BioSMART ISSN: 1411-321X

Volume 6, Nomor 2 Oktober 2004

Halaman: 75-78

Peningkatan Sensitivitas Analisis N-Metilkarbamat secara HPLC dengan

Derivatisasi Pasca Kolom Menggunakan O-Pthaldialdehida (OPA)

The increase of N-carbamate analysis sensitivity by HPLC post column derivatization with O-
pthaldialdehida (OPA)

ANY GUNTARTI1, NOEGRAHATI2, IZUL FALAH3

1
Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta 55166
2
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 55281
3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Gadjah Mada Yogyakarta 55281

Diterima: 25 