikuantitatif
Dasar :
Gula mereduksi yaitu gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas,
senyawa ini akan merduksi ion kupri menjadi kuprooksida yang tidak larut dan
berwarna merah. Banyaknya endapan merah yang terbentuk sesuai dengan kadar
gula yang terdapat dalam urin.
Bahan:
1. Urin normal 24 jam dan urin yang mengandung glukosa
2. Larutan Benedict
Cara kerja :
1. Campurlah dalam tabung reaksi 2,5 ml larutan Benedict dan 4 tetes urin
2. Panaskan dalam tangas air mendidih selama 5 menit atau panaskan langsung
hingga mendidih selama 2 menit
3. Dinginkan perlahan-lahan
4. Perhatikan endapan yang terbentuk
5. Simpulkan sesuai table berikut
Warna Penilaian Konsentrasi gula
Biru/hijau keruh - -
Hijau/hijau kekuningan +1 kurang dari 0,5%
Kuning kehijauan/kuning +2 0,5 – 1,0 %
Jingga +3 1,0 – 2,0 %
Merah +4 lebih dari 2,0 %

2. Uji Obermeyer
Tujuan :
Memeriksa adanya indikan dalam urin
Dasar :
Gugus indoksil dioksidasi oleh pereaksi Obermeyer yang mengandung FeCl 3 dala
HCl pekat membentuk warna biru indigo yang larut dalam kloroform.
Bahan dan pereaksi :
1. Urin normal 24 jam

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 2

 2. Pereaksi Obermeyer
3. Kloroform
Cara kerja
1. Masukkan dalam tabung reaksi 8 ml urin
2. Tambahkan 8 ml pereaksi Obermeyer, diamkan beberapa menit
3. Tambahkan 3 ml kloroform, campur dengan membalik-balik tabung 10 X
(jangan dikocok)dapat terjadi emulsi. Kloroform akan mengekstraksi biru
indigo

3. Uji Protein Urin menurut Heller

Tujuan :
Memeriksa adanya protein dalam urin
Dasar :
Protein dalam urin mengalami denaturasi oleh asam nitrat yang tampak sebagai
cincin putih pada perbatasan kedua cairan

Bahan:
1. Urin normal 24 jam dan urin patologis
2. Asam nitrat pekat masukkan dalam buret
Cara kerja :
1. Alirkan dari buret 3 ml asam nitrat pekat perlahan-lahan kedalam tabung
reaksi
2. Dengan memakai pipet Mohr, pelan-pelan tambahkan 3 ml urin normal atau
patologis melalui dinding tabung sehingga kedua cairan tidak bercampur
3. Perhatikan cincin putih yang terjadi antara dua lapisan
Catatan :
Urea asam urat dan garamnya dapat menghasilkan cincin putih, tetapi hal ini dapat
dibedakan dengan memakai urin yang telah diencerkan 3 – 4 X sehingga pengaruh
ini dapat dihilangkan.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 3

 4. Uji koagulasi protein dalam urin

Tujuan:
Untuk identifikasi protein dalam urin
Dasar:
Pembentukan presipitat akibat pemanasan urin. Presipitat yang hilang pada
pengasaman menyatakan fosfat, sedangkan presipitat yang disebabkan oleh protein
akan tetap atau bertambah. Pada kelebihan asam juga akan menyebabkan larutnya
protein yang telah mengendap
Bahan:
1. asam asetat 2%
2. urin jernih
Metode:
- Panaskan 5 ml urin hingga mendidih selama 1-2 menit
- Bila terbentuk endapan, tambahkan 3-5 tetes asam asetat 2%. Apakah
presipitat tersebut hilang atau bertambah?

5. REAKSI JAFFE

Tujuan:
Untuk identifikasi kreatinin dalam urin
Bahan :
1. Larutan asam pikrat jenuh,
2. larutan NaOH 10 % larutan HCl dan
3. larutan glukosa.
4. Urin
Metoda :
- Masukkan 5 ml urine kedalam sebuah tabung reaksi dan 5 ml kedalam tabung
lain.
- Tambahkan masing-masing 1 ml larutan asam pikrat jenuh dan 1 ml NaOH 10 %,
perhatikan warna merah yang terbentuk.
- Tambahkan HCl pada salah satu tabung, bandingkan hasilnya pada tabung yang
tidak ditambah HCl.
- Bandingkanlah percobaan ini terhadap larutan glukosa yang ditambah asam
pikrat alkalis.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 4

 Apakah senyawaan yang terbentuk itu sama ?

Hasil : Terbentuk warna merah bata

Keterangan :
Reaksi ini terbentuk berdasarkan pembentukan tautomer kreatinin pikrat yang
berwarna merah, bila kreatinin direaksikan dengan larutan pikrat alkalis, warna ini
akan berubah menjadi warna kuning apabila larutan diasamkan.
Selain asam pikrat, kreatinin dapat juga diendapkan oleh asam fosfowolframat dan
garam-garam logam berat.
Kreatinin dapat mereduksi pereaksi Fehling, tetapi tidak dapat mereduksi pereaksi
Benedict.

6. UJI MUREKSIDA

Tujuan:
Untuk identifikasi asam urat dalam urin
Bahan :
Larutkan HNO3 pekat, kristal asam urat, larutan amoniak encer (1/100)
Metoda :
- Letakkan sedikit (0,1 gr) kristal asam urat dalam sebuah cawan penguap.
- Tambahkan 3 tetes asam nitrat, lalu panaskan sehingga kering pada penangas uap.
Perhatikan warna merah yang timbul
- Setelah dingin tambahkan 1 tetes amonik encer (1/100).
- Perhatikanlah warna yang terbentuk.
Hasil : Terbentuk warna merah
Keterangan :
Asam urat dioksidasi oleh asam nitrat pekat membentuk asam dialurat dan alloksan.
Zat-zat terkondensasi dengan amoniak membentuk mureksida (amonium furfurat)
yang berwarna ungu kemerahan.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 5

 7. TEST NITROPRUSSIDA (ROTHERA)

Tujuan:
Untuk identifikasi benda keton dalam urin

Bahan :
1. Kristal amonium sulfat,
2. larutan Na nitroprussida 5%
3. larutan NH4OH pekat dan
4. urin.

