BAB I
PENDAHULUAN
Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak
kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase
diam.
Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari
Satu fasa tetap tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa
gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Prosedur kromatografi masih
dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah,
kompleksitas campuranyang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah
yang digunakan hanya 2 jenis kromatografi yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis
tipis. Oleh karena itu, pada makalah ini hanya akan dijelaskan kedua kromatografi tersebut.
1.3 Tujuan
1. Untuk mengetahui pengertian dan cara kerja dari kromatografi.
BAB II
PEMBAHASAN
Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk pemisahan tertentu. Cara ini
dikenalkan oleh TSWETT, ia telah menggunakan untuk pemisahan senyawa – senyawa yang
berwarna, dan nama kromatografi diambillkan dari senyawa yang berwarna. Meskipun
demikian pembatasan untuk senyawa- senyawa yang berwarna tak lama dan hampir
Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit – analit dalam
sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan gerak. Fase diam dapat berupa bahan
padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung
padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas
digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam
kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair
(Rohman, 2009).
perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan
meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari
fase diam (fase stationer) dan fase gerak (fase mobil).Fase gerak membawa komponen suatu
campuran melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut
dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada
perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama
(Bresnick, 2004).
2) kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk padat (absorbsi)
Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan
1. Pengamatan langsung, jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet.
2. Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas disemprotkan
4. Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium pembiakan yang tealh ditanami, untuk
Pembagian ini selanjutnya dapat dibagi lagi seperti telihat pada skema berikut:
KROMATOGRAFI :
1. Kromatografi Gas
a. GLC
b. GSC
2. Kromatografi Cair
a. HPLC
b. LLC-PC
c. LSC-TLC, Kolom
d. Ion Excange
e. Ekslusi : - GP
- GF
Keterangan
PC = Paper Chromatography
GP = Gel Permeation
GF = Gel Filtration
LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase
diam yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.
alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-
komponen campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.
3. Ion-exchange chromatography
Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion.
Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang
4. Exclusion chromatography
Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan
Kinerja Tinggi)
Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang dan
walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative
Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :dua macam
Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup
Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana
terjadi interaksi antara zat terlarut dengan pori yang terdapat di permukaan fase diam.
6. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom,
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi
dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis
pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan
menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca.
Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan
dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat
penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis
dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf
yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang
diperoleh pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping
kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik
memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada
penyangga berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah
berupa larutan , ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal). Setelah plat atau lapisan
ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok ( gambar
2).
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam
gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas
kimia biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam
gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan
kapiler (pengembangan) (gambar 2). Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan,
komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan
Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem
larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai
pemisahan. Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum
yang meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana dan lain- lain .
Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau
hRf.
Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua
desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 –
100. Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan
menunjukkan angka Rf lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti
dengan yang lebih sesuai. Jika angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran
pelarut harus dikurangi, jika hRf lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan
(Stahl 1985).
Sifat – sifat umum dari penyerap- penyerap untuk kromatografi lapis tipis
adalah mirip dengan sifat – sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat penting dar
penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong
sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron .
Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan
salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang
butirannya halus. Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang
digunakan kebanyakan diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada
lapisan dan menambah adhesi pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan
kalsium sulfat. Tetapi biasanya dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak
perlu mencampur sendiri dan diberi nama dengan kode silika gel G (Sastrohamijojo 1985).
1. Alkaloid
2. Antraglikosida
3. Arbutin
4. Glikosida Jantung
5. Zat pahit
6. Flavonoid
7. Saponin
8. Minyak atsiri
10. Valepotriat
P. Bahan disari dengan 5 ml metanol P dilakukan dengan cara dikocok pada suhu 60°C
selama 15 menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Filtrat
3. Saponin
penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Sari
diuapkan sampai diperoleh 1 ml, kemudian ditambah dengan 0,5 ml air dan 3 ml butanol P,
sambil dikocok. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.
4. Glikosida Jantung
dan 10 ml larutan timbal (II) asetat LP. Campuran dipanaskan di atas tangas air selama 10
menit. Filtrat setelah dingin disari 2 kali, masing-masing dengan 10 ml diklormetana P. Sari
P. Penyarian dilakukan dengan cara direfluks 15 menit. Filtrat yang diperoleh kemudian
diuapkan sampai kering. Sisa dilarutkan dalam 1 ml toluena P. Filtrat sebanyak 20 µl atau
Lempeng KLT
Lempeng yang digunakan lempeng silikagel 254P dengan ukuran 10 cm x 10
cm. Lempeng dapat berupa lempeng kaca atau lempeng lain yang cocok. Untuk menentukan
Cairan elusi
Cairan elusi dijenuhkan dengan larutan asam setat P 10% digunakan untuk mengelusi
Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang diduga mengandung minyak atsiri.
3. Kloroform-metanol-air
Pereaksi penampak
1. Anisaldehid-asam sulfat P
2. Dragendroof
b. Kromatografi kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis
air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua
cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks
selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan
diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia
akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam
bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup
dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan
komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila
permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang
telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi
tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka
akan terlihat sebagai pita atau nodayang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus
dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-
pereaksiyang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-
senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi
tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada
kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi
lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram
Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi
pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu
4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang
5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang
sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari
Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-
e. Elektroforesis
Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak.
Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda.
pembelajaran. Khususnya dalam hal, teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas
Dalam hal ini, penyimpanan kromatografi sebaiknya ditempatkan pada tempat yang
kering tidak pada tempat yang lembab. Idealnya diletakkan pada posisi yang siap untuk
digunakan (tidak dipindah atau dipindah ditempat lain). Hal ini memungkinkan
memperpanjang usia alat. Pemindahan atau merakit ulang alat memungkinkan terjadinya
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
1. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair)
c. Ion-exchange chromatography
d. Exclusion chromatography
e. HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi).
3. Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom,
DAFTAR PUSTAKA
Dirjen POM, (1979), Farmakope Indonesia Edisi III, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta.
Saifuddin Azis et all.,(2011), Standarisasi Bahan Obat Alam Edisi Pertama, Graha Ilmu, Yogyakarta
Stahl Egon, (1985), Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung.