BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan suatu materi yang terdapat pada tubuh
manusia dan semua makhluk hidup yang diwarisi secara turun temurun. Semua sel pada
tubuh memiliki DNA yang sma dan sebagian besar terdapat pada nukleus. Struktur
DNA terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. Informasi yang
dibawa oleh DNA bergantung pada urutan basa nitrogen yang terdiri dari Adenin (A),
Timin (T), Guanin (G), dan Sitosin (C). Basa pada DNA selalu berpasangan yaitu A-T
dan G-C. masing-masing pasangan basa melekat pada molekul gula (deoksiribosa) dan
fosfat membentuk unit nukleotida. Nukleotida tersusun berpasangan pada baris panjang
yang berbentuk spiral yang sering disebut double helix.
Memasuki abad ke-20, ditemukan penemuan-penemuan baru tentang biologi
molekular. Pada awal abad ini pula, diketahui bahwa setiap makhluk hidup
menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya,
bahwa setiap makhluk hidup menggunakan kode genetik yang sama untuk membuat
proteinnya. Pada saat itu pula, para ilmuwan-ilmuwan di bidang teknologi ini, berpikir
mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi sedemikian rupa sehingga bisa
didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan yang diinginkan.
Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan, munculah ilmu yang mempelajari
mengenai pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan
molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang
yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan atau biasa disebut rekayasa genetika.
Teknologi ini memungkinkannya diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam
waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional serta
memadukan sifat dari dua jenis organisme yang berbeda (organisme transgenik).
Setelah diketahui bahwa molekul DNA merupakan materi genetik yang
menentukan sifat suatu organisme, dan sel bakteri dapat menerima DNA asing secara
spontan, beberapa peneliti segera melakukan penelitian untuk melakukan manipulasi
terhadap sifat-sifat genetik dari beberapa jenis sel. Berbagai penelitian telah dilakukan
untuk memasukkan DNA asing kedalam sel bakteri, sel jamur, sel tanaman dan sel

1
hewan. Namun demikian, pada tahap pertama manipulasi tersebut banyak yang
mengalami kegagalan. Hal ini disebabkan karena hanya sedikit spesies bakteri yang
dapat menerima DNA secara spontan. Sebagian besar spesies bakteri, sel hewan dan sel
tanaman tidak dapat menerima DNA asing secara spontan. Selain itu DNA asing yang
telah berhasil masuk ke dalam sel hanya mampu bertahan apabila dapat bereplikasi
secara otonom, atau dapat terintegrasi kedalam kromosom hospesnya. (Radji, M., 2011)
Modifikasi genetik suatu organisme baru bisa dilakukan sejalan dengan
penemuan dan pengembangan berbagai teknik dalam biologi molekuler. Antara lain
teknik isolasi dan pemurnian DNA, penemuan enzim restriksi endonuklease, enzim
DNA polimerase dan DNA ligase, penemuan DNA plasmid dan teknik transfer DNA,
teknik deteksi DNA, teknik pemetaan gen, dan teknik kultivasi. (Radji, M., 2011)

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut:
1. Apakah yang dimaksud DNA rekombinan?
2. Perangkat apa sajakah yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan?
3. Bagaimanakah teknik teknologi DNA rekombinan?
4. Apakah manfaat dari teknologi DNA rekombinan?

1.3. Tujuan Penulisan

Tujuan yang hendak dicapai dalam penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui
pengertian dari DNA rekombinan, perangkat dan teknik yang digunakan dalam
teknologi DNA rekombinan serta manfaat dari aplikasi teknologi DNA rekombinan.

1.4. Manfaat Penulisan

Makalah ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai berikut :
1. Bagi mahasiswa dapat melatih keterampilan dan kemampuan dalam membuat
karya tulis ilmiah.
2. Bagi pembaca dapat menambah sumber informasi tentang teknologi DNA
rekombinan.