Metoda :
- Bubuhkan pada 5 ml urin, kristal amonium sulfat sampai jenuh.
- Tambahkan 2-3 tetes Na-nitroprussida 5 % yang baru dibuat dan 1-2 ml
amonium hidroksida pekat, campur dan biarkan selama setengah jam.
- Terbentuknya warna ungu permanganat menyatakan adanya zat-zat keton. Warna
coklat tidak berarti positif.
Hasil :
Warna ungu yang lambat laun menjadi lebih tua.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 6

 BIOKIMIA DARAH

TEORI :
Darah merupakan jaringan tubuh yang berbentuk cair, yang beredar dalam system
pembuluh darah. Jumlah darah didalam tubuh kira-kira 5 – 7 % dari berat badan
atau pada orang dewasa kira-kira 4,5 – 5 liter. Darah terdiri dari berbagai sel seperti
eritrosit atau sel darah merah (SDM) , sel darah putih (lekosit) dan trombosit.
Eritrosit adalah sel yang terbanyak didalam darah, jumlahnya mencapai 5 juta butir/
ml , trombosit jumlahnya 250.000 – 400.000 butir/ml dan lekosit 5.000 – 10.000 /ml
. Fungsi ketiga macam sel ini berbeda. Sel darah merah berfungsi mengikat dan
membawa oksigen dari paru – paru ke seluruh tubuh, serta membawa dan
melepaskan CO2 dari seluruh tubuh ke paru. Untuk itu SDM dilengkapi dengan
molekul khusus yang melaksanakan fungsi tersebut dan sekaligus memberi warna
merah pada darah, yaitu hemoglobin (HB).
Hemoglobin adalah suatu protein dengan berat molekul 64.450 didalam hemoglobin
terdapat atom besi dalam keadaan tereduksi ( Fe 2+) . Dengan bantuan Fe2+ ini
hemoglobin dpat mengikat oksigen. Hemoglobin yang mengikat oksigen disebut
hemoglobin teroksidasi atau oksihemoglobin (HBO2 ) , sedang hemoglobin yang
sudah melepas oksigen disebut hemoglobin tereduksi atau deoksihemoglobin
(deoksiHb )
Peristiwa tersebut dapat dituliskan dengan reaksi sbb :
paru
Hb + O2 =============== HbO2
jaringan

Atom besi dalam hemoglobin dapat teroksidasi bila muatan positif atom besi
menjadi 3 + (Fe3+ ) Hemoglobin dengan besi teroksidasi ( Fe3+) disebut hemoglobin
teroksidasi atau methemoglobin (metHb) atau Hb(Fe3+) . Dalam keadaan ini
hemoglobin tidak dapat lagi mengikat oksigen. Hemoglobin yang ter oksidasi
menjadi methemoglobin akan kehilangan fungsinya. Perubahan Hb menjadi metHb
dapat terjadi karena adanya senyawa peng oksidasi . Bila ini terjadi dalam tubuh
maka dapat timbul akibat yang fatal, misalnya karena pemberian obat-obatan
tertentu terutama pada orang yang berbakat untuk keadaan tersebut . Selain itu
hemoglobin juga dapat berikatan dengan suatu gas hasil pembakaran tidak

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 7

sempurna dari dari suatu bahan bakar yaitu CO (karbon monoksida ) sehingga
terbentuk HbCO . Ikatan hemoglobin dan CO ini 200 kali lebih kuat dari pada
ikatan Hb dengan O2 akibatnya hemoglobin tidak dapat lagi mengikat membawa
dan mendistribusikan O2.
Hemoglobin juga mempunyai sifat seperti enzim peroksidase, ini berarti
hemoglobin dapat mengkatalisis reduksi H2O2 bila ada suatu reduktor. Berbeda
dengan enzim pada hemoglobin sifat ini tidak hilang setelah pemanasan. Sifat ini
dapat digunakan untuk melacak adanya darah dalam suatu bahan uji. Sifat seperti
peroksidase ini disebabkan oleh adanya gugus hem dalam hemoglobin.
Sel darah merah seperti sel lainnya akan mengkerut dalam larutan dengan
tekanan osmotic yang lebih tinggi (hipertonik) dari tekanan osmotic plasma. Dalam
larutan dengan tekanan osmotic lebih rendah (hipotonik) maka SDM akan
membengkak karena cairan dari luar sel akan masuk kedalam sel dan kemudian
terjadi lisis membran (hemolisis) . Hemoglobin dari SDM yang mengalami lisis
larut dlam plasma sehingga memberi wrna merah pada plasma. SDM normal akan
mulai mengalami lisis bila dimasukkan dalam NaCl 0,48% dan pada larutan NaCl
0,33 % terjadi lisis sempurna. SDM juga dapat mengalami lisis oleh obat-obatan .
Struktur membran SDM mengandung lipid be layer , bila SDM dimasukkan dalam
pelarut organic misalnya : eter, toluene, maka membran SDM akan mengalami lisis
karena larutnya lipid membran sehingga hemoglobin terlepas kedalam pelarutnya.

1. Uji Oksihemoglobin dan deoksihemoglobin

Tujuan :
Membuktikan bahwa hemoglobin dapat mengikat oksigen menjadi HbO 2 dan
senyawa ini dapat terurai kembali deoksi Hb dan O2
Dasar :
Dalam keadaan tereduksi Fe dalam Hb dapat mengikat dan melepaskan O2
Dalam lingkungan udara biasa, Hb segera mengikat O2 menjadi Hb O2 didalam
tabung reaksi HbO2 akan melepas O2 pada penambahan pereaksi Stokes (pereduksi)
Bahan dan pereaksi :
1. Suspensi darah
2. Pereaksi Stokes
3. Larutan Amonium Hidroksida (NH4OH)
Cara kerja :

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 8

A. Oksihemoglobin
1. Kedalam tabung reaksi masukkan 2 ml darah dan 6 ml air suling, campur
dengan baik , perhatikan dan catat terbentuknya HbO2 yang berwarna
merah , kareana bereaksi dengan oksigen
2. Bagilah menjadi 2 tabung masing-masing 4 ml, tabung yang satu digunakan
sebagai kontrol.
B. Pembentukan deoksihemoglobin
1. Pipetkan kedalam tabung reaksi 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan
NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang terbentuk
2. Pada salah satu tabung yang berisi HbO2 dari percobaan A teteskan beberapa
tetesperekasi Stokes dari percobaan (B 1.) perhatikan dan catat warna deoksi
Hb yang terbentuk dan bandingkan dengan warna HbO2 dalam tabung yang
satu lagi pada percobaan (A. 2.) (tabung kontrol).
C. Pembentukan kembali HbO2 dari deoksi Hb
1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksi Hb tersebut (hasil percobaan
B.2.)
Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.
O2 yang di ikat oleh Hb berasal dari udara . De oksigenasi dan re oksigenasi
dapat dilakukan berulang-ulang.

