Nama : Antin Putri Utami

NIM : 150332601725

Pertanyaan untuk sekuensing DNA dan videonya.

Download dan simak video pada link berikut:

Video 1: https://www.youtube.com/watch?v=bEFLBf5WEtc

Video 2: https://www.youtube.com/watch?v=CP1fTcKB3TI

kemudian dengan juga menyimak tayangan di file ppt tentang sekuensing, jawablah
pertanyaan-pertanyaan berikut

1. a. Apa yang dimaksud dengan sekuensing DNA?

b. Mengapa suatu DNA perlu di sekuensing?
2. Misalkan dingiinkan untuk mensekuens suatu fragmen DNA berikut (X adalah
nukleotida yang belum diketahui):
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCGGTAC3’
a. Alat dan bahan-bahan apa saja yang diperlukan? Dan perannya masing-masing?
b. Jelaskan Tahapan Percobaan Sekuensing DNA tersebut secara rinci (boleh secara
manual atau secara automatik)
c. Berapa pita yang terbentuk setelah elektroforesis?
3. Sebutkan 3 macam persamaan dan 5 macam perbedaan antara sekuensing manual dan
sekuensing otomatis

Jawaban !

1. a. Sekuensing DNA adalah teknik/proses untuk mengurutkan nukleotida penyusun

suatu DNA
b. Suatu DNA perlu di sekuensing :
 Untuk mengidentifikasi gen
 Untuk mengetahui kekerabatan antar organisme
 Untuk mendesain primer dalam PCR
2. Untuk mensekuens suatu fragmen DNA berikut (X adalah nukleotida yang belum
diketahui):
5’XXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCGGTAC3’
a. Alat yang digunakan yaitu PCR (Polymerase Chain Reaction). Bahan-bahan yang
diperlukan pada PCR yaitu:
 Template DNA : berisi target yang akan diamplifikasi / diperbanyak
 25mM MgCl2 : sebagai kofaktor esensial untuk taq DNA polymerase
 Taq DNA Polymerase : enzim yang membantu mengkatalisasi
polimerisasi deoksinukleotida menjadi untai DNA
 Primer 1 dan 2 : primer adalah urutan untai DNA tunggal yang dirancang
untuk menentukan lokasi fragmen DNA target. Diperlukan dua primer
untuk mengamplifikasi fragmen DNA target. Satu primer akan menempel
pada bagian awal dan primer lainnya pada bagian akhir.
 2mM dNTP mix : campuran nukleotida, sebagai blok untai DNA yang
baru
 10x PCR buffer : menciptakan lingkungan untuk aktivitas optimum taq
DNA polymerase
b. Tahapan percobaan sekuensing DNA tersebut secara rinci (boleh secara manual
atau secara automatik) adalah :
 Tahap peleburan atau denaturasi : Pada tahap ini (berlangsung pada
suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan
DNA menjadi untaian tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR, tahap ini
dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua untai
DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap
menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini selama 1–2
menit.
 Tahap penempelan atau annealing : Primer menempel pada bagian
DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu
antara 45–60 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini selama 1–2 menit.
 Tahap pemanjangan atau elongasi : Suhu untuk proses ini tergantung
dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses
ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
c. Pita yang terbentuk setelah elektroforesis yaitu 25 pita
3. Tiga macam persamaan dan lima macam perbedaan antara sekuensing manual dan
sekuensing otomatis
 Tiga macam persamaan antara sekuensing manual dan sekuensing otomatis :
1.
 Lima macam perbedaan antara sekuensing manual dan sekuensing otomatis :
1. Pada sekuensing manual dNTP yang berbeda (terminator) yaitu ddGTP,
ddCTP, ddATP dan ddTTP dimasukkan masing-masing ke dalam 4
tabung yang berbeda, sedangkan pada sekuensing otomatis dNTP yang
berbeda (terminator) dimasukkan dalam 1 tabung
2. Hasil perpanjangan primer pada sekuensing manual yaitu ddA,ddC, ddT,
dan ddG. Pada hasil perpanjangan sekuensing otomatis yaitu A, C, T, dan
G
3. Primer yang digunakan pada sekuensing manual berupa primer yang
radioaktif, sedangkan pada sekuensing otomatis tidak digunakan primer
yang radioaktif melainkan primer fluoresens
4. Pada sekuensing manual digunakan Gel Elektroforesis dimana zat yang
akan dielektroforesis diletakkan pada sumur-sumur, dialiri listrik dan
terjadi pemisahan berdasarkan berat molekul DNA. Pada sekuensing
otomatis digunakan Genetic Analyzer, zat yang diuji dimasukkan ke
dalam 96 well plate
5. Hasil sekuensing manual berupa fragmen DNA yang diberi X-ray,
sedangkan hasil sekuensing otomatis adalah puncak dari intensitas
fluoresens versus waktu