Mata Kuliah : Praktikum Mikrobiologi

Pewarnaan Gram Bakteri

OLEH :
Nama : Indra Priawan M
NIM : 4143220012
Kelas : Biologi NK A 2014

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2017
 I. Judul : Pewarnaan Gram Bakteri
II. Tujuan :
 Untuk mengetahui apa itu bakteri gram negatif
 Untuk mengetahui apa itu bakteri gram positif
 Untuk mengetahui ciri-ciri bakteri gram negatif
 Untuk mengetahui ciri-ciri bakteri gram positif
 Untuk mengetahui cara pewarnaan bakteri gram positif dan negatif
III. Tinjauan Pustaka
Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negative. Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan
dari komposisi dinding sel bakteri. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang digunakan ada 4
jenis, yaitu Kristal violet, iodine, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan
mempertahankan warna ungu dari kristalviolet sehingga ketika diamati dengan mikroskop
akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negative tidak dapat
mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada
dinding sel sehingga akan memperlihatkan warna merah. Uji biokimia untuk gram negative
adalah uji oksidasi sedangkan untuk gram positif dapat dilakukan pewarnaan endospora
(Pratita, 2012) .
Pewarnaan gram merupakan salah satu metode untuk mengetahui morfologi bakteri, yang
bermanfaat untuk mengetahui apakah biakan bakteri masuk dalam golongan gram positif atau
gram negative. Bakteri gram negative memiliki ciri – cirri tidak dapat menahan zat warna
setelah dicuci dengan alkohol 95 % selama 5 sampai 10 detik (Samsundari, 2006)
Salah satu pewarnaan yang sering digunakan untuk mengindentifikasi bakteri adalah
perwarnaan Gram. Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dibagi menjadi dua golongan,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Bakteri yang
tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh Kristal violet disebut bakteri Gram positif,
sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang jika dibilas dengan alkohol, tetapi tetap
berwarna merah muda karena menahan warna merah safranin disebut bakteri Gram negative (
James, 2008 ) .
Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi sel bakteri serta untuk
membedakan bakteri gram positif dan gram negative. Perbedaan warna pada bakteri gram
positif dan gram negative menunjukkan bahwa adanya perbedaan struktur dinding sel antara
kedua jenis bakteri tersebut. Bakteri gram positif memiliki struktur dinding sel dengan
kandungan peptidoglikan yang tebal sedangkan bakteri gram negative memiliki sturktur
dinding sel dengan kandungan lipid yang tinggi (Fitri, 2011).
Ditinjau dari komponen penyusun dinding sel bakteri gram positif relative lebih sederhana
berbanding bakteri gram negative yaitu terdiri dari dua sampai tiga lapis membrane
sitoplasma yang tersusun dari asa teikhik dan asam teikhouronik berupa polimer yang larut
dalam air, sedangkan dinding sel bakteri negative lebih kompleks dan lebih tebal, tersusun
dari peptidoglikon, lipoprotein dan lipopolisakarida, sehingga dinding sel bakteri gram positif
lebih permeable terhadap senyawa yang bersifat hidrofil dibandingkan sel bakteri gram
negative (Fatimah, 2006).
IV. Alat dan Bahan
 Alat
No. Nama Alat Jumlah
1. Mikroskop 1 buah
2. Kaca Benda 6 buah
3. Lampu Spiritus 1 buah
4. Jarum Inokulasi 2 buah
5. Botol Semprot 1 buah
6. Kertas Isap 5 buah
7. Cawan Petri 2 buah

 Bahan
No. Nama Bahan Jumlah
1. Biakan Murni Bakteri Secukupnya
2. Metilen Blue 2 tetes
3. Safranin 2 tetes
4. Minyak Imersi 1 tetes
5. Kristal Violet 2 tetes
6. Alkohol 96% Secukuonya
7. Larutan Iodium 2 tetes

V. Prosedur Kerja
 Pewarnaan Gram
a. Mengambil kaca benda yang telah dibersihkan
 b. Dengan cara aseptik letakkan inokulum yang akan diperiksa diatas kaca benda
pada bagin tengah
c. Tetesi sedian tersebut dengan larutan kristal violet, biarkan selama satu menit.
d. Bilaslah dengan air mengalir dengan menggunakan botol semprot
e. Tuangilah sediaan dengan larutan iodium, biarkan selama 1 menit
f. Bilaslah dengan air mengalir dengan botol semprot
g. Tuangilah lkohol 96% setetes demi setetes hingga kristal violet hilang
h. Bilaslah dengan air mengalir dengan menggunakan botol semprot.
i. Tuangilah sediaan dengan safranin, biarkan 45 detik.
j. Amati dibawah mikroskop, beri minyak imersi
 Hasil pewarnaan : ungu = gram positif
merah = Negatif

VI. Hasil dan Pembahasan

 Hasil

Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa biakan yang diinokulasi adalah bakteri
garam positif. Dimana dari gambar tersebut dapat dilihat bahwa warna dari gambar tersebut
bewarna ungu sehingga bakteri tersebut dapat dikatakan bakteri garam positif.

 Pembahasan
 Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Manurung, 2010).
Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna
ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada
mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang
transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif
akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri
gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit
bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.
Penambahan lugol pada bakteri. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna
yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau
mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk
memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding
sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan, penyingkiran zat lipida dari
dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.
Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh
bakteri menjadi semakin lebih kuat.
Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian
didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya
hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau
melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna
dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat
warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat
menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat
mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap
berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang.
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan
menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut,
daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk
sehingga sel berwarna ungu.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan
dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu
pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi
bakteri berlangsung cepat.
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan
setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen,
perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar
aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan.
Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah
mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan
jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
VII. Kesimpulan
Dari praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa bakteri yang diinokulasi
merupkan bakteri gram positif. Karena warna yang terbentuk merupakan ciri-ciri bakteri
garam positif.
Perbedaan bakteri garam positif dan gram negatif ialah terdapat pada dinding selnnya.
Pada bakteri gram negatif, dihasilkan warna merah dan pada gram positif dihasilkan warna
ungu pada tahap akhir pewarnaan
 VIII. Daftar Pustaka

Fatimah, Cut, Urip H., Isma S., Safrida, Ernawati, 2006, Uji Aktivits Antibakteri Ekstrak
Daun Angsana Secara In Vitro, Jurnal Ilmiah PANNMED, Vol. 1 , No. 1.
Fitri, L., Yekki Y., 2011, Isolasi Dan Pengamatan Morfologi Koloni Bakteri Kitinolitik,
Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Vol. 3 , No. 2.
James, Joyce, Colin B., Helen S., 2008, Prinsip – Prinsip Sains Untuk Keperawatan,
Erlangga Medical Sains, Jakarta.
Pratita, Maria Yuli E., Surya Rosa P., 2012 , Isolasi dan Identifikasi Bakteri Termofilik
Dari Sumber Mata Air Panas Di Songgoriti Setelah Dua Hari Inkubasi, Jurnal Teknik
Pomits, Vol. 1, No. 1.
Samsundari, Sri, 2006, Pengujian Ekstrak Temulawak dan Kunyit Terhadap Resistensi
Bakteri Aeromonas hydrophilla Yang Menyerang Ikan Mas, Gamma, Vol. 11, No. 1 .