PCR

Siklus PCR
“Perbanyakan potongan DNA secara in
vitro pada daerah spesifik yang dibatasi
oleh dua buah primer oligonukleotida”

Tahapan PCR:
1. Denaturasi DNA (92-95oC)
2. Penempelan oligonukleotida
primer (45-60oC)
3. Perpanjangan primer (68-72oC)
Waktu  panjang fragmen
Perbanyakan DNA:
Komponen PCR: secara eksponensial
• DNA templat (DNA untai ganda)
• Sepasang primer
• Campuran dNTP (dATP, dGTP,
dTTP dan dCTP)
• Enzim DNA polimerase termostabil
• Buffer
• Mg+2

Primer: oligonukleotida untai pendek

yang urutannya komplemen dengan
salah satu rantai, dan arahnya Hasil akhir tergantung:
berlawanan dengan primer pasangannya Profil Reaksi
Tahap Reaksi
Komposisi dan konsentrasi templat,
templat ‘GC rich’ lebih sulit di PCR
karena terbentuknya struktur sekunder
pada temperatur annealing shg
membutuhkan prosedur tambahan untuk
mempertahankan struktur terbuka.
Misalnya penambahan DMSO.
Templat
• Hasil isolasi DNA (genom,
plasmid, mtDNA)
• Hasil lisis
• Produk PCR (untuk re-PCR atau
dengan pengenceran)
• RNA (untuk RT-PCR dan atau real
time PCR)
Perhatikan keberadaan inhibitor
Tipe Templat
Genomic DNA may be extracted from
individuals (e.g. patient samples,
bacteria, viruses, plants etc.), cell lines,
somatic cell hybrids, radiation hybrids.
Cloned DNA can be extracted from large
insert genomic clones such as YACs,
BACs, PACs, cosmid, phage, or, small
insert clones such as plasmids.
RNA templates are usually converted to
cDNA templates prior to PCR. Such
templates can be used in real-time
PCR experiments to quantitate relative
expression of mRNA compared with
control transcripts, or in reverse-
transcription studies coupled to gene
specific PCR for investigation of mRNA
structure and coding potential.
Kualitas
• Fragmentasi
• Sumber
– DNA dari plasma, darah,
jaringan, tumbuhan, tanah,
makanan, forensik dll
Untuk target PCR yang pendek, DNA
yang mengalami fragmentasi parsial
masih bisa digunakan. Karena
kemungkinan masih ada sejumlah
mulekul DNA yang masih utuh antara dua
primer. Kemampuan ini yang
menyebabkan PCR cocok digunakan
untuk analisis forensik atau analisis
mutasi gen dari spesimen patologi.
Konsentrasi Templat
Mempengaruhi jumlah kopi
PCR cukup sensitif untuk amplifikasi dari
sejumlah kecil DNA. Normalnya untuk 50
ul reaksi diperlukan 50 ng DNA genom,
atau ~1.5 x 104 kopi DNA target dan akan
dapat dideteksi dengan agaros setelah 30
siklus. Protokol modifikasi melalui pre-
amplifikasi dengan random primer dapat
digunakan, digabung dengan PCR target
kedua.
Karakteristik Templat
• Kandungan G+C
• Halangan struktur
• Kandungan GC, urutan yang
komplemen, dapat mengurangi
efisiensi PCR. Jika templat dapat
membentuk struktur sekunder atau
tersier pada suhu annealing dan
extension, maka enzim tidak bisa
bekerja. Masalah ini dapat diatasi
dengan penambahan reagen yang
dapat menghambat pembentukan
folding DNA untai tunggal

Oligonukleotida Primer
• 20-30 nt
• Kandungan G+C sekitar 40- 60%
• Hindari adanya polipurin dan
polipirimidin
• Hindari adanya struktur sekunder
dan komplentari antara primer
serta primer dimer
• Melting temperatur: suhu dimana
setengah dari DNA untai ganda
terdenaturasi
• Tm primer: Tm >55 oC
[Tm = (jumlah A+T) x 2 oC +
(jumlah C+G) x 4oC ] (untuk panjang
primer ±30 nt
Jika panjang primer >30 nt,
perhitungannnya tidak sederhana.
Software: DNAstar, Perlprimer,
oligoexplorer dan FastPCR.
• Stok primer harus diencerkan
menjadi 20 μM, di-aliquot, dan
disimpan di –20 oC.
• Konsentrasi akhir 0,4-1 mM
Penempelan PRIMER
• Suhu dan lamanya waktu
penempelan primer bergantung
pada komposisi, panjang, dan
konsentrasi primer.
• Temperatur penempelan yang
biasa dipakai adalah 5 oC dibawah
Tm.
• Menaikkan suhu annealing akan
menghindari annealing primer
yang kurang spesifik (mispriming)
dan mereduksi mis-extension dari
nukleotida yang tidak diinginkan di
ujung 3’ dari primer (mengurangi
terbentuknya produk yang tidak
spesifik)
• Menurunkan suhu annealing akan
memperbesar terjadinya
mispriming sehingga
menghasilkan produk non-spesifik
Primer dimer
Mispriming

Bagaimana mendisain primer?

• Manual
• Software (beli, gratisan, online)
– Fast PCR
– DNASTAR
– PearlPrimer
– Oligo explorer
– NCBI → primer design
(online)
– dll

Disain Primer
• Yang harus diperhatikan:
– Tm
• Komposisi primer
dan panjang primer
– Kompatibilitas primer
• Homologi internal,
primer dimer
– Homologi Primer dengan
urutan lain pada genom
• Analisis BLAST
• Struktur sekunder internal pada
primer atau pembentukan dimer
antara primer dapat mengurangi
konsentrasi primer dalam
campuran reaksi dan dapat
berkompetisi dengan dupleks
templat-primer.
Enzim
• Awalnya PCR dilakukan
menggunakan enzim DNA
polimerase I fragmen Klenow
– Problematic
• Fragmen Klenow DNA polymerase
I dari E. coli bukan enzim
termostabil. Reaksi PCR dilakukan
pada suhu polimerisasi optimum
37oC, dan enzim ditambahkan
setiap setelah denaturasi. Volume
reaksi akan berubah setiap siklus
PCR. Kesulitan lain adalah harus
disediakan tiga water bath dengan
suhu yang berbeda sehingga
resiko kontaminasi tinggi (tabung
sering dibuka), dan memerlukan
waktu yang lama.
 • Thermus aquaticus (Taq) DNA
polimerase (termostabil)
• Fidelitas tinggi
• Konsentrasi enzim biasanya 0.01-
0.02 unit/ml
Keuntungan penggunaan enzim
termostabil:
• 1. Mengurangi kontaminasi
• 2. Pengembangan mesin dengan
“dry block” untuk mengontrol
temperatur pada masing-masing
siklus.
• 3. Penggunaan kombinasi enzim
untuk meningkatkan fidelitas
melalui mekanisme proof-reading.
Konsentrasi enzim
• Konsentrasi enzim yang
disarankan berbeda untuk setiap
suplier.
• Bila konsentrasi enzim terlalu
banyak, akan terdapat non spesifik
background, sementara kalau
terlalu kecil, akan menyebabkan
produk yang tidak diinginkan tidak
terjadi.
• Untuk mengoptimasi PCR,
konsentrasi enzim yang
disarankan berkisar antara 0,5
sampai 5 unit/100 l
• Konsentrasi yang disarankan
untuk Taq DNA Polymerase
(Perkin-Elmer Cetus, Innis) adalah
antara 1 dan 2.5 unit untuk 100 l
reaksi, kalau parameter yang lain
sudah optimal.
Buffer
• Garam: K/ Mg
– Biasanya hanya Mg yang
dibutuhkan untuk aktivitas
enzim dan product yield
• free Mg for enzyme
activity
• excess Mg causes in
non-specific
amplification
• Detergen
– essential for enzyme activity
• Modifiers
– DMSO untuk mengurangi
struktur sekunder
– Analog dNTP
Mg+2
• Konsentrasi Mg dapat dioptimasi.
• Taq DNA polymerase memerlukan
magnesium untuk berikatan
dengan DNA templat, primer dan
dNTP.
• Konsentrasi Mg dapat
mempengaruhi primer annealing,
spesifisitas produk dan aktivitas
enzim.
• Konsentrasi Mg pada PCR dapat
divariasi antara 0,5 sampai 2,5
mM.
• Keberadaan EDTA atau chelator
yang lain pada primer akan
mengganggu fungsi magnesium
secara optimum.
• Meningkatkan kelarutan dNTP
• Meningkatkan Tm primer & DNA
templat
• Meningkatkan sensitifitas / yield
Deoksinukleotida Trifosfat (Dntp)
Stok dNTP harus berada dalam keadaan
netral pada pH 7.
• Konsentrasi antara 20 sampai 200
M dapat memberikan hasil yang
optimal.
• Keempat dNTP harus berada
dalam jumlah yang ekivalen untuk
meminimalkan error yang terjadi.
Produk Polimerisasi DNA
• Ukuran produk
– Pada umumnya enzim
termostabil dapat
menghasilkan fragmen ± 3
Kb.
• Komposisi urutan DNA
– Kandungan G+C >> dapat
menghalangi ekstensi
• Sejumlah kit dengan enzim
termostabil yang mempunyai
aktivitas proof reading, dan reagen
yang didisain untuk menghasilkan
produk yang panjang sudah
tersedia. Kit ini dapat
mengamplifikasi fragmen DNA ±
50Kb dari templat yang kompleks.
Program
• Denaturasi awal pada 94-95oC (3-
5min) Mekanisme PCR
• Denaturasi (15-60det)
– templat
• Annealling (30-60det)
– Tm dupleks
• Extension (dari 30det)
– Panjang produk (15
basa/det)
– Templat
• Final Extension dan hold
• Final extension pada 72oC akan
menjamin bahwa semua produk
PCR mempunyai panjang yang Optimasi Suhu Annealing
sama. Hold umumnya pada 4oC.
Produk PCR kemudian disimpan
dalam lemari es atau freezer
sebelum dianalisis.
Peranan Ion Mg2+ Kontrol Eksperimen
• Kontrol positif (sampel yang sudah
diketahui memberikan hasil +)
• Kontrol negatif (semua pereaksi,
untuk menguji ada/tidaknya
kontaminasi)
Troubleshooting guide
• Bila tidak ada produk PCR !!!
 Campuran reaksi tidak sesuai
Analisis Hasil PCR: (selalu gunakan kontrol +)
Elektroforesis gel agarose  Siklus tidak cukup
• Pergerakan DNA dalam medan  Temperatur annealing terlalu tinggi
listrik:  Jumlah templat tidak memadai
– Ke kutub positif  Suhu denaturasi tidak optimum
– Kecepatan tergantung: dan kurang lama
• Ukuran DNA  Waktu ekstensi kurang (terutama
• Konformasi DNA untuk long-distance PCR)
• Konsentrasi agarosa  Cek konsentrasi komponen reaksi
• Pewarnaan dengan etidium (Mg2+, dNTP, primer)
bromida  Cek disain primer (kandungan GC,
• Ukuran DNA yang dapat panjang, Tm, komplementari)
dipisahkan: • Banyak produk tidak spesifik
– agarosa 0,6 %: 1 - 20  Terlalu banyak siklus
kb  Annealing temperatur terlalu
– agarosa 0,9 %: 0,5 - 7 rendah
kb • Produk PCR smear
– agarosa 1,5 %: 0,2 - 3  Terlalu banyak siklus
kb  Suhu denaturasi terlalu rendah
– agarosa 2,0 %: 0,1 - 2  Waktu ekstensi terlalu panjang
kb  Templat mengalami degradasi
 Terlalu banyak enzim, Mg2+ atau
templat
Elektroforesis
• Pengembangan Metode PCR
• PCR-SSCP
• Multipleks PCR
1.5 • PCR-RFLP
log panjang DNA

• RT-PCR
1 • Real time PCR
• PCR alel spesifik (PASA)
0.5 Series1

0
0 10 20
-0.5
Jarak migrasi