2. Pengaruh pelarut organik pada SDM

Tujuan percobaan :
Memperlihatkan bahwa membran sel darah merah dapat mengalami lisis dalam
pelarut organik

Dasar Percobaan :
Membran sel darah merah (SDM) antara lain mengandung lipid. Bila SDM
dimasukkan ke dalam larutan yang mengandung pelarut organic, maka membran
lipid akan larut, sehingga terjadi hemolisis.

Bahan dan Pereaksi :

1. Suspensi darah
2. NaCl 0,9%
3. Kloroform

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 9

 4. Eter
5. Aseton
6. Toluen
7. Alkohol

Cara Percobaan :
1. Kedalam 6 tabung reaksi masing-masing dimasukkan 10 ml NaCl 0,9%
2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol, dan pada ke 5 tabung lainnya
tambahkan masing-masing 6 tetes ; kloroform ; eter ; aseton ; toluene dan
alcohol secara ber urutan.
3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah , campur dengan
membaliknya perlahan – lahan, biarkan setengah jam (jangan di kocok ).
Perhatikan warna yang terbentuk pada larutan bagian atas dan bandingkan
dengan kontrol.

3. Pengaruh pelarut kimia terhadap membran sel darah merah

Tujuan Percobaan :
Memperlihatkan pengaruh larutan hiper/hipotonik terhadap membran sel darah
merah

Dasar Percobaan :
SDM akan mengkerut bila berada dalam larutan hipertonik terhadap tekanan
osmotic plasma. Dalam larutan yang hipotonik, cairan dari luar sel akan masuk ke
dalam sel sehingga SDM akan membengkak , dan akhirnya terjadi hemolisis.
Hemoglobin dalam SDM akan larut dalam larutan, sehingga memberi warna merah
jernih pada larutan.

Bahan dan Pereaksi :

1. Suspensi darah
2. NaCl 2%

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 10

Cara Percobaan :
1. Kedalam 10 tabung reaksi isikan campuran sebagai berikut :
Nomor tabung Air suling (ml) NaCl 2% (ml) % NaCl
1. 10 0 ………
2. 9 1 ………
3. 8 2 ………
4. 7,5 2,5 ………
5. 7 3 ………
6. 6,5 3,5 ………
7. 6 4 ………
8. 5,5 4,5 ………
9. 5 5 ………
10. 4,5 5,5 ………

2. Campur dengan baik

3. Tambahkan 2 tetes suspensi darah ke dalam setiap tabung dan campur
dengan membalikanya perlahan-lahan, diamkan selama 1 jam.
4. Perhatikan dan catat derajat hemolisis pada tiap-tiap tabung reaksi

4.Pemeriksaan Enzim Katalase dalam Darah

Prinsip :
Enzim katalase ada dalam darah dimana katalase akan memecah H 2O2 menjadi air
dan O2 , O2 diperlukan oleh tubuh, di klinik H2O2 digunakan untuk membersihkan
luka, O2 berfungsi untuk membunuh kuman-kuman anaerob, sedangkan air untuk
membersihkan luka.
Reaksi :
katalase
2 H2O2 2 H2O + O2
Bahan :
H2O2 10 % , darah
Metoda :
2 – 3 tetes darah + 1 - 2 tetes H2O2
Hasil:
Reaksi positif maka akan tampak busa karena terbebasnya O2 oleh enzim katalase.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 11

 SASARAN PEMBELAJARAN

I. PERCOBAAN ENZIM
Mahasiswa mampu ;
1. Mengetahui pengaruh konsentrasi enzim terhadap kecepatan reaksi
2. Mengetahui pengaruh konsentrasi subtrat terhadap kecepatan reaksi
3. Mengetahui pengaruh dehidrogenisasi pada reaksi oksidasi subtrat
4. Mengetahui pengaruh Cl dan pH terhadap aktifitas Ptyalin.

ENZIM
TEORI :
Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk
berbagai reaksi kimia dalam sIstem biologik. Hampir semua reaksi kimia dalam
sIstem biologis dikatalisis oleh enzim. Sintesis enzim terjadi di dalam sel dan
sebagian besar enzim dapat di ekstraksi dari sel tanpa merusak fungsinya.
Kepentingan medis enzim : Enzim terdistribusi di tempat-tempat tertentu
didalam sel lebih kurang sesuai dengan golongannya dan juga fungsinya, sebagai
contoh enzim yang berperan dalam sintesis dan reparasi DNA terletak didalam inti
sel. Enzim yang mengkatalisis berbagai reaksi yang menghasilkan energi secara
aerob terletak dalam mitokondria. Enzim yang berhubungan dengan biosintesis
protein berada bersama ribosom. Dengan demikian reaksi kimia dalam sel berjalan
sangat terarah dan efisien.
Ada beberapa penyakit yang disebabkan oleh abnormalitas sintesis enzim
tertentu, misalnya pada defisiensi enzim glukosa 6 fosfat dehidrogenase
(G6PDH/G6PD). Sel darah merah (SDM) penderita defisiensi G6PDH ini sangat
rentan terhadap pembebanan oksidatif, misalnya pada pemakaian obat-obatan
tertentu dan obat malaria dapat terjadi hemolisis intravaskuler.
Analisis enzim dalam serum dapat dipakai untuk deteksi penyakit seperti
infark otot jantung, kerusakan jaringan hati, bendungan saluran empedu, penyakit
prostat dll. Dasar penggunaan enzim sebagai dasar penunjang diagnosis ialah :
1. Pada dasarnya sebagian besar enzim berada dalam sel
2. Enzim tertentu adanya intrasel, bila enzim berada dalam serum berartiI terjadi
kerusakan pada jaringan asalnya.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 12

Penggolongan enzim :
Jumlah enzim ada ribuan macam tapi dapat digolongkan menjadi 6 golongan
1. Oksidoreduktase, kelompok enzim ini mengkatalisis reaksi–reaksi redoks.
2. Transferase, kelompok enzim ini mengkatalisis reaksi pemindahan berbagai
gugus misal, amina , karboksil, metil, asil dll.
3. Hidrolase, kelompok enzim ini mengkatalisis pemutusan ikatan kovalen
sambil mengikat air.
4. Liase, kelompok enzim memutus ikatan kovalen tanpa mengikat air
5. Isomerase, kelompok enzim ini mengkatalisis reaksi isomerisasi.
6. Ligase(sintase), kelompok enzim ini mengkatalisis pembentukan ikatan
kovalen.

