Deskripsi

Paten Amerika Serikat 3.420.741 METODE UNTUK PERSIAPAN ASAM SALICILIC Martin H. Rogolf, Highland
Park, Illinois., Penugasi ke International Minerals & Chemical Corporation, sebuah perusahaan New York
No Drawing. Lanjutan aplikasi Ser. 452.903, 3 Mei 1965. Aplikasi ini 29 Januari 1968, Ser. No. 701.134

Cl. A.S. 19528 11 Klaim Int. Cl. C12b 1/00 ABSTRAK PENGUNGKAPAN Dalam produksi fermentasi asam
salisilat di mana strain Pseudomonas dibudidayakan dalam media berair pada pH 5,5 hingga 8, medium
tersebut mengandung naftalena, sumber nitrogen yang dapat berasimilasi, dan sumber fosfor yang
dapat diasimilasi. Sesuai dengan ini produksi asam salisilat meningkat dengan mengubah proporsi
populasi sel Pseudomonas untuk mengakumulasi asam salisilat dalam medium selama fermentasi untuk
mengembalikan keseimbangan yang memberikan hasil asam salisilat yang meningkat.

Spesifikasi Aplikasi ini merupakan kelanjutan dari aplikasi Ser. 452.903, diajukan 3 Mei 1965, dan
sekarang ditinggalkan.

Penemuan ini berhubungan dengan metode yang ditingkatkan untuk pembuatan asam salisilat, dan lebih
khusus untuk metode yang ditingkatkan di mana hasil asam salisilat yang relatif tinggi secara
menguntungkan dihasilkan oleh fermentasi naftalena.

Asam salisilat adalah senyawa yang sangat berharga yang telah menemukan pemanfaatan luas di banyak
bidang teknologi kimia. Teknik-teknik yang sampai sekarang tersedia untuk pembuatan asam salisilat
umumnya mensyaratkan pemanfaatan sintesis kimia yang relatif terlibat di mana senyawa-senyawa
antara dikenai oksidasi yang dikatalisasi untuk menghasilkan asam hidroksi karboksilat aromatik yang
diinginkan. Meskipun teknik seperti itu biasanya menguntungkan menggunakan bahan awal yang relatif
murah dan tersedia, dengan pengecualian katalis, masalah katalis dan kontrol proses lainnya dengan
pengeluaran operasi dan investasi yang terkait telah agak mengurangi daya tarik komersial keseluruhan
dari metode ini. Lebih lanjut telah disarankan untuk memproduksi asam salisilat dengan fermentasi
bahan awal yang sesuai, seperti naftalena, dengan mikroorganisme. Pendekatan yang menggunakan
metode fermentasi, bagaimanapun, sampai sekarang belum memberikan hasil yang cukup tinggi dari
asam salisilat untuk membuat metode ini layak secara komersial. Dalam utama, produksi asam salisilat
maksimum sesuai dengan sekitar 15 miligram per mililiter kaldu fermentasi akhir telah diperoleh dalam
pendekatan fermentasi yang dijelaskan sebelumnya.
Karenanya, tujuan utama dari penemuan ini adalah untuk memberikan metode yang lebih baik untuk
pembuatan asam salisilat.

Merupakan tujuan tambahan dari penemuan ini untuk memberikan metode yang ditingkatkan untuk
memproduksi asam salisilat dengan fermentasi yang efisien dari bahan awal yang relatif murah dan
tersedia.

Tujuan lain dari penemuan ini adalah untuk memberikan metode yang ditingkatkan untuk pembuatan
asam salisilat dengan fermentasi naftalena dimana diperoleh hasil asam salisilat yang secara signifikan
lebih tinggi diperoleh daripada sampai sekarang yang diamati dalam proses fermentasi dengan tujuan
yang sama.

Tujuan selanjutnya dari penemuan ini adalah untuk menyediakan metode untuk pembuatan asam
salisilat dengan fermentasi naftalena dimana kontrol yang efisien dari produksi asam es salisilat dapat
diperoleh dengan pemeliharaan yang relatif sederhana dan / atau penyesuaian kondisi operasi.

Merupakan tujuan khusus dari penemuan ini untuk memberikan metode yang efisien dan relatif murah
untuk pembuatan asam salisilat di mana konversi naftalena menjadi asam salisilat dilakukan dengan
fermentasi naftalena dengan mikroorganisme yang menguntungkan memungkinkan pemanfaatan media
nutrisi yang murah dan yang dengan pemeliharaan yang relatif sederhana dan / atau penyesuaian
komposisi kaldu fermentasi memberikan produksi asam salisilat yang jauh lebih tinggi daripada teknik
fermentasi dengan tujuan yang sama di sini yang sebelumnya tersedia.

Dijelaskan secara luas, penemuan ini menyediakan metode untuk membuat asam salisilat yang terdiri
dari mengolah mikroorganisme yang merupakan strain penghasil asam salisilat Pseudomonas dalam
media nutrisi berair yang memiliki pH dalam kisaran dari sekitar 5,5 sampai sekitar 8 dan mengandung
naftalena, sumber nitrogen yang dapat berasimilasi, dan sumber fosfor yang dapat berasimilasi untuk
menghasilkan asam salisilat dalam kaldu fermentasi yang dihasilkan, dan setelah inisiasi produksi asam
salisilat tersebut, mengubah proporsi asam salisilat ke populasi sel mikroorganisme tersebut dalam kaldu
fermentasi yang dihasilkan menjadi suatu nilai yang menghasilkan peningkatan produksi asam salisilat
total lebih dari yang biasanya menghasilkan tidak adanya perubahan proporsi tersebut.

Dengan menggunakan metode penemuan ini asam salisilat dapat diproduksi dari naftalena dengan cara
yang sederhana, efisien dan ekonomis. Penemuan yang mendasari penemuan ini, yaitu, peningkatan
respons produksi asam salisilat dari galur Pseudomonas penghasil asam salisilat terhadap penyesuaian
yang tepat dari konsentrasi relatif asam salisilat (dibandingkan dengan populasi sel mikroorganisme)
selama fermentasi, menguntungkan memungkinkan peningkatan total produksi asam salisilat secara
signifikan dari naftalena yang akan diperoleh daripada yang sebelumnya dimungkinkan. Khususnya,
karena penggunaan penyesuaian komposisi kaldu fermentasi yang dijelaskan dan produksi asam salisilat
pemeliharaan 20 miligram per mililiter dan di atas dapat diperoleh dibandingkan dengan 5 sampai 15
miligram per mililiter yang dicapai dalam teknik fermentasi yang disarankan sebelumnya.

Penemuan ini merenungkan pemanfaatan setiap mikroorganisme penghasil asam salisilat dari genus
Pseudomonas. Contoh spesifik dari mikroorganisme tersebut meliputi, tanpa batasan, strain
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas salopia, Pseudomonas desmolytica,
Pseudomonas rathonis, Pseudomonas cruciviac, Pseudomonas da'chunac, dan Pseudomonas arvilla.
Mikroorganisme yang lebih disukai untuk pemanfaatan adalah Pseudomonas fluorescens, dilambangkan
oleh Pseudomonas fluorescens, Bioferm Strain No. 345-E, diisolasi dari air drainase parit minyak.

Media fermentasi yang digunakan dalam metode ini merupakan media yang mampu mendukung
pertumbuhan mikroorganisme yang diuraikan di atas dan yang terdiri dari naftalena, sumber nitrogen
yang dapat ditiru, dan sumber fosfor yang dapat berasimilasi.

Bahan baku naftalena yang digunakan dalam fermentasi proses ini yang sesuai dapat berupa naftalena
mentah atau olahan seperti fraksi naftalena yang diperoleh dari campuran hidrokrabon mentah seperti
minyak bumi, batu bara, minyak serpih, dan sejenisnya. Keuntungan khusus dari metode ini adalah
bahwa naftalena mentah yang mengandung pengotor seperti alkil naftalena, tiofena, benzthiofena,
kresol, dan sejenisnya, yang sesuai dapat digunakan tanpa pengorbanan yang berarti dalam produksi
asam salisilat yang dapat dicapai. Keuntungan ini terutama diwujudkan dalam perwujudan dimana
mikroorganisme penghasil asam salisilat 3 adalah Psudomonas fluorescens, Strain Bioferm No. 345-E.

Dalam medium fermentasi awal, konsentrasi naftalena umumnya dalam kisaran dari sekitar 0,4 sampai
sekitar 4% dan lebih tinggi, lebih disukai dari sekitar 0,5 sampai sekitar 2,5% berat total media. Dalam
perwujudan yang disukai dari metode ini, konsentrasi naftalena sepanjang fermentasi dipertahankan
pada kelebihan, yang umumnya sesuai dengan konsentrasi naftalena lebih dari sekitar 0,2% berat.
Akibatnya, sepanjang fermentasi naftalena tambahan secara terus menerus atau secara bertahap dapat,
dan lebih disukai, ditambahkan ke media pada tingkat rata-rata umumnya sekitar 0,050.15% per jam.
Sumber nitrogen asimilable yang sesuai dapat disediakan oleh zat nitrogen anorganik atau organik yang
secara konvensional digunakan dalam proses fermentasi. Contoh khusus dari bahan tersebut meliputi
amonia, urea, senyawa amonium seperti amonium hidroksida, amonium klorida, amonium nitrat,
amonium sulfat, amonium fosfat, dan sejenisnya, nitrat logam alkali dan logam alkali tanah, misalnya,
natrium, kalium, litium, kalsium, barium dan magnesium nitrat, bahan berprotein seperti bungkil kedelai,
bungkil biji kapas, kasein, ragi yang diautolisasi dan sejenisnya, dan hidrolisat dan ekstrak hidrolisat yang
mengandung nitrogen dari bahan yang mengandung protein tersebut. Bahan organik yang mengandung
nitrogen kompleks kurang disukai untuk pemanfaatan dengan sumber nitrogen yang disukai dipasok oleh
senyawa amonium anorganik, seperti amonium hidroksida.

