PEMBAHASAN

Optimasi Sistem KCKT

Sebelum uji penetapan kadar paracetamol dan kafein terlebih dahulu dilakukan
optimasi sistem KCKT. Optimasi dilakukan untuk mencari sistem KCKT yang optimum dengan
kondisi yang seefektif dan seefisien mungkin. Optimasi sistem KCKT dilakukan untuk melihat
daya elusi dan waktu retensi yang diperoleh. Fase gerak yang digunakan dalam elusi
menggunakan fase terbalik, yaitu campuran antara asam asetat glacial dan metanol dengan
perbandingan (70 : 30) dan fase diam yang digunakan adalah C18. Fase gerak ditentukan
dengan mempelajari buku literatur serta jurnal-jurnal hasil penelitian senyawa parasetamol
dan kafein. Alasan penggunaan HPLC fase terbalik ini dikarenakan parasetamol dan kafein
merupakan senyawa yang bersifat polar, sehingga fase gerak yang digunakan harus bersifat
polar dan fase diamnya harus bersifat non polar, supaya pemisahan dapat dilakukan dengan
baik. Proses elusi dilakukan dengan cara isokratik dimana elusi dengan menggunakan
komposisi fase gerak yang sama tanpa ada perubahan perbandingan fase gerak yang
digunakan.
Sistem kromatografi fase terbalik, memiliki daya elusi (eluent strenght) yang
berbanding terbalik dengan kepolaran fase gerak. Semakin lemah kepolaran fase gerak
maka akan semakin besar daya elusinya. Pada sistem KCKT fase terbalik, fase diam C18
bersifat non polar sehingga pada kondisi ini apabila suatu campuran yang terdiri dari
beberapa senyawa dielusi pada kolom C18 dengan fase gerak yang polar, senyawa yang
relatif non polar cenderung tertahan di kolom sehingga waktu retensinya lebih panjang
dibandingkan senyawa lain yang relatif lebih polar. Penggunaan kolom C18 karena kolom ini
memiliki gugus oktadesil silika (ODS atau C18) yang mampu memisahkan senyawa-senyawa
dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.
Penetapan Kadar Sampel
Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan kadar parasetamol dan kafein dalam
sampel obat dengan instrumen HPLC. Sampel obat yang digunakan adalah jenis obat sakit
kepala yaitu oskadon. Adapun prinsip dasar dari HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) pada praktikum kali ini adalah adanya perbedaan koefisien distribusi
antara komponen fasa gerak dan fasa diam.
Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fasa gerak HPLC yaitu:
jernih, murah, mudah diperoleh, dan tidak kental. Sebelumnya, pada fase gerak dilakukan
proses degassing menggunakan sonikator. Proses degassing dilakukan untuk
menghomogenkan dan menghilangkan gelembung-gelembung gas pada larutan induk
karena dengan adanya gas dalam larutan sampel dapat menghambat pergerakan eluen
sehingga terganggunya pemisahan pada kolom karena larutan sampel tidak merata dan
akan menyebabkan terjadinya pelebaran puncak kromatogram. Selain itu, penghilangan gas
ini juga diperlukan untuk menghindari noise pada detektor terutama fase organik berair.
Fasa diam yang digunakan dalam HPLC harus tahan terhadap tekanan tinggi, karena apabila
digunakan struktur dengan pori yang besar akan mudah rusak. Hal ini disebabkan
menurunnya permeabilitas akibat tekanan tinggi.
 Pada pemeriksaan kadar paracetamol dan kofein pada sampel obat, tablet yang
digunakan diambil minimal 20 tablet dari batch yang sama. Hal ini dimaksudkan untuk
memenuhi unsur keterwakilan dari seluruh tablet yang diproduksi dalam industry pada
batch yang sama. Setelah penimbangan, dilakukan pembuatan larutan sampel dan dilakukan
pengenceran. Pengenceran filtrat dengan aquabides dimaksudkan untuk membuat
konsentrasi lebih kecil lagi dan mudah dianalisis karena masih berada di dalam range kurva
kalibrasi larutan standar. Untuk membebaskan larutan sampel dari kotoran partikulat maka
larutan standar tersebut disaring dengan selulosa nitrat dan dihomogenkan dengan
ultrasonik vibrator. Digunakan membran selulosa nitrat untuk menyaring karena komponen
yang akan dipisahkan (parasetamol dan kafein) bersifat polar.
Alat HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu dengan panjang
gelombang 270 nm, laju alir 1mL/menit. Pada saat memasukan larutan standar maupun
larutan sampel tidak terlalu banyak cukup dengan 20 mikoliter, karena jika terlalu banyak
dapat menyebabkan band broadening (pelebaran peak) dan pada saat memasukan cuplikan
pada syringe tidak ada gelembung udara agar menghasilkan pemisahan yang baik. Sebelum
digunakan, syringe harus dibilas dengan mengunakan metanol agar terbebas dari kotoran.
Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan menggunakan
alat injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal karet), cuplikan yang masuk
kemudian dialirkan oleh fasa gerak dengan bantuan pompa. Dalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut
terhadap fasa diam. Solute yang kuat interaksinya dengan dengan fasa diam akan tertahan.
Parasetamol yang sifatnya lebih polar akan terelusi lebih dulu sehingga memiliki waktu
retensi yang lebih singkat dibandingkan dengan kafein. Setelah keluar dari kolom maka akan
dideteksi oleh detector yang kemudian direkam dalam bentuk kromatogram yang
menghasilkan puncak.
Dalam pengelusian, parasetamol terelusi lebih awal dengan waktu retensi lebih
pendek yaitu ..... menit dibandingkan kafein yaitu ..... menit. Kepolaran dapat dilihat dari
struktur senyawanya dimana parasetamol hanya memilki satu ikatan CH3 sementara kafein
memiliki tiga ikatan CH3. Oleh karenanya, senyawa-senyawa kafein akan menghabiskan
dalam kolom lebih lama dan mempunyai waktu retensi yang besar. Sementara, molekul
parasetamol dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama
dengan pelarut sehingga akan keluar terlebih dahulu dan mempunyai waktu retensi yang
kecil. Detektor yang digunakan pada peralatan HPLC ini adalah spektrofotometer UV, yaitu
karena ada gugus kromofor pada sampel.
Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel
parasetamol dan kafein dengan larutan standar. Waktu retensi larutan standar untuk
parasetamol adalah .... menit sedangkan pada sampel untuk parasetamol waktu retensinya
adalah .... menit. Sementara waktu retensi larutan standar untuk kafein adalah ..... menit
sedangkan pada sampel untuk kafein waktu retensinya adalah .... menit. Analisis kuantitatif
dari pengukuran diperoleh dari luas area peak dalam kromatogram yang memiliki waktu
retensi sama.
 Pelebaran puncak kromatogram dapat terjadi karena adanya difusi zat padat di
dalam kolom tidak seragam dan kepadatannya tidak merata sehingga komponen sampel
berjalan tidak mulus, panjang jalan yag dilalui sampel tidak merata. Selain itu, juga bisa
terjadi transfer massa karena pengaturan laju alir yang tidak tepat sehingga ada komponen
yang tertinggal didalam kolom.
Pada percobaan ini, untuk menentukan kadar parsetamol dan kafein dalam sampel
obat diperlukan deret larutan standar parasetamol dan kafein dengan berbagai konsentrasi
untuk membuat kurva kalibrasi. Setelah didapat luas area untuk masing-masing konsentrasi,
dibuat kurva kalibrasi dengan memplotkan konsentrasi terhadap luas area dan didapat garis
lurus. Dari pengolahan data percobaan, diperoleh kadar parasetamol yaitu sebesar 91,1%
dan kadar kafein 21,8%. Untuk kadar parasetamol sesuai dengan ketentuan Farmakope
Indoesia, sedangkan untuk kadar kafein tidak sesuai, dimana Farmakope Indonesia
mensyaratkan kadar tidak boleh kurang dari 90 % dan tidak lebih dari 110%.
Kesalahan-kesalahan yang dapat mempengaruhi hasil adalah perubahan tekanan
dan suhu saat proses pemisahan HPLC serta kurangnya ketelitian praktikan. Adanya
perubahan tekanan dan suhu akan menyebabkan pemisahan tidak berjalan sempurna.
Kurangnya ketelitian saat pembuatan deret larutan standar ataupun dalam perhitungan juga
mampu mempengaruhi hasil sehingga harus diminimalisir. Selain itu, penginjeksian sampel
harus benar-benar dipastikan tidak ada gelembung yang diakibatkan dari mobilitas partikel
karena dapat menyebabkan pemisahan yang kurang baik.