Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi

Posted on 22 November 2010 by belalangtue

Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi

Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen
yang Terpotong

Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA olimerase, ligase, enzim
yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease. Nuklease merupakan enzim yang
memotong molekul DNA dengan memutuskan ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan
nukleotida berikutnya. Jenis nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease.
Endonuklease merupakan nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan
fosfodiester. Hasil pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada
urutan tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens yang
akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim restriksi endonuklease
tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya tidak tepat pada sekuens yang
diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease tipe II dapat memotong tepat atau dekat
dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1). Berikut adalah Gambar 1. Pemotongan molekul
DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease tipe I, II, dan III

Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI diisolasi dari E. coli dan
memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’- GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim
restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung blunt atau
flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung
sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease berbeda.

Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded sedangkan ujung sticky atau
cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai
DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’
yang menggantung.

Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat ditentukan berapa
besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. Teknik ini tergantung
oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat
dipisahkan dengan cara elektroforesis yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang mengandung gen atau
segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern hybridization. Adapun tahapannya
yaitu:

1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran nilon.
2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer dengan
DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida sintetik.
Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan autoradiography.