Dalam media fermentasi awal, konsentrasi sumber nitrogen yang sesuai dapat bervariasi tetapi
umumnya berkisar dari sekitar 0,1 sampai sekitar 3% dan lebih tinggi, lebih disukai dari sekitar 0,5
sampai sekitar 1,5% berat total media.

Penemuan ini merenungkan pemanfaatan sumber fosfor anorganik atau organik apa pun yang dapat
berasimilasi. Contoh spesifik zat yang sesuai termasuk turunan fosfat anorganik seperti asam fosfat,
amonium fosfat, logam alkali, logam alkali tanah dan logam fosfat lainnya, seperti natrium, kalium,
kalsium, magnesium dan mangan fosfat dan hidrogen fosfat, dan bahan yang mengandung fosfat organik
seperti lesitin, nukleotida, asam fitat dan sejenisnya. Turunan fosfat anorganik merupakan sumber fosfor
yang disukai. Meskipun konsentrasi sumber fosfor yang sesuai dapat bervariasi, media nutrisi awal
umumnya mengandung dari sekitar 0,05 sampai sekitar 1% dan lebih tinggi, lebih disukai dari sekitar
0,075 sampai sekitar 0,2% berat sumber fosfor.

Media awal yang digunakan dalam metode ini juga sesuai dapat mengandung sejumlah kecil nutrisi
mineral sekunder yang umumnya berupa garam logam anorganik dalam bentuk klorida, nitrat, sulfat,
fosfat dan sejenisnya dari natrium, kalium, kalsium, magnesium, mangan, seng, besi, tembaga, kobalt
dan sejenisnya. Nutrisi sekunder tersebut dapat ditambahkan secara terpisah atau dapat hadir dalam
nutrisi kompleks yang digunakan sebagai sumber nitrogen dan / atau fosfor.

Media frementasi awal selanjutnya lebih disukai mengandung zat penyangga untuk menyesuaikan pH
awal ke suatu nilai dalam kisaran dari sekitar 5,5 sampai sekitar 8, lebih disukai sekitar 6,0 sampai sekitar
7,5. Zat penyangga yang sesuai meliputi kalsium karbonat, natrium hidrogen fosfat, kalium hidrogen
fosfat, amonium hidrogen fosfat, dan sejenisnya.
Dalam metode ini, media fermentasi awal yang sangat menguntungkan adalah sistem berair yang
mengandung naphthalene dari 0,5 sampai sekitar 2,5% berat, dari sekitar 0,5 sampai sekitar 1,5 berat
amunisi nium hidroksida, dari sekitar 0,075 sampai sekitar 0,2% berat asam fosfat berat. , dan kalsium
karbonat dalam jumlah untuk buffer medium ke pH dari sekitar 6,0 sampai sekitar 7,5.

Sesuai dengan metode ini, media nutrien berair awal yang sesuai awalnya diinokulasi dengan strain
mikroorganisme penghasil asam salisilat. Media nutrisi awal sebelumnya mungkin telah disterilkan tetapi
sterilisasi awal seperti itu tidak diperlukan. Jumlah inokulum yang digunakan dalam langkah inokulasi
yang sesuai dapat bervariasi tetapi umumnya berada dalam kisaran dari sekitar 1 sampai sekitar 10%
volume media fermentasi awal.

Inokulum yang sesuai dapat dibuat dengan teknik konvensional yang diketahui oleh orang yang ahli
dalam bidang fermentasi. Contoh persiapan inokulum yang memuaskan mencakup pemindahan kultur
mikroorganisme berumur 30 hingga 45 hari pada agar agar miring ke cc. media nutrisi steril dan
menginkubasi sampel pada sekitar 30 C. selama sekitar 72 jam dengan agitasi pada pengocok rotari.
Sekitar 5% volume kultur yang dihasilkan kemudian ditransfer ke 100 cc tambahan. dari media nutrisi
dan diinkubasi selama sekitar 48 jam pada sekitar 30 C. dengan agitasi dilanjutkan. Langkah terakhir
dalam preparasi inokulum kemudian dilakukan dengan mentransfer sekitar 2,5% volume kultur yang
dihasilkan ke lima galon medium nutrisi yang disangga hingga pH sekitar 6,8 hingga sekitar 7,2 dan
menginkubasi media yang dihasilkan sekitar 30 C untuk. 15 hingga 25 jam dengan aerasi terendam dan
dengan pH medium selama periode inkubasi dipertahankan sekitar 6,7 dengan penambahan natrium
hidroksida.

Setelah inokulasi media produksi fermentasi, mikroorganisme penghasil asam salisilat dibiarkan tumbuh
di bawah kondisi aerasi terendam untuk menghasilkan asam salisilat. Sesuai dengan metode ini,
fermentasi yang dihasilkan umumnya dilakukan pada suhu dalam kisaran dari sekitar 20 sampai 40 ° C,
lebih disukai dari sekitar 25 sampai 35 C. Oksigen, biasanya dalam bentuk udara, dimasukkan ke dalam
sistem. pada kelebihan konsumsi oksigen yang diamati yang umumnya memberikan laju umpan ke
sistem dalam kisaran dari sekitar 0,5 sampai sekitar 2 standar kaki kubik udara per menit. Agitasi sistem
yang sesuai dapat dilakukan oleh peralatan mekanis konvensional.