Kespesifikan enzim dibedakan dalam : kespesifikan optik dan gugus

Kespesifikan optik tampak pada enzim yang bekerja pada karbohidrat dan misal
hanya bekerja terhadap isomer D bukan L, juga pada di asam amino dan protein
misal hanya bekerja pada isomer amino L bukan isomer D.
Kespesifikan gugus, hanya pada gugus tertentu misal enzim alcohol dehidrogenase
tidak dapat mengkatalisis reaksi dehidrogenasi pada senyawa bukan alcohol.
Faktor – faktor yang mempengaruhi kerja enzim, seperti protein lainnya sifat
biologis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai faktor fisika kimia. Enzim bekerja
pada kondisi tertentu yang relatif ketat. Adapun faktor yang mempengaruhi kerja
enzim anatar lain: suhu, pH, oksidasi udara atau senyawa lain, penyinaran UV, sinar
X, alfa beta dan gama.
Disamping itu kecepatan reaksi enzimatik dipengaruhi pula oleh konsentrasi
enzim maupun substratnya.

Pengaruh suhu :
Suhu rendah mendekati titik beku tidak merusak enzim namun enzim tidak
dapat bekerja. Kenaikan suhu lingkungan akan meningkatkan energi kinetik enzim
dan meningkatkan frekuensi benturan antar molekul enzim dan substrat dan pada
suhu tertentu akan mencapai kecepatan reaksi maksimum, bila suhu ditingkatkan
terus maka jumlah enzim yang aktif akan berkurang karena mengalami denaturasi.
Kecepatan reaksi enzimatik berlangsung maksimal pada suhu optimum. Enzim pada
suhu 37o C optimum dalam tubuh manusia . Sebagian besar enzim tidak aktif pada
pemanasan sampai 60o C karena mengalami denaturasi.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 13

Pengaruh pH :
Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu. Bila dilakukan pengukuran aktivitas
enzim pada beberapa macam pH yang berlainan maka sebagian besar enzim akan
menunjukkan aktivitas maksimum antara pH 5,0 – 9,0. Kecepatan reaksi enzimatik
berlangsung maksimal pada pH optimum.
Ada enzim yang mempunyai pH optimum sangat rendah yaitu pepsin, pH
optimum pepsin adalah 2. Pada pH yang jauh diluar pH optimum enzim akan
terdenaturasi. Selain itu pada keadaan ini baik enzim maupun substrat dapat
mengalami perubahan muatan listrik yang mengakibatkan enzim tidak dapat
berikatan dengan substrat.

Pengaruh konsentrasi enzim

Peningkatan konsentrasi enzim akan meningkatkan reaksi enzimatik. Dapat
dikatakan bahwa kecepatan reaksi enzimatik (v) berbanding lurus dengan
konsentrasi enzim (E) makin besar konsentrasi enzim reaksi enzimatik makin cepat

Pengaruh konsentrasi substrat :

Pada suatu reaksi enzimatik bila konsentrasi substrat diperbesar sedangkan
konsentrasi lainnya tetap, maka kecepatan reaksi (v) akan meningkat samapai suatu
batas kecepatan maksimum (V). Pada titik maksimum ini enzim telah jenuh dengan
substrat.
Dalam suatu reaksi enzimatik, enzim akan mengikat substrat membentuk
komplek enzim –substrat (ES) kemudian komplek ini akan terurai menjadi enzim
(E) dan produk (P) makin banyak komplek (ES) terbentuk makin cepat reaksi
berlangsung sampai batas kejenuhan (ES). Pada konsentrasi substrat (S) melampaui
batas kejenuhan kecepatan reaksi akan konstan, dalam keadaan ini seluruh enzim
sudah berada dalam bentuk komplek (ES) artinya penambahan jumlah (S) tidak
menambah jumlah (ES).

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 14

 1. Pengaruh konsentrasi enzim Terhadap kecepatan reaksi

Tujuan :
Membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik berbanding lurus dengan
konsentrasi enzim
Dasar :
Pada konsentrasi substrat tertentu, penambahan enzim dengan konsentrasi
bertingkat akan meningkatkan terbentuknya jumlah komplek enzim–substrat,
sehingga jumlah produk yang terbentuk juga meningkat.
Bahan dan pereaksi :
1. Susu
2. Larutan enzim protease ( pepsin 0,5% , atau bromelin)
3. Penangas air

Cara :
1. Siapkan penangas air dengan suhu 37o C letakkan ke dalamnya sebuah
tabung reaksi berisi 15 ml susu
2. Selain itu letakkan juga di dalamnya 3 tabung reaksi masing-masing berisi 1,
0 ml enzim protease, 0,5 ml enzim protease + 0,5 ml air , 0,25 ml enzim
protease +, 0,75 ml air
3. Setelah di inkubasi selama 5 menit pipetkan masing-masing 5 ml susu
hangat ke dalam 3 tabung reaksi yang berisi enzim protease diatas
4. Lakukan satu demi satu jangan serentak, campurkan isi tabung dengan baik
dan cepat, amati penggumpalan susu dalam hitungan detik dari tiap-tiap
tabung.

2. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap Kecepatan reaksi

Tujuan :
Membuktikan bahwa kecepatan reaksi enzimatik sampai batas tertentu
dipengaruhi oleh konsentrasi substrat.

Dasar :
Penambahan substrat dengan konsentrasi meningkat sampai konsentarsi
tertentu akan meningkatkan kecepatan reaksi enzimatik hingga mencapai kecepatan

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 15

maksimum . Penambahan substrat setelah konsentrasi tersebut tidak akan
meningkatkan kecepatan reaksi enzim, sebab telah melampaui titik jenuh enzim.