BAB II
PEMBAHASAN

2.1. Pengertian DNA Rekombinan

Menurut Cohen dan Boyer (1980: DNA rekombinan (rDNA) adalah bentuk DNA
buatan yang dibuat dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang tidak akan

2
biasanya terjadi bersama-sama. Dalam hal modifikasi genetik, itu adalah diciptakan
melalui pengenalan DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang ada, seperti
plasmid bakteri, untuk kode untuk atau mengubah sifat berbeda untuk tujuan tertentu,
seperti resistensi antibiotik (News Medical.Net).
Robert (2009) mengatakan bahwa DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami
perubahan karena penyisipan suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak
terdapat dalam molekul DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi.
Rekayasa genetika adalah serangkaian teknik untuk memodifikasi dan merekomendasi
gen dari berbagai organisme yang berbeda yang juga disebut teknologi DNA
rekombinan.
Rekayasa genetika adalah serangkaian teknik untuk memodifikasi dan
merekomendasi gen dari berbagai organisme yang berbeda yang juga disebut teknologi
DNA rekombinan (Mae-wan Ho, 2008).

Gambar 2.1 Gambar DNA

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah
yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di
dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai
kloning gen.
Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA
rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan

3
bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang
baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel
organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Rekayasa genetika dapat memberikan
hasil yang sangat menguntungkan. Sebagai contoh pasien yang menderita diabetes tidak
mampu membentuk hormon insulin untuk mengatur kadar gula dalam darah. Oleh
karena itu, pasien membutuhkan suntikan insulin sebagai tambahan. Dengan teknik
rekayasa genetika, para peneliti berhasil memaksa mikroorganisme (bakteri) untuk
membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia (suryo, 2001).

2.2. Perangkat Teknologi DNA Rekombinan

Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya:
a. Enzim restriksi untuk memotong DNA
Enzim restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA
pada situs spesifik. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan
memotong hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim
restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di
antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari
deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil
pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end).
b. Enzim ligase untuk menyambung DNA dan vektor untuk menyambung dan
mengklonkan gen di dalam sel hidup
Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya
dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai
“gunting” untuk memotong DNA pada situs spesifik dan DNA ligase yang
berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul DNA di dalam tabung
reaksi. Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen
DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector.
DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan
bagian pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling
berkomplemen.
c. Transposon sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan
penanda
Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa
fragmen DNA, baik DNA kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel.

4
 Transformasi bakteri mula-mula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada
tahun 1982, berdasarkan kenyataan bahwa suatu bakteri dapat melepaskan
fragmen DNA-nya ke dalam suatu medium yang kemudian akan masuk ke
dalam sel bakteri yang lain dalam kultur tersebut.
d. Pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan
e. Enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan RNA
f. Pelacak DNA atau RNA untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang
diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar.

2.3. Teknik Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan meliputi beberapa teknik, yaitu :
2.3.1 Teknik untuk mengisolasi DNA
Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan
dinding sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan
cara enzimatis. Setelah perusakan sel telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah
pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik,
serta deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat
(SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan
melakukan sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak serta
organel target yang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan
pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alkohol.
Molekul DNA yang sering digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
adalah DNA plasmid dan DNA genom yang berasal dari sel bakteri.
a. Isolasi dan Purifikasi DNA Genom
Pada dasarnya isolasi DNA genom dari sel bakteri terdiri dari beberapa
tahap yaitu:
1. Kultivasi sel dalam media yang sesuai
2. Pemecahan dinding sel
3. Ekstraksi DNA genom
4. Purifikasi DNA
Pemecahan dinding sel bakteri dilakukan secara fisik misalnya dengan
cara sonikasi, maupun dengan cara kimia yaitu dengan menggunakan enzim
lisozim, etilen diamin tetra asetat (EDTA), atau kombinasi dari keduanya.
Pada kondisi tertentu pemecahan dinding sel cukup dilakukan dengan
lisozim dan EDTA, akan tetapi sering ditambahkan bahan lain yang dapat
melisiskan dinding sel antara lain deterjen triton X-100 atau sodium dedosil
sulfat (SDS). Setelah sel mengalami lisis, tahap selanjutnya adalah

5
memisahkan debris sel dengan cara sentrifugasi. Komponen sel yang tidak
larut diendapkan dengan sentrifugasi sehingga meninggalkan ekstrak sel
dalam supernatan yang jernih. (Radji, M., 2011; Thermo Scientific, 2009)
Tahap akhir dari isolasi DNA adalah proses pemurnian DNA. Disamping
DNA, ekstrak sel mengandung protein dan RNA dalam jumlah yang cukup
besar. Umumnya cara pemurnian DNA dilakukan dengan penambahan
larutan fenol atau campuran fenol dan kloroform dengan perbandingan 1:1,
untuk mengendapkan protein dengan cara di sentrifugasikan dan
dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah
dibersihkan dari protein masih tercampur dengan RNA sehingga perlu
ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA
yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara “presipitasi
+
etanol”. Dengan adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na ), pada
o
suhu -20 C etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga
mudah dipisahkan dengan cara sentrifugasi. (Radji, M., 2011; Thermo
Scientific, 2009)
Pada isolasi dan purifikasi DNA sel total yang berasal dari sel eukariot,
misalnya sel tanaman atau sel hewan, walaupun pada dasarnya tahapan
isolasi dan purifikasinya sama, namun memerlukan suatu modifikasi cara
isolasi sehubungan dengan sifat-sifat khusus dari sel yang digunakan.
Modifikasi yang sering dilakukan adalah pada proses pemecahan sel
eukariot. Senyawa kimia yang digunakan untuk memecah sel bakteri tidak
selalu dapat digunakan untuk memecah sel tanaman maupun sel hewan.
Untuk memecah sel tanaman dibutuhkan ezim-enzim degeneratif yang
spesifik dan sering dikombinasi dengan cara pemecahan dinding sel secara
fisik antara lain menggunakan butiran-butiran gelas. Sedangkan untuk
mengisolasi DNA total dari sel hewan yang tidak memiliki dinding sel
umumnya hanya digunakan deterjen untuk memecah membran sel dan
membran nukleusnya. (Radji, M., 2011)

b. Isolasi dan Purifikasi DNA Plasmid

6
 Isolasi dan purifikasi DNA plasmid dari sel bakteri pada dasarnya sama
dengan cara isolasi DNA genom. Sel bakteri yang mengandung DNA
plasmid dibiakkan dan dipanen. Sel bakteri dilisiskan dengan penambahan
deterjen dan enzim lisozim, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan
debris sel dengan ekstrak sel. Proses selanjutnya adalah memisahkan protein
dan RNA dari DNA plasmid. Namun demikian terdapat perbedaan penting
dalam isolasi DNA plasmid dengan isolasi DNA genom. Isolasi DNA
plasmid memperhatikan keberadaan DNA genom yang berasal dari sel
bakteri. Pemisahan antara DNA plasmid dengan DNA genom sangat penting
untuk dilakukan apabila DNA plasmid akan digunakan sebagai vektor
kloning. Adanya sedikit kontaminasi DNA genom bakteri dalam jumlah
kecil pun dapat mempengaruhi keberhasilan kloning DNA. (Radji, M.,
2011; Thermo Scientific, 2009)
Beberapa cara untuk menghilangkan DNA genom pada pemurnian DNA
plasmid telah banyak dikembangkan. Cara pemisahan DNA plasmid dengan
DNA genom pada prinsipnya berdasarkan ukuran dan konformasinya.
Ukuran DNA plasmid sangat kecil bila dibandingkan dengan ukuran DNA
genom. Ukuran DNA plasmid yang terbesar, kurang dari 8% ukuran DNA
genom bakteri, dan sebagaian besar DNA plasmid berukuran lebih kecil
daripada ukuran tersebut. Dengan demikian teknik yang dapat memisahkan
molekul DNA yang kecil dengan DNA yang berukuran besar akan sangat
efektif untuk memisahkan DNA plasmid. (Radji, M., 2011)
Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan DNA plasmid
dengan DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient
densitas. Teknik sentrifugasi gradient densitas etidium bromida sesium
klorida, yang berkecepatan tinggi, merupakan cara yang sangat efektif untuk
memperoleh DNA plasmid murni. Dengan teknik tersebut DNA plasmid
akan membentuk pita pada titik tertentu yang terpisah dengan pita genom,
dimana protein akan mengapung pada permukaan gradient, dan RNA akan
berada pada dasar tabung. Posisi pita-pita DNA dalam tabung bisa terlihat
melalui pendaran etidium bromida yang disinari dengan ultra violet. DNA
plasmid dapat diambil dengan menusukkan jarum suntik pada dinding
tabung dimana pita DNA plasmid terlihat dan menyedotnya. Sedangkan

7
 etidium bromida yang terikat pada DNA plasmid dapat diekstraksi dengan
n-butanol, dan CsCl dihilangkan dengan cara dialisis. Teknik pemisahan ini
dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat digunakan sebagai
vektor kloning. (Radji, M., 2011)

2.3.2 Teknik untuk memotong DNA

Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk
mencegah agar tidak merusak DNA. Selain itu strain tersebut juga mempunyai
suatu sistem modifikasi yang menyebabkan pemutusan basa pada urutan tertentu
yang merupakan recognition sites bagi enzim restriksi tersebut. Pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim restriksi ini harus
menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel dalam arti setiap fragmen
DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA vektor yang sudah berbentuk
linier.
Pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease.
Enzim andonuklease restriksi ditemukan pada tahu 1960 oleh Werner Arber dan
Hamilton Smith, yang diisolasi dari mokroorganisme. Secara alamiah bakteri
menghasilkan enzim endonuklease untuk mempertahankan dirinya dari
keberadaan DNA asing yang masuk kedalam sel bakteri. Jika ada DNA asing
masuk kedalam sel bakteri melalui proses transfer genetik yang terjadi secara
alamiah, misalnya virus bakteriofag, maka akan mempertahankan dirinya dari
keberadaan DNA asing tersebut, sel bakteri melepaskan enzim endonuklease yang
dapat memotong DNA asing pada situs yang sangat spesifik dan restriktif. Oleh
sebab itu enzim tersebut dikenal dengan nama “enzim endonuklease restriksi”.
(Radji, M., 2011)
Enzim endonuklease restriksi yang sangat selektif dalam memotong untai
DNA sangat bermanfaat bila diaplikasikan pada teknologi DNA rekombinan.
Setiap enzim mengalami rangkaian 4-8 pasang basa tertentu yang terdapat dalam
untai DNA. Bagian atas situs pada molekul DNA yang dikenali oleh enzim
endonuklease restriksi dikenal sebagai situs pemotongan enzim. Rangkaian-
rangkaian situs pemotongan DNA oleh enzim ini apabila terdapat dalam genom
bakteri itu sendiri, biasanya dilindungi dengan adanya gugus metil pada residu
basa adenine (A) dan sitosin (C), sehingga tidak dapat dipotong oleh enzim
endonuklease yang dihasilkan oleh bakteri sendiri. Setiap enzim endonuklease

8
 restriksi memiliki situs pengenalan pemotongan yang berbeda dan sangat spesifik.
(Radji, M., 2011)
Enzim endonuklease restriksi yang berbeda, memiliki situs pemotongan
yang berbeda, namun ada beberapa jenis enzim endonuklease restriksi yang
diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pemotongan yang sama. Enzim-
enzim endonuklease restriksi yang memiliki situs pemotongan yang sama disebut
isochizomer. (Radji, M., 2011)
Sekuens basa DNA pada situs pemotongan memiliki urutan basa yang sama
pada untai DNA heliks ganda, yang dikenal dengan sekuens palindromik.
Misalnya enzim EcoRI, yang diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun
1969 dari Escherichia coli yang memotong DNA pada bagian antara basa G dan A
pada sekuens GAATTC. Hasil pemotongan enzim endonuklease restriksi ada dua
macam yaitu menghasilkan ujung tumpul (blunt) dan ujung lengket (sticky) atau
kohesif. (Radji, M., 2011).
Enzim yang memotong molekul DNA heliks ganda tidak berhadapan
langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket,
sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan
ujung tumpul. (Radji, M., 2011).