Selama fase awal pertumbuhan mikroorganisme dalam media nutrisi, peningkatan populasi sel
mikroorganisme dihadiri oleh penurunan konsentrasi masing-masing sumber naftalena, nitrogen, dan
fosfor dan peningkatan konsentrasi asam salisilat. Seperti ditunjukkan di atas, dalam perwujudan yang
disukai dari metode untuk mempertahankan konsentrasi naftalena pada tingkat yang lebih disukai,
naftalena tambahan, baik secara terus menerus atau sebentar-sebentar, ditambahkan ke medium. Tanpa
terhalang, pH kaldu fermentasi berkurang ketika fermentasi berlangsung karena produksi asam salisilat.
Lebih disukai, basa yang sesuai seperti natrium hidroksida, kalium hidroksida, atau amonium hidroksida
ditambahkan seperlunya untuk menjaga pH di atas sekitar 5,5 dan lebih disukai antara sekitar 6,0 dan
sekitar 7,5.

Dalam keadaan normal, telah diamati bahwa dalam fermentasi media fermentasi awal dengan galur
Pseudomonas penghasil asam salisilat, akumulasi asam salisilat diamati mencapai maksimum setelah
titik periode berikutnya di mana konsentrasi asam salisilat media sedang. tetap pada dasarnya konstan
atau bahkan berkurang. Pada kondisi yang dijelaskan di atas, puncak produksi asam salisilat tersebut
umumnya terjadi pada konsentrasi asam salisilat sekitar 15 miligram per mililiter media yang dihasilkan.
Telah ditemukan bahwa fenomena puncak seperti itu secara menguntungkan dapat dihindari dengan
mempengaruhi penyesuaian proporsi asam salisilat yang dihasilkan dalam kaldu fermentasi terhadap
total populasi sel mikroorganisme.

Dengan demikian, sesuai dengan metode ini, setelah dimulainya pertumbuhan mikroorganisme dan
menghadiri produksi asam salisilat dalam medium fermentasi, satu atau beberapa teknik yang dijelaskan
selanjutnya digunakan untuk memilih penyesuaian rasio konsentrasi asam salisilat yang sesuai untuk
populasi sel mikroorganisme dalam medium untuk memungkinkan produksi asam salisilat total melebihi
yang biasanya terjadi tanpa penyesuaian dalam komposisi kaldu fermentasi yang dihasilkan.

Metode ini dimaksudkan untuk membuat penyesuaian komposisi kaldu yang dijelaskan kapan saja
setelah dimulainya produksi asam salisilat. Penyesuaian yang sesuai dapat dilakukan baik sebelum atau
sesudah laju produksi asam salisilat dalam kaldu berkurang. Lebih disukai, penyesuaian sesuai dengan
metode ini dilakukan untuk mempertahankan medium dalam keadaan penghasil asam salisilat, lebih
disukai untuk mempertahankan medium dalam keadaan dimana produksi asam salisilat pada dasarnya
kontinyu dan setidaknya pada laju sekitar 0,1, lebih disukai paling tidak sekitar 0,3 miligram asam salisilat
per mililiter per jam. Dapat dipahami bahwa penyesuaian yang dijelaskan dalam komposisi kaldu, tentu
saja, dapat dilakukan secara berkala atau terus menerus.

Pemilihan teknik yang tepat untuk digunakan dalam mempengaruhi penyesuaian yang diperlukan dari
komposisi fermentasi tergantung pada sifat khusus kaldu di mana penyesuaian harus dilakukan. Hasil
akhir dari penyesuaian ini adalah untuk mempertahankan pertumbuhan sel penghasil asam salisilat pada
dasarnya dalam kaldu. Keseimbangan yang berlebihan dalam populasi sel mikroorganisme dibandingkan
dengan asam salisilat menghasilkan konsumsi asam salisilat oleh sel-sel yang tumbuh dalam kaldu. Di sisi
lain, kekurangan populasi sel dibandingkan dengan konsentrasi asam salisilat menyebabkan penghentian
pertumbuhan sel dan bahkan berkurangnya populasi sel yang layak. Dalam perwujudan yang lebih
disukai dari penemuan ini, pemeliharaan komposisi kaldu dilakukan untuk mencapai kaldu yang
mengandung dari sekitar 1 sampai 10 sel per mililiter dan menghasilkan asam salisilat pada laju dari
sekitar 0,3 sampai sekitar 0,6 miligram per mililiter per jam . Ciri khusus dari penemuan ini adalah bahwa
bahkan setelah akumulasi asam salisilat dalam kaldu telah mencapai nilai lebih dari sekitar miligram per
mililiter, laju produksi asam salisilat lebih dari sekitar 0,3, misalnya 0,4-0,6, miligram per mililiter per jam
dapat tercapai.