Bahan dan pereaksi :

1. Susu
2. Larutan enzim protease (pepsin 0,5% atau bromelin)
Cara :
1. Siapkan 3 tabung reaksi bersih dan kering, masukkan ke dalamnya pada
tabung pertama 5 ml susu, tabung kedua 4 ml susu + 1 ml air, tabung ketiga
3 ml susu dan 2 ml air. Siapkan juga I tabung reaksi berisi 3 ml enzim.
2. Letakkan keempat tabung dalam penangas air 37o C selama 5 menit.
3. Pipetkan 1 ml larutan enzim ke dalam masing-masing tabung di atas dan
amati waktu penggumpal-pengumpalanan susu pada tiap tabung, lakukan
satu persatu jangan serentak.
4. Catatlah waktu yang diperlukan untuk penggumpalan susu dalam hitungan
detik.

3. Uji Schardinger
Tujuan :
1. Memperlihatkan bahwa oksidasi dapat terjadi melalui dehidrogenasi suatu
substrat, dalam hal ini formaldehida
2. Memperlihatkan adanya enzim dehidrogenase aerob, yaitu aldehide
dehidrogenase dalam susu segar
Dasar :
Aldehid dehidrogenasi mengoksidasi formaldehida dengan cara melepas
hydrogen. Hidrogen yang terbentuk dapat dipindahkan langsung ke oksigen udara
menjadi H2O2 atau suatu senyawa penerima misalnya riboflavin atau biru metilen.
Pada akhirnya senyawa penerima yang tereduksi tersebut akan menyerahkan
hidrogen ke oksigen udara membentuk H2O2. Hal ini tampak jelas bila
menggunakan biru metilen sebagai penerima hidrogen . Biru metilen tereduksi tidak
berwarna (leuko biru metilen). Pada permukaan larutan susu akan teroksidasi
kembali menjadi biru karena ada kontak dengan udara.

Bahan dan pereaksi :

1. Susu segar dan susu pasteurisasi
2. Larutan biru metilen 0,02%

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 16

 3. Larutan formaldehida 0,4%

Cara :
1. Siapkan 2 tabung reaksi, satu tabung diisi 5 ml susu segar, tabung kedua
diisi 5 ml susu pasteurisasi
2. Kemudian tambahkan berturut-turut 1 ml biru metilen dan 1 ml formal
dehide pada masing-masing tabung.
3. Campur dengan baik dan masukkan penangas air suhu 60 – 65 oC
4. Catat apa yang terjadi.
Pertanyaan :
1. Tulis reaksi dehidrogenasi formal dehida menjadi asam format !
2. Mengapa susu pasteurisasi memberi uji Schardinger berbeda ?

4. AKTIVITAS PTYALIN DENGAN ADANYA Cl

Bahan:
Lar. Amilum 1 % lar. Jodium encer, lar.liur.
Metoda:
Cara pengumpulan larutan liur:
Setelah berkumur-kumur dengan air, kunyah sedikit lilin parafin untuk memacu
sekresi saliva. Tampung saliva tsb dalam beker glas kecil, cairkan dengan sedikit
aquades kemudian disaring
Cara melakukan :
1. l NaCl 1 % + 3 ml lar. amilum 1 % + 1 tetes lar. Jodium encer + 1ml lar.Liur
2. l HCl 1 N+ 3 ml lar. amilum 1 % + 1 tetes lar. Jodium encer + 1ml lar Liur
3. 1 ml Aquades + 3 ml lar. amilum 1 % + 1 tetes lar. Jodium encer + 1ml lar.
Liur
Lihat ada tidaknya perubahan warna dan berapa lama terjadi perubahan.

Keterangan :
-Air liur mengandung ptialin (amilase) yang menghidrolisis amilum
menjadi dekstrin dan maltosa
Larutan amilum bila ditetesi jodium akan berwarna biru tua yang khas
untuk amilum

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 17

 Hidrolisa amilum Reaksi jodium

Amilum biru

Amilodekstrin + maltosa biru

Eritrodekstrin + maltosa merah anggur

Akroodektrin + maltosa tak berwarna

Maltosa tak berwarna

Ptyalin seperti enzim-enzim lain mempunyai pH optimum, inhibitor dan

aktivatornya sendiri–sendiri:

- pH optimum 6-7 ( kira-kira 6,8)

- Aktivator Cl-

- NaCl menyebabkan suasana yang baik unutk aktivitas ptyalin karena adanya

aktivator ion Cl, tetapi pH tetap netral . Terlihat pada percobaan ini hilangnya

warna paling cepat.

- HCl menyebabkan larutan terlalu asam, sehingga ptyalin tidak aktif terlihat pada

percobaan warna tidak hilang.

- Aquades mengandung Cl, dan pH Aquades netral. Karena hanya mendapatkan

sedikit Cl terlihat disini diperlukan waktu lebih lama.

Perhatian Aquades yang baru bersifat netral bila didiamkan pH akan berubah.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 18

 SASARAN PEMBELAJARAN

II. PERCOBAAN KARBOHIDRAT, LIPID DAN PROTEIN

Mahasiswa mampu ;
1. Menetapkan kadar glukosa urin secara semi kuantitatip
2. Mengetahui cara identifikasi zat keton di dalam urin
3. Mengetahui cara identifikasi kreatinin di dalam urin
4. Mengetahui cara identifikasi asam urat di dalam urin

KARBOHIDRAT, LIPID DAN PROTEIN

1. UJI BENEDICT
Tujuan : Menetapkan kadar gula urine secara semikuantitatif.
Dasar :
Gula mereduksi yaitu gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas,
senyawa ini akan mereduksi ion kupri menjadi kuprooksida yang tidak larut dan
berwarna merah. Banyaknya endapan merah yang terbentuk sesuai dengan kadar
gula yang terdapat dalam urine.
Bahan dan alat-alat:
1. Urine normal 24 jam yang mengandung glukosa
2. Larutan Benedict
3. Pipet tetes
4. Alat pemanas air/tangas air
5. Pengatur waktu

Cara kerja:
1. Campurlah dalam tabung reaksi 2.5 ml lar. Benedict dan 4 tetes urin.
2. Panaskan dalam tangas air mendidih selama 5 menit atau panaskan langsung
hingga mendidih selama 2 menit.
3. dinginkan perlahan-lahan
4. perhatikan endapan yang terbentuk
5. simpulkan sesuai dengan tabel berikut:

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 19

 Warna Penilaian Konsentrasi
Biru/Hijau keruh - -
Hijau/Hijau kekuningan +1 Kurang dari 0.5 %
Kuning kehijauan/Kuning +2 0.5 - 1.0 %
Jingga +3 1.0 - 2.0 %
Merah +4 Lebih dari 2.0 %

2. TEST NITROPRUSSIDA (ROTHERA)

Bahan :
Kristal amonium sulfat, larutan Na nitroprussida 5% larutan NH 4OH pekat dan
urin.
Metoda :
Bubuhkan pada 5 ml urin, kristal amonium sulfat sampai jenuh. Tambahkan 2-3
tetes Na-nitroprussida 5 % yang baru dibuat dan 1-2 ml amonium hidroksida pekat,
campur dan biarkan selama setengah jam. Terbentuknya warna ungu permanganat
menyatakan adanya zat-zat keton. Warna coklat tidak berarti positif.
Hasil :
Warna ungu yang lambat laun menjadi lebih tua.

3. REAKSI JAFFE
Bahan :
Larutan asam pikrat jenuh, larutan NaOH 10 % larutan HCl dan larutan glukosa.
Metoda :
Masukkan 5 ml urine kedalam sebuah tabung reaksi dan 5 ml kedalam tabung lain.
Tambahkan masing-masing larutan asam pikrat jenuh dan 1 ml NaOH 10 %,
perhatikan warna merah yang terbentuk.
Tambahkan HCl pada salah satu tabung, bandingkan hasilnya pada tabung yang
tidak ditambah HCl. Bandingkanlah percobaan ini terhadap larutan glukosa yang
ditambah asam pikrat alkalis.
Apakah senyawaan yang terbentuk itu sama ?

Hasil : Terbentuk warna merah bata

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 20

Keterangan :Reaksi ini terbentuk berdasarkan pembentukan tautomer kreatinin
pikrat yang berwarna merah, bila kreatinin direaksikan dengan larutan pikrat alkalis,
warna ini akan berubah menjadi warna kuning apabila larutan diasamkan.
Selain asam pikrat, kreatinin dapat juga diendapkan oleh asam fosfowolframat dan
garam-garam logam berat.
Kreatinin dapat mereduksi pereaksi Fehling, tetapi tidak dapat mereduksi pereaksi
Benedict.

4. ASAM URAT (Uji Mureksida)

Bahan :
Larutkan HNO3 pekat, kristal asam urat, larutan amoniak encer (1/100)
Metoda :
Letakkan sedikit (0,1 gr) kristal asam urat dalam sebuah cawan penguap.
Tambahkan 3 tetes asam nitrat, lalu panaskan sehingga kering pada penangas uap.
Perhatikan warna merah yang timbul Setelah dingin tambahkan 1 tetes amonik
encer (1/100). Perhatikanlah warna yang terbentuk.
Hasil : Terbentuk warna merah
Keterangan :
Asam urat dioksidasi oleh asam nitrat pekat membentuk asam dialurat dan alloksan.
Zat-zat terkondensasi dengan amoniak membentuk mureksida (amonium furfurat)
yang berwarna ungu kemerahan.

SASARAN PEMBELAJARAN

III. DARAH
Mahasiswa mampu ;
1. Mengetahui proses oksigenasi dan dioksigenasi pada sel darah merah.
2. Mengetahui pengaruh pelarut organik pada integritas sel darah merah.
3. Mengetahui peran enzim katalase dalam darah.

TEORI :
Darah merupakan jaringan tubuh yang berbentuk cair, yang beredar dalam
sistem pembuluh darah. Jumlah darah didalam tubuh kira-kira 5 – 7 % dari berat

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 21

badan atau pada orang dewasa kira-kira 4,5 – 5 liter. Darah terdiri dari berbagai sel
seperti eritrosit atau sel darah merah (SDM), sel darah putih (lekosit) dan trombosit.
Eritrosit adalah sel yang terbanyak didalam darah, jumlahnya mencapai 5 juta butir/
ml, trombosit jumlahnya 250.000 – 400.000 butir/ml dan lekosit 5.000 – 10.000 /ml.
Fungsi ketiga macam sel ini berbeda. Sel darah merah berfungsi mengikat dan
membawa oksigen dari paru- paru ke seluruh tubuh, serta membawa dan
melepaskan CO2 dari seluruh tubuh ke paru. Untuk itu SDM dilengkapi dengan
molekul khusus yang melaksanakan fungsi tersebut dan sekaligus memberi warna
merah pada darah, yaitu hemoglobin (Hb).
Hemoglobin adalah suatu protein dengan berat molekul 64.450 didalam
hemoglobin terdapat atom besi dalam keadaan tereduksi ( Fe 2+) . Dengan bantuan
Fe2+ ini hemoglobin dpat mengikat oksigen. Hemoglobin yang mengikat oksigen
disebut hemoglobin teroksidasi atau oksihemoglobin (HbO 2), sedang hemoglobin
yang sudah melepas oksigen disebut hemoglobin tereduksi atau deoksihemoglobin
(deoksiHb )
Peristiwa tersebut dapat dituliskan dengan reaksi sbb :
paru
Hb + O2 HbO2
jaringan
Atom besi dalam hemoglobin dapat teroksidasi bila muatan positif atom besi
menjadi 3+ (Fe3+). Hemoglobin dengan besi teroksidasi ( Fe3+) disebut
hemoglobin teroksidasi atau methemoglobin (metHb) atau Hb(Fe3+). Dalam
keadaan ini hemoglobin tidak dapat lagi mengikat oksigen. Hemoglobin yang
teroksidasi menjadi methemoglobin akan kehilangan fungsinya. Perubahan Hb
menjadi metHb dapat terjadi karena adanya senyawa pengoksidasi. Bila ini terjadi
dalam tubuh maka dapat timbul akibat yang fatal, misalnya karena pemberian obat-
obatan tertentu terutama pada orang yang berbakat untuk keadaan tersebut . Selain
itu hemoglobin juga dapat berikatan dengan suatu gas hasil pembakaran tidak
sempurna dari dari suatu bahan bakar yaitu CO (karbon monoksida ) sehingga
terbentuk HbCO . Ikatan hemoglobin dan CO ini 200 kali lebih kuat dari pada
ikatan Hb dengan O2 akibatnya hemoglobin tidak dapat lagi mengikat membawa
dan mendistribusikan O2.
Hemoglobin juga mempunyai sifat seperti enzim peroksidase, ini berarti
hemoglobin dapat mengkatalisis reduksi H2O2 bila ada suatu reduktor. Berbeda
dengan enzim pada hemoglobin sifat ini tidak hilang setelah pemanasan. Sifat ini