Gambar 2.2. Situs pemutusan DNA oleh enzin restriksi endonuklease

Pada gambar dibawah dapat dilihat misalnya enzim restriksi EcoRI,memotong

molekul DNA pada urutan heksa-nukleotida 5’—GAATTC—3’ pada posisi antara basa

9
G dan A. demikian pula pada urutan polindromiknya 3’—CTTAAG—5’ enzim EcoRI,
juga memotong pada posisi antara basa A dan G. dengan demikian molekul DNA heliks
ganda yang terpotong oleh enzim EcoRI, menghasilkan fragmen restriksi dengan kedia
ujung yang lengket.

EcoRI
Gambar 2.3. Situs pemutusan DNA oleh enzim restriksi endonuklease EcoRI

Beberapa jenis enzim antara lain misalnya AluI menghasilkan fragmen restriksi
yang tumpul kerena memotong DNA heliks ganda tepat ditengah antara basa C dan G.
dewasa ini banyak enzim endonuklease restriksi yang telah dimurnikan dan diproduksi
secara komersial yang dapat mengenali sekuens nukleotida yang berlainan.

Perkiraan Pemotongan
Panjang dari sekuens pengenalan memengaruhi seringnya enzim restriksi
memotong DNA dalam ukuran tertentu. Misalnya pada enzim yang memiliki panjang 4
basa, enzim ini diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida. Perhitungan
tersebut diperoleh dengan mengasumsikan setiap basa mempunyai kemungkinan yang
sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika
sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi: (1/4)6 =
1/4096. Perhitungan ini hanya sebagai perkiraan, pada kenyataannya belum tentu
demikian. Beberapa sekuen bisa jadi lebih sering atau lebih jarang ditemui dalam suatu
organisme. Seperti pada mamalia, sekuen CG sangat jarang ditemui sehingga enzim
HpaII yang mempunyai sekuen pengenalan CCGG akan lebih jarang memotong pada
DNA mamalia. (Metzenberg, S., 2002)

10
 Enzim restriksi yang mempunyai sekuen pengenalan yang pendek akan
menghasilkan banyak potongan DNA; sedangkan jika mempunyai sekuen pengenalan
yang panjang, akan dihasilkan potongan DNA yang lebih sedikit. Baik enzim yang
mempunyai sekuen pemotongan pendek maupun panjang, mempunyai fungsi masing-
masing dalam rekayasa genetika (Metzenberg, S., 2002).
Beberapa enzim yang sering digunakan dalam laboratorium dibagi menjadi tiga
berdasarkan perkiraan pemotongan:
1. 6-cutters
Ezim restriksi yang tergolong dalam 6-cutters memiliki situs pemotongan yang
spesifik pada 6 nukleotida. Ezim ini cocok digunakan untuk pekerjaan kloning
sehari-hari karena enzim ini sering memotong satu atau dua situs pada plasmid,
namun jarang memotong bagian penting seperti titik asal replikasi (origin of
replication) atau gen resisten ampisilin. Contoh enzim 6-cutters adalah HindIII
(A↓AGCTT) yang memotong genom bakteriofage λ (48 kbp) pada 7 situs
(Metzenberg, S., 2002).
2. 8-cutters
Enzim restriksi ini mempunyai situs pengenalan sepanjang 8 nukleotida; cocok
digunakan untuk membentuk kromosom menjadi potongan-potongan yang
spesifik dalam ukuran yang besar. Sebagai contoh: PacI (enzim 8-cutters)
memotong-motong kromosom E. coli menjadi 20 bagian, sedangkan BamHI
(enzim 6-cutters) memotong
sekitar 300 bagian. Jika langsung menggunakan enzim 6-cutters, maka fragmen
yang dihasilkan terlalu kecil dan banyak. Untuk itu digunakan enzim 8-cutters
terlebih dahulu, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan enzim 6-cutters
(Metzenberg, S., 2002).
3. 4-cutters
Enzim restriksi ini cocok untuk percobaan yang menginginkan pemotongan
pada beberapa situs yang potensial. Contohnya: jika ingin mengumpulkan
fragmen DNA secara acak, dan pada potongan tersebut terdapat gen yang
diinginkan; dapat dilakukan digestsi parsial (partial digestion) menggunakan
enzim 4-cutters. (Metzenberg, S., 2002)