Dalam keadaan di mana suatu sistem pamungkas dicapai, atau akan diperoleh jika dibiarkan sendiri, di
mana pertumbuhan sel yang berkelanjutan adalah atau akan disebabkan oleh kelimpahan berlebihan
dalam populasi sel dibandingkan dengan konsentrasi asam salisilat, penyesuaian media yang diinginkan
dapat dilakukan dengan tepat. keluar dengan menghilangkan sebagian sel yang ada, suatu tambahan
pada medium asam salisilat asing atau suatu kombinasi darinya. Perwujudan di mana penyesuaian kaldu
harus dilakukan dengan cara seperti itu akan ditunjukkan dalam uji coba atau selama menjalankan aktual
dengan melanjutkan pertumbuhan sel disertai dengan penurunan akumulasi asam salisilat kaldu.
Penghapusan sebagian dari populasi sel mikroorganisme yang sesuai dapat dicapai dengan penyaringan
parsial, sentrifugasi dan resuspensi dan sejenisnya. Penyesuaian dengan penambahan asam salisilat yang
sesuai dapat dipengaruhi oleh penambahan nilai asam salisilat dalam bentuk asam salisilat bebas, asam
salisilat anhidrida, atau garam asam salisilat yang larut dalam air, misalnya amonium salisilat, natrium
salisilat, kalium salisilat, dan sejenisnya.

Jumlah tepat dari sel mikroorganisme yang perlu dihilangkan dan / atau asam salisilat yang perlu
ditambahkan dalam perwujudan khusus dari metode ini akan bervariasi tergantung terutama pada
media nutrisi tertentu dan strain mikroorganisme yang digunakan. Pencapaian penyesuaian komposisi
kaldu yang diinginkan dapat dibuktikan dengan kelanjutan atau dimulainya kembali dalam produksi asam
salisilat, tergantung pada kasusnya, tergantung pada apakah penyesuaian tersebut dilakukan
pendahuluan atau setelah penghentian dalam produksi tersebut.

Dalam kasus-kasus di mana kaldu fermentasi akhir yang diinginkan untuk disesuaikan sesuai dengan
metode dalam penemuan dikarakterisasi, atau akan dikarakterisasi jika tidak disesuaikan, dengan
kekurangan dalam populasi sel mikroorganisme dibandingkan dengan konsentrasi asam salisilat,
komposisi kaldu yang diperlukan penyesuaian dapat dilakukan dengan menambahkan komposisi nutrisi
pelengkap yang mendorong pertumbuhan sel ke dalam kaldu, menghilangkan asam salisilat dari kaldu,
atau kombinasi keduanya. Perwujudan di mana penyesuaian komposisi kaldu harus dilakukan dengan
cara seperti itu akan dimanifestasikan dalam uji coba atau selama menjalankan aktual dengan gangguan
dalam peningkatan populasi sel kaldu.

Dimana penyesuaian dilakukan dengan penambahan komposisi nutrisi pelengkap yang mempromosikan
pertumbuhan sel, nutrisi tersebut mengandung karbon yang dapat berasimilasi, nitrogen yang dapat
diasimilasikan, dan sumber fosfor yang dapat berasimilasi. Meskipun penyesuaian seperti itu secara
tepat dapat dilakukan dengan penambahan nutrisi yang digunakan dalam media fermentasi awal dan
penyesuaian tersebut dilakukan dalam perwujudan kontinyu tertentu, dalam perwujudan yang disukai
komposisi nutrisi komplementer yang ditambahkan pada titik ini dalam proses ini jauh lebih kaya dalam
sumber nutrisi yang diperlukan daripada yang awalnya digunakan untuk, pada dasarnya, memicu
pertumbuhan sel segera setelah penambahan mereka. Contoh spesifik dari nutrisi yang lebih kaya
tersebut meliputi, tanpa batasan, karbon, nitrogen, dan komposisi yang mengandung fosfor seperti
cairan curam jagung, trypticase, hydrolyzate kedelai, ekstrak ragi terhidrolisis, tepung endosperma biji
kapas, ekstrak daging sapi, dan sejenisnya.

Penghapusan alternatif asam salisilat yang sesuai dapat dilakukan dengan memasukkan ke dalam kaldu
untuk disesuaikan suatu zat yang merupakan penyerap atau penyerap untuk asam salisilat. Perwujudan
khusus dari bahan semacam itu termasuk tanah liat, karbon, zeolit, agar, agar-agar, lem, resin penukar
ion, dan sejenisnya. Jumlah tertentu nutrisi pemacu pertumbuhan sel yang perlu ditambahkan dan /
atau asam salisilat yang diperlukan untuk dihilangkan dalam perwujudan spesifik, tentu saja, akan
bervariasi tergantung, antara lain, pada medium nutrisi awal dan strain mikroorganisme tertentu yang
digunakan. Pencapaian penyesuaian kaldu yang diperlukan dapat dibuktikan dengan kelanjutan yang
sesuai atau dimulainya kembali pertumbuhan sel mikroorganisme tergantung pada ketepatan waktu
penyesuaian.