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 22

dapat digunakan untuk melacak adanya darah dalam suatu bahan uji. Sifat seperti
peroksidase ini disebabkan oleh adanya gugus hem dalam hemoglobin.
Sel darah merah seperti sel lainnya akan mengkerut dalam larutan dengan
tekanan osmotik yang lebih tinggi (hipertonik) dari tekanan osmotik plasma. Dalam
larutan dengan tekanan osmotik lebih rendah (hipotonik) maka SDM akan
membengkak karena cairan dari luar sel akan masuk kedalam sel dan kemudian
terjadi lisis membran (hemolisis). Hemoglobin dari SDM yang mengalami lisis larut
dalam plasma sehingga memberi warna merah pada plasma. SDM normal akan
mulai mengalami lisis bila dimasukkan dalam NaCl 0,48% dan pada larutan NaCl
0,33 % terjadi lisis sempurna. SDM juga dapat mengalami lisis oleh obat-obatan.
Struktur membran SDM mengandung lipid bi layer, bila SDM dimasukkan dalam
pelarut organik misalnya: eter, toluen, maka membran SDM akan mengalami lisis
karena larutnya lipid membran sehingga hemoglobin terlepas kedalam pelarutnya.
Hemoglobin dan derivat-derivatnya dapat dibedakan dengan menggunakan
spektroskop, yaitu berdasarkan perbedaan absorpsi warna-warna tertentu dari
cahaya putih. Bila suatu larutan berwarna diletakkan antara alat tersebut dan sumber
cahaya, akan terlihat daerah (pita) hitam pada spektrum dimana terjadi penyerapan
warna tersebut. Oksihemoglobin yang encer menunjukkan 3 pita absorpsi yaitu pita
sempit absorpsi cahaya pada panjang gelombang 578 nm, pita yang lebih lebar pada
542 nm, dan yang ketiga pada panjang gelombang 425 nm. Hemoglobin tereduksi
(deoksihemoglobin) sebaliknya hanya menunjukkan satu pita absorbsi lebar pada
559 nm. Bila pada darah ditambahkan zat peng oksidasi akan terbentuk
methemoblobin, dalam larutan asam, methemoglobin mempunyai satu pita absorpsi
dengan pusat pada panjang gelombang 634 nm. Hemoglobin karbon monoksida
menunjukkan dua pita absorpsi yang pertama pada 570 nm yang kedua pada 542
nm.

1. UJI OKSI-HEMOGLOBIN DAN DEOKSI-HEMOGLOBIN

Bahan:
Lar. NH4OH, darah dan pereaksi Stokes (20 g FeSO4 dan 30 g asam tartrat dalam air
sampai 1000 cc)
Metoda:
Encerkan 2 mL darah dengan kira-kira 6 mL air dalam sebuah tabung reaksi.
Campur dengan baik. Perhatikan warna merah terang dari oksi-hemoglobin yang

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 23

terbentuk. Bagilah dua isi tabung yang pertama digunakan sebagai kontrol tanpa
ditambahkan apa-apa. Pada tabung ke-2 masukkanlah 2 mL pereaksi Stokes dan
tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk.
Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat. Tambahkan beberapa tetes
larutan pereduksi tadi ke dalam tabung ke-2.Terlihat perubahan warna akibat
terbentuknya reduced hemoglobin. Bandingkan dengan warna oksi-hemoglobin.
Kocok tabung ini dengan kuat, maka akan terjadi oksigenasi dengan oksigen udara.
Deoksigenasi dan reoksigenasi dapat dilakukan berulang-ulang.Apa kesimpulan
percobaan ini? Peristiwa faal apa yang ditiru pada percobaan ini?

2. PENGARUH PELARUT ORGANIK PADA SEL DARAH MERAH

Metoda :
Isilah 6 tabung reaksi dengan 10 ml NaCl 0,9%. Tabung pertama digunakan sebagai
kontrol, dan pada kelima tabung lainnya isilah masing-masing 3 tetes kloroform,
eter, aseton, toluen dan alkohol. Lalu kepada 6 tabung tersebut tambahkan 2 tetes
eritrosit yang telah dicuci. Kocok dan biarkan selama setengah jam. Bandingkan
warna dengan kontrol.

3. PEMERIKSAAN ENZIM KATALASE DALAM DARAH

Prinsip :
Enzim katalase ada dalam darah dimana katalase akan memecah H2O2 menjadi air
dan O2, O2 diperlukan oleh tubuh, di klinik H2O2 digunakan untuk membersihkan
luka, O2 berfungsi untuk membunuh kuman-kuman anaerob, sedangkan air untuk
membersihkan luka.
Reaksi :
katalase
2 H2O2 2 H2O + O
Bahan :
H2O2 10 % , darah
Metoda :
2 – 3 tetes darah + 1 - 2 tetes H2O2
Hasil:
Reaksi positif maka akan tampak busa karena terbebasnya O2 oleh enzim katalase.

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 24

 SPEKTROFOTOMETRI

Spektrofotometri Serap adalah pengukuran serapan radiasi elektromagnetik

dengan panjang gelombang tertentu yang sempit, mendekati monokromatis.
Analisa spektrofotometri dapat dipakai untuk analisa kualitatif dan atau kuantitatif.
Pengukuran serapan dapat dilakukan pada daerah panjang gelombang :
- Ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 190 – 380 nm
- Cahaya tampak ( visible ) pada panjang gelombang 380 – 780 nm

Keuntungan metode ini :

-Dapat digunakan untuk analisa zat dalam jumlah kecil
-Pengerjaan cepat sederhana dan non destruktif

Teori :

1. Panjang gelombang ( λ )
Panjang gelombang cahaya didefinisikan sebagai jarak antara dua puncak dari
suatu gelombang, biasanya dinyatakan dengan symbol lamda ( λ )
Satuan panjang gelombang UV – VIS adalah nano meter ( nm)
1 nm = 1 mu = 10-9 m = 10-6 mm

Cahaya adalah merupakan campuran dari radiasi-radiasi yang mempunyai panjang

gelombang yang berbeda , yang dapat didespersikan oleh suatu monokromator
menjadi sinar yang monokromatis.

2. Warna
Warna cahaya dapat dilihat oleh mata manusia disebut sinar tampak (visible)
yang merupakan campuran dari sinar-sinar yang mempunyai panjang gelombang
400 – 700 nm
Seperti yang kita lihat pada pelangi

3.Transmitan dan Absorban

Transmitan adalah sinar yang diteruskan ( sinar yang di transmit)
Sedangkan Absorban adalah sinar yang diserap

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 25

Misalkan suatu sinar melalui kuvet (wadah sample dari kaca) maka sebagian sinar
ada yang di teruskan dan sebagian lagi diabsorpsi (di serap)

Sehingga secara matematik ada hubungan antara Transmitan (T) dan Absorban (A)
Hubungannya sebagai berikut :

A = 2 – log T A = Absorban
T = Transmitan (dalam %)

Contoh :
Bila T = 100 %
Maka A = 0

4. Hukum Lambert - Beer

Bila cahaya monokromatis melalui suatu larutan, jumlah cahaya yang diserap
sebanding /proporsional dengan kadar zat dalam larutan.

Secara matematis hokum Lambert – Beer dapat dirumuskan sebagai berikut :

A = k. c . l

A= serapan/absorbansi/optical density, yaitu jumlah cahaya yang diserap

K = koefisien ekstinsi /tetapan
C = kadar sample yang diperiksa
L = diameter kuvet/panjang larutan yang dilalui cahaya , mis = 1 Cm
Karena k dan l bilangan tetap , maka berarti A sebanding dengan c

5. Cara menjalankan spektrofotometer :

Petunjuk operasional secara terperinci dapat di ikuti sesuai dengan petunjuk /
manual dari intrumen :
Prosedur umum dalam menjalankan spektrofotometer adalah :
1. Periksa bahwa tidak ada kuvet dalam tempat kuvet
2. Nyalakan switch power ON
3. Pilih lampu yang sesuai : Deuterium (D2) untuk daerah UV atau Tungsten
untuk daerah visible (sinar tampak)
4. Atur panjang gelombang yang dikehendaki dengan memutar tombol
pengatur panjang gelombang (seperti memilih gelombang radio)
5. Periksa % T harus menunjuk angka 100 dengan memutar tombol yang ada
pada alat tersebut / A pada angka 0
6. Letakkan kuvet berisi blangko : dapat berisi akuadest/pelarut/pelarut tanpa
sample
Dan ukur A / A dibuat 0

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 26

 7. Isi kuvet dengan zat baku/standar, ukur A
8. Ganti kuvet isi zat baku dengan sample, ukur A
9. Hitung kadar sample dengan membandingkan antara A sample dengan A
standar
Kalikan kadar standar

Catatan : hidupkan spektrofotometer selama 10 menit lebih dahulu sebagai

pemanasan sehingga hasil lebih akurat

1. Pemilihan Absorbansi Maksimum

Absorbansi maksimum diperlukan untuk memperoleh puncak absorban

Cara kerja :
1. Atur Spektrofotometri pada λ 400 nm, dan T = 100 atau A = 0
2. Siapkan larutan Asam salisilat sebesar 50 ppm 2ml + 2 ml FeCl3 0,1% ,
Masukkan dalam kuvet dan periksa absorbansinya
3. Siapkan blangko 2 ml air + 2 ml FeCl3 0,1%
Masukkan dalam kuvet dan periksa absorbansinya
4. Geser panjang gelombang menjadi 410 - 420 – 430 - .... 550
(Lakukan cara kerja No 2 dan 3)
5. Untuk setiap menggeser panjang gelombang spektrofotometer dibuat
A = 0 atau A Cara kerja No 3 dibuat =0
6. Hitung A sampel = A No 2 – A No 3
7. Buat kurva pada kertas grafik hubungan antara A sampel dengan panjang
Gelombang, akan diperoleh A maksimum
Pada panjang gelombang inilah digunakan untuk analisa kuantitatif

2. Pembuatan Kurva baku

Lambert – Beer

Dasar :
Jumlah cahaya yang diserap oleh suatu zat pada panjang gelombang tertentu
sebanding dengan kadar zat zat tersebut dalam larutan.

Alat dan Pereaksi :

1. Spektronic –20/ yang lain
2. Larutan asam salisilat : 10 ppm , 20 ppm ., 30 ppm , 40 ppm , 50 ppm

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 27

 Atau deret konsentrasi yang lain dengan menghasilkan A antara 0,2 – 0,6

Cara kerja :
1. Siapkan 2 ml larutan asam salisilat dalam masing-masing tabung reaksi
dengan urutan konsentrasi seperti diatas
2. Tambahkan pada masing-masing tabung 2 ml FeCl3 0,1%
3. Baca serapan (A) tiap-tiap tabung pada panjang gelombang maksimum
sesuai percobaan (1)
4. Buat grafik hubungan antara serapan dengan kadar larutan, maka akan
menghasilkan kurva standar
5. Buat kurva standar dalam kertas grafik dalam laporan Hasil Praktikum

3. Pengukuran Kadar Sampel

Tujuan :
Menentukan kadar Bedak Salisil berisi 2% asam salisilat

Cara Kerja :
1. Timbang 100 mg bedak salisil
2. Tambahkan 10 ml alkohol, aduk – aduk kemudian saring
3. Tambahkan 15 ml alkohol lagi dan saring
4. Tambahkan air hingga 100 ml ( 20 ppm)
5. Abil 2 ml + 2 ml FeCl3 0,1 % pada panjang gelombang maksimum
6. Lakukan terhadap blangko 2 ml air + 2 ml FeCl3 0,1% pada panjang
gelombang
Maksimum
7. Hitung A sampel = A No 5 – A No 6
8. Hitung kadar sampel
Caranya : Masukkan harga A sampel pada kurva baku Lambert – Beer
Tarik garis menuju kurva, tarik garis lurus menuju kadar,
itulah
Kadar sampel
9. Hitung kesalahan analisa :
Kadar seharusnya – Kadar sampel diperoleh
Kesalahan = ----------------------------------------------------- X 100 %
=........%
Kadar seharusnya

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 28

 Sampel memenuhi syarat bila kesalahan maksimum 5%

Penuntun Praktikum Biokimia Blok 5 29