2.3.3 Teknik untuk menggabungkan atau menyambungkan DNA

11
 Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan
dengan menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan
menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag
T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase. Serta dengan pemberian enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang
selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

2.3.4 Teknik untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup

Tahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik
dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul molekul DNA dengan
menggunakan teknik elektroforesis. Hasil dari penyambungan ini dimasukkan ke
dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dalam hal ini pada
campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada
sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama
lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan
transformasi. Sehingga diharapkan sel inang mengalami perubahan sifat tertentu
setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
Tahap selanjutnya adalah seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Oleh
karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan,
maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang
membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang
membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan
sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan
dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak
(probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi
polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Transfer molekul DNA rekombinan ke dalam sel merupakan tahap yang
penting pada teknologi DNA rekombinan. Beberapa spesies bakteri yang sering
digunakan dalam industri bioteknologi antara lain adalah Bacillus subtilis,
Eschericia coli, Saccharomyces cerevisiae. (Radji, M., 2011)

12
 Proses transfer DNA rekombinan kedalam sel hospes tergantung pada jenis
vektor yang digunakan. Beberapa cara transfer DNA adalah:
1. Transformasi
Teknik ini digunakan apabila vektor yang dipakai adalah plasmid DNA.
Dapat ditransformasikan kedalam sel inang dengan cara:
a. Induksi kimia menggunakan perlakuan kejut panas kejut panas (heat
shock) dengan CaCl2 pada suhu 42oC dalam waktu 90 detik. Adanya ion
Ca2+ dapat menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri
sehingga plasmid DNA rekombinan yang berada dalam biakan sel
bakteri akan masuk kedalam sel bakteri yang dinding selnya lebih
permeabel. (Radji, M., 2011)

b. Elektroporasi
Permeabilitas dinding sel bakteri dapat ditingkatkan dengan cara
menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat. DNA dan
sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang
kemudian ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu
yang sangat singkat sekitar 4-5 detik. Dibawah medan listrik ini dinding
sel bakteri dipaksa terbuka dengan sendirinya, sehingga DNA dapat
masuk kedalam sel bakteri kedalam lubang yang terbentuk tersebut.
Teknik ini dapat menyebabkan sebagian besar sel bakteri mati, namun
sel yang bertahan hidup akan menerima DNA. Dewasa ini elektroporasi
sering digunakan untuk transfer DNA karena prosesnya lebih cepat.
(Radji, M., 2011)
c. Konjugasi

Proses ini umumnya terjadi secara alamiah diantras sel bakteri

melalui pili bakteri. Pada transfer DNA melalui konjugasi diperlukan
jenis plasmid khusus yang disebut dengan plasmid konjugatif. Apabila
sel bakteri memiliki plasmid tersebut (sel donor) bertemu dengan
bakteri yang tidak memiliki plasmid (sel penerima), maka akan terjadi
agregasi sel dari keduanya. Pada saat itu akan terjadi transfer plasmid
dari sel donor ke dalam sel penerima. (Radji, M., 2011)
Manipulasi terhadap plasmid konjugatif dapat dilakukan untuk
membuat plasmid konjugatif membawa molekul DNA rekombinan