Sesuai dengan metode ini, periode waktu aktual yang terlibat dalam fermentasi perwujudan spesifik
akan bervariasi tergantung pada apakah penyesuaian komposisi kaldu yang dijelaskan dilakukan sebelum
atau setelah gangguan dalam pertumbuhan sel yang diinginkan atau produksi asam salisilat dan
selanjutnya pada jumlah kali penyesuaian tersebut dilakukan pada media awal tertentu. Penemuan ini
merenungkan perwujudan di mana proses dilakukan secara batch dengan satu atau lebih penyesuaian
komposisi kaldu yang dibuat dan perwujudan dimana proses dilakukan dengan memanfaatkan secara
tepat atau kontinyu umpan dari media nutrisi segar dan intermiten atau kontinyu penghilangan bagian-
bagian dari kaldu yang dihasilkan yang dihasilkan dengan penyesuaian komposisi kaldu yang dijelaskan di
atas dilakukan oleh salah satu atau kedua umpan nutrisi tersebut dan pemindahan bagian kaldu
tersebut. Dengan menggunakan salah satu atau kedua cara tersebut, produksi salisilat dengan akumulasi
asam salisilat yang berkelanjutan dalam kaldu dengan mudah dapat dilakukan pada dasarnya secara
kontinyu dalam metode ini selama periode waktu lebih dari sekitar 40 jam dan bahkan antara sekitar 70
dan sekitar jam dan lebih lama.

Dengan menggunakan penemuan ini, adalah menguntungkan untuk mengendalikan laju produksi asam
salisilat dan total produksi asam salisilat. Misalnya, laju produksi pada urutan lebih dari 0,4, misalnya 0,5-
1,3, asam salisilat miligram per mililiter per jam dapat dicapai dan kaldu produksi asam salisilat yang
mengandung jumlah asam salisilat berkisar hingga 20 kali lebih, misalnya, 25-30 , miligram per mililiter
dapat diperoleh.
Asam salisilat yang diproduksi dengan metode ini dapat diperoleh dari kaldu akhir atau bagiannya
dengan teknik apa saja yang sesuai. Contoh dari teknik semacam itu mensyaratkan pemusingan kaldu
yang mengandung asam salisilat untuk menghilangkan sel dan sejenisnya, dan mengekstraksi cairan yang
dihasilkan setelah didinginkan dengan pelarut organik seperti aseton, alkohol, atau eter. Metode
semacam itu sudah tersedia dalam literatur.

Metode penemuan ini telah dijelaskan di atas secara terperinci, contoh-contoh berikut disajikan untuk
memperlihatkan perwujudan spesifik tambahannya. Contoh-contoh diberikan hanya untuk tujuan
ilustrasi dan bukan dengan cara pembatasan.

Dalam prosedur eksperimental yang dilakukan dengan memperoleh data yang dilaporkan dalam contoh,
percobaan dilakukan dengan membudidayakan Psuedomonas fluorescens, Bioferm Strain No. 345-13,
dalam 500 cc. kocok labu yang mempekerjakan 100 cc. media nutrisi awal atau dalam liter aduk stoples
menggunakan dua liter media nutrisi awal.

Dalam labu kocok menjalankan medum berair yang digunakan mengandung sekitar 2% naftalena, sekitar
0,6% amonium klorida, sekitar 0,75 kalsium karbonat, sekitar 0,005% besi sulfat heptahidrat, sekitar
0,0038% L-glisin, dan sekitar 0,000l% kalsium pantotenat, yang terakhir dua bahan ditambahkan sebagai
zat penstabil. Inokulum yang digunakan adalah kultur lama 72 jam yang ditransfer dari media yang
serupa dalam jumlah sekitar volume. Labu diinkubasi pada sekitar 30 C. pada pengocok rotari yang
beroperasi pada sekitar 250 rpm. dengan 2 "pukulan vertikal.

Dalam pengujian yang dilakukan dalam toples pengaduk 5 liter media berair awal yang digunakan
memiliki komposisi sebagai berikut:

Bahan: Konsentrasi, persen berat Naphthalene 2.0 NH Cl 0,6 CaCO 0,75 FeSO -7H O 0,005 MgSO 0,05
MnCl 0,02 K HPO 0,15 KH2'PO4 Inokulum yang digunakan adalah kultur 72 jam yang diperoleh dari labu
kontrol yang dijalankan dalam jumlah sekitar 5% volume. Media diaduk dengan pengaduk vertikal yang
dioperasikan sekitar 200 rpm. dan udara dipaksa masuk ke medium dengan laju sekitar 0,6 std. cu. ft per
menit. Temperatur medium dipertahankan pada sekitar 30 ° C dan pH dipertahankan sekitar 6,5 sampai
7,2 dengan penambahan natrium hidoksida.

Konsentrasi sampel asam salisilat ditentukan dengan menambahkan satu ml. dari 1% Fe (NH SO 'l2H O
dalam asam asetat 5% sampai 9 ml dari sampel fermentasi yang diencerkan. Warna ungu yang dihasilkan
dibaca pada 530 mg pada spektrofotometer Coleman. Konsentrasi asam salisilat ditentukan dari kurva
standar diperoleh dari jumlah asam salisilat yang diketahui.

Kecuali dinyatakan sebaliknya, semua persentase yang diberikan dalam contoh adalah berdasarkan
berat.

Contoh I Untuk menentukan pertumbuhan mikroorganisme normal dan karakteristik penumpukan asam
salisilat, dijalankan dalam tabung pengaduk 5 liter dilakukan seperti yang dijelaskan di atas tanpa
perubahan komposisi kaldu fermentasi, dan konsentrasi asam salisilat dari kaldu yang dihasilkan adalah
ditentukan pada berbagai interval waktu. Hasil dari un ini dinyatakan di bawah ini dalam Tabel 1.

TABEL 1 Konsentrasi asam salisilat- Jam waktu fermentasi: trasi mg. per ml. 0 O 18 3.5 24 6 48 12.7 72 14
17 96 17 17 144 16.5 16.5

Data di atas menunjukkan bahwa dalam keadaan normal tanpa pemeliharaan atau perubahan dalam
komposisi kaldu fermentasi yang diperoleh, akumulasi asam salisilat dalam kaldu mencapai maksimum
dan kemudian diamati mencapai maksimum dan tampak sedikit menurun, yang menunjukkan konsumsi
dari asam pada tahap akhir fermentasi.

Contoh II Untuk menunjukkan efek pada produksi asam salisilat yang dicapai dengan penyesuaian dan
pemeliharaan kaldu fermentasi sesuai dengan metode penemuan ini, prosedur Contoh I diulangi dengan
pengecualian (a) yang pada awalnya memberi tambahan total 0,05 % Jagung curam cair ke dalam media
nutrisi selama 17 jam pertama untuk menyebabkan kelebihan sel mikroorganisme yang diperoleh
(dibandingkan dengan proporsi populasi sel yang memungkinkan akumulasi asam salisilat) dan (b)
setelah kelebihan seperti didirikan, yaitu, setelah sekitar 90 jam, menambahkan 10 mg. per ml. natrium
salisilat ke sistem non-akumulasi asam salisilat. Hasil tes ini dinyatakan di bawah dalam Tabel 2.

TABEL 2 Konsentrasi asam salisilat- Jam waktu fermentasi: trasi mg. per ml.

1 Sodium salisilat ditambahkan.

Data di atas menunjukkan bahwa penyesuaian proporsi sel dalam sistem dengan asam salisilat yang ada
sesuai dengan metode penemuan secara efektif mengubah kaldu fermentasi dari keadaan tidak
terakumulasi asam salisilat menjadi keadaan di mana akumulasi asam salisilat setelahnya diamati. .

Contoh III Untuk menentukan efek pada produksi asam salisilat karena cara lain menyesuaikan komposisi
kaldu fermentasi sesuai dengan metode penemuan ini, prosedur umum dari Contoh I diulangi lagi
dengan pengecualian menambahkan perlahan ke fermentasi. kaldu larutan nutrien pelengkap pelengkap
berair (N) yang mengandung sekitar 0,75% ekstrak ragi dan sekitar 0,75% trypticase setelah fermentasi
berjalan sekitar 48 jam, konsentrasi asam salisilat yang diamati telah menjadi sangat konstan, dan
populasi sel yang layak dari kaldu adalah diamati menurun dengan cepat. Hasil yang diperoleh dalam tes
ini ditunjukkan di bawah pada Tabel 3.

TABEL 3 Total nutrisi (N) ditambahkan (mililiter) Konsentrasi asam salisilat. OUTS Data di atas
menunjukkan bahwa dalam fermentasi asam salisilat sistem yang berada dalam keadaan asam non-
akumulasi asam salisilat karena proporsi asam salisilat yang terlalu besar dibandingkan dengan populasi
sel dapat dikonversi menjadi keadaan akumulasi asam salisilat dengan penambahan nutrisi
komplementer.

Contoh IV. Untuk menunjukkan efek pada produksi asam salisilat dengan menggunakan teknik lain dari
penemuan ini untuk mempengaruhi penyesuaian konsentrasi kaldu fermentasi, dua rangkaian lintasan
dilakukan dalam labu shake seperti dijelaskan di atas. Dalam satu set run yang digunakan sebagai
kontrol, berbagai jumlah ekstrak ragi ditambahkan ke masing-masing sampel dan setelah 48 jam
konsentrasi asam salisilat kaldu yang dihasilkan ditentukan. Set berjalan kedua sebaliknya identik dengan
set pertama dengan pengecualian bahwa sekitar 2% agar berat kering awalnya ditambahkan ke masing-
masing sampel untuk menyerap sebagian asam salisilat yang diproduksi dalam fermentasi. Pada akhir 96
jam, jumlah total asam salisilat yang diserap oleh agar-agar dan hadir dalam kaldu dari masing-masing
sampel ditentukan. Hasil-hasil ini dinyatakan di bawah ini dalam Tabel 4.

TABEL 4 Agar kering Ragi Asam salisilat, mg./ml.

ditambahkan, ekstrak,

persen persen Dalam kaldu dalam agar Total Data yang ditunjukkan pada Tabel 4 dengan jelas
menunjukkan bahwa penyesuaian efektif yang tepat dari komposisi kaldu fermentasi sesuai dengan
metode ini dengan menghilangkan asam salisilat secara signifikan meningkatkan total akumulasi asam
salisilat dalam sistem yang disesuaikan.

Jelas bagi mereka yang ahli dalam bidang ini bahwa modifikasi lain dapat dibuat dalam metode
penemuan ini tanpa menyimpang dari semangatnya. Dengan demikian, dapat dipahami bahwa
penemuan ini dimaksudkan hanya dibatasi oleh ruang lingkup klaim terlampir.

Perwujudan dari penemuan di mana properti eksklusif atau hak istimewa diklaim diklaim sebagai
berikut:

1. Dalam metode untuk memproduksi asam salisilat yang terdiri dari menumbuhkan mikroorganisme
yang merupakan strain penghasil asam salisilat Pseudomonas, dalam media nutrisi berair yang memiliki
pH dalam kisaran dari sekitar 5,5 hingga sekitar * 8 dan mengandung naftalena, nitrogen yang dapat
berasimilasi. sumber, dan sumber fosfor berasimilasi untuk menghasilkan asam salisilat dalam media
yang dihasilkan, dimana setelah inisiasi produksi asam salisilat populasi sel mikroorganisme tersebut
dalam media fermentasi meningkat dan laju produksi asam salisilat dalam medium fermentasi tidak
meningkat, peningkatan yang terdiri dari peningkatan proporsi asam salisilat terhadap populasi sel dari
organisme tersebut dalam jumlah yang cukup untuk meningkatkan laju produksi asam salisilat dalam
media fermentasi yang diubah yang dihasilkan.

2. Metode sesuai dengan klaim 1 di mana proporsi asam salisilat terhadap populasi sel dalam medium
ditingkatkan dengan menambahkan asam salisilat ke dalam medium.

3. Metode sesuai dengan klaim 2 di mana laju produksi asam salisilat dalam medium di bawah sekitar 0,3
miligram per mililiter per jam pada saat asam salisilat ditambahkan ke medium.

4. Metode sesuai dengan klaim 3 di mana mikroorganisme tersebut adalah Pseudomonas fluorescens
dan mengikuti penambahan asam salisilat ke dalam medium, mikroorganisme tersebut dibiakkan dalam
media yang diubah untuk menyediakan media di mana total akumulasi asam salisilat sekurang-
kurangnya sekitar 20 miligram per mililiter.

5. Metode sesuai dengan klaim 1 di mana proporsi asam salisilat terhadap populasi sel dari organisme
tersebut meningkat dengan menghilangkan sebagian sel dari organisme tersebut dari medium.
6. Metode sesuai dengan klaim 5 di mana laju produksi asam salisilat dalam medium di bawah sekitar 0,3
miligram per mililiter per jam pada saat sebagian sel dari organisme tersebut dikeluarkan dari medium.

7. Metode sesuai dengan klaim 6 di mana mikroorganisme tersebut adalah Pseudomonas fluorescens
dan mengikuti perubahan media fermentasi tersebut, organisme tersebut dibudidayakan dalam media
yang diubah untuk menyediakan media di mana akumulasi total asam salisilat sekurang-kurangnya 20
miligram per mililiter.

8. Dalam metode untuk menghasilkan asam salisilat yang terdiri dari menumbuhkan mikroorganisme
yang merupakan strain penghasil asam salisilat Pseudomonas, dalam media nutrisi berair yang memiliki
pH dalam kisaran dari sekitar 5,5 hingga sekitar 8 dan mengandung naftalena, sumber nitrogen yang
dapat diasimilasi. , dan sumber fosfor yang dapat berasimilasi untuk menghasilkan asam salisilat dalam
media yang dihasilkan, di mana setelah inisiasi asam salisilat tersebut. Memproduksi populasi sel dari
mikroorganisme tersebut dalam medium tersebut telah berhenti meningkat secara substansial,
peningkatan yang terdiri dari pengurangan proporsi asam salisilat ke Populasi sel dari organisme tersebut
dalam medium tersebut dalam jumlah yang cukup untuk meningkatkan laju produksi asam salisilat
dalam medium fermentasi yang diubah dengan secara efektif menghilangkan sebagian asam salisilat dari
medium tersebut.

9. Metode sesuai dengan klaim 8 di mana laju produksi asam salisilat dalam medium di bawah sekitar 0,3
miligram per mililiter per jam pada saat penghilangan asam salisilat.

10. Metode sesuai dengan klaim 9 di mana asam salisilat dihilangkan secara efektif dari perantara
penambahan adsorben untuk asam salisilat ke dalam media.

11. Metode sesuai dengan klaim 10 di mana mikroorganisme tersebut adalah Pseudomonas fluorescens
dan mengikuti perubahan tersebut dari media fermentasi tersebut, mikroorganisme tersebut
dibudidayakan dalam medium yang diubah tersebut untuk menyediakan suatu media di mana total
akumulasi asam salisilat adalah sekurang-kurangnya 20 miligram per mililiter.