13
 yang dikehendaki sehingga dapat ditransfer kepada sel bakteri lain
melalui kontak antar sel bakteri. Salah satu cara teknik konjugasi
khusus yang berhasil dilakukan adalahh teknik konjugasi menggunakan
bakteri Agrobacterium tumefaciens yang mengandung plasmid
konjugatif yang disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing). (Radji,
M., 2011)
2. Transfeksi
Transfer DNA melalui proses ini apabila vektor yang digunakan adalh virus
bakteriofag. DNA rekombinan yang akan ditransfer dikemas terlebih dahulu
dalam kapsid bakteriofag, kemudian diinfeksikan kedalam sel penerima. Proses
transfer DNA melalui transfeksi ini menyerupai proses infeksi oleh virus yang
terjadi secara alamiah. Replikasi dan propagasi akan meningkatkan jumlah DNA
rekombinan. (Radji, M., 2011)
3. Mikroinjeksi
Teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA secara langsung kedalam sel
menggunakan jarum suntik yang merukuran sangat kecil atau mikro. Umumnya
teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel hewan atau sel
tanaman, karena sel tersebut berukuran relative lebih besar daripada sel bakteri.
DNA rekombinan yang akan ditransfer diinjeksikan lengsung kedalam nucleus sel
penerima. (Radji, M., 2011)
4. Mikroprojektil
Teknik ini umumnya digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel atau
jaringan tanaman. Partikel DNA ditembakkan langsung dengan suatu alat
penembak khusus langsung kedalam sel tanaman. Dewasa ini terdapat berbagai
jenis alat penembak gen, salah satu jenisnya antara lain adalah pistol penembak
gen (Radji, M., 2011).

2.4. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan

Pengembangbiakan gen-gen rekombinan dan ekspresinya dalam bentuk produk-
produk protein oleh Eschrechia coli atau sel khamir yang dapat ditumbuhkan dalam
jumlah yang tak terbatas memberikan kemungkinan memproduksi protein-protein
secara komersial yang mempunyai kegunaan praktis. Kemungkinan ini mendorong
timbulnya bidang rekayasa genetika. Dalam permasalahan tersebut teknik DNA
rekombinan dan metode pengembangbiakan memainkan peranan yang sangat penting

14
(Albert, 1982). Berbagai riset DNA rekombinan banyak diaplikasikan secara praktis
dalam berbagai bidang, diantaranya :
2.4.1 Bidang Kedokteran
Gen-gen bagi beberapa protein yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran
yang dibutuhkan dalam bidang kedokteran yaitu pembuatan insulin manusia oleh
bakteri Eschrechia coli untuk pengobatan penyakit diabetes. Dahulu insulin
didapatkan dari kelenjar pancreas sapid dan babi. Untuk membuat hanya 0,45 kg
insulin hewan itu, yang dibutuhkan oleh 750 pasien diabetes selama satu tahun,
diperlukan 3.600 kg kelenjar yang berasal dari 23.000 ekor hewan. Laporan dari
Kementrian Kesehatan Pendidikan dan Kesejahteraan (HEW = Health Education
and Welfare) Amerika Serikat, dalam tahun 1981 diperlukan 56 juta hewan
untuk memenuhi kebutuhan insulin Amerika serikat. Melalui teknik DNA
rekombinan (rekayasa genetika), para peneliti berhasil memaksa bakteri untuk
membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia dan ini bahkan lebih baik
dibandingkan insulin yang dihasilkan sapi dan babi yang dapat diterima oleh
tubuh manusia. Selain itu, dengan cara yang sama teknologi DNA rekombinan
mempunyai peran dalam pembuatan vaksin (misalnya hepatitis B), produksi
hormon pertumbuhan dan lain sebagainya.

2.4.2 Bidang Pertanian

Beberapa manfaat rekayasa genetika dalam bidang pertanian diantaranya :
a. Mengganti pemakaian pupuk nitrogen yang banyak dipergunakan tapi mahal
harganya, oleh fiksasi nitrogen secara alamiah. Bakteri tanah Rhizobium sp
dapat mengadakan infeksi ke dalam akar dari tanaman family Leguminosae.
Infeksi ini menghasilkan bintil akar dan bakteri yang terdapat di dalamnya
dapat mengikat zat lemas bebas dari udara untuk di ubahnya menjadi
nitrogen yang dapat diambil dan digunakan oleh tanaman tersebut.
b. Teknik DNA rekombinan mengusahakan tanaman-tanaman (terutama yang
mempunyai arti ekonomi) yang tidak begitu peka terhadap penyakit yang
disebabkan oleh bakteri, jamur dan cacing.
c. Mengusahakan tanaman-tanaman yang mampu menghasilkan peptisida
sendiri.

2.4.3 Bidang Peternakan

a. Telah diperoleh vaksin-vaksin untuk melawan penyakit mencret ganas yang
dapat mematikan anak-anak babi

15
 b. Sudah dipasarkan vaksin yang efektif terhadap penyakit kuku dan mulut,
yaitu penyakit ganas dan sangat menular pada sapi, domba, kambing, rusa
dan babi.

2.4.4 Bidang industri

Penelitian rekayasa genetika di bidang industry sedang meningkat dengan cepat.
Berbagai usaha yang telah giat dilakukan misalnya :
a. Menciptakan bakteri yang dapat melarutkan logam-logam langsung dari
dalam bumi.
b. Menciptakan bakteri yang dapat menghasilkan bahan kimia.
c. Menciptkan bakteri yang dapat menghasilkan bahan mentah kimia seperti
etilen yang diperlukan untuk pembuatan plastik.

BAB III
PENUTUP
3.1 Simpulan
Berdasarkan pembahasan dari penulisan makalah ini, maka dapat disimpulkan
bahwa :

16
 1. DNA rekombinan adalah DNA yang mengalami perubahan karena penyisipan
suatu sekuens deuksinukleotida yang sebelumnya tidak terdapat dalam molekul
DNA yang sudah ada dengan cara enzimatik atau kimiawi
2. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, melibatkan upaya
perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya.
3. Teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan meliputi teknik untuk
mengisolasi DNA, teknik pemotongan, teknik untuk menggabungkan atau
menyambungkan DNA, serta teknik transformasi.
4. Berbagai riset DNA rekombinan banyak diaplikasikan secara praktis dalam
berbagai bidang, diantaranya dalam bidang kedokteran, pertanian, perikanan
dan industri.

3.2 Saran
Makalah ini masih jauh dari sempurna, sehingga diharapkan pembaca mencari
literatur-literatur yang uptodate dan menggunakan jurnal internasional terbaru.

DAFTAR PUSTAKA

Berg, H. C. (2003). E. coli in Motion. Springer: USA.Kayser, O., dan Muller, R.H.
(2004). Pharmaceutical Biotechnology; Drug Discovery and Clinical
Applications. Willey-VCH: German.

Edi, Syahmi. 2014. Pengantar Bioteknologi. Medan: FMIPA UNIMED

Freshney, R. I. (n.d.). Culture of Animal Cells; A Manual of Basic Technique. Wiley.

17
Muladno. (2010). Teknologi rekayasa Genetika. IPB Press: Bogor.

Old, R.W., dan Primrose, S.B. (2003). Prinsip-prinsip Manipulasi Gen; Pengantar
Rekayasa Genetika (penterjemah: Herawati Susilo). UI Press: Jakarta.

Radji, M. (2011). Rekayasa Genetika; Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung Seto:
Jakarta.

Smith, John E. 1990. Prinsip Bioteknologi. Jakarta: Gramedia.

Subra, Rao. 1994. Rekayasa Genetika. Jakarta: UI-Press Sudjadi. (2008). Bioteknologi
Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta.

Walsh, G. (2007). Pharmaceutical Biotechnology; Concepts and Application. Wiley:

England.

Watson, J. D., Tooze, J., dan Kurtz., D. (2003). DNA Rekombinan (penterjemah:
Wisnu Gunarso). Erlangga: Jakarta.

Welsh, James R.1991. Dasar-Dasar Genetika dan Pemuliaan Tanaman. Jakarta:

Erlangga.

Thermo Science. (2009). Thermo Scientific Pierce Cell Lysis Technical Handbook;
Featuring Cell Lysis Reagent and Detergents, Ver.2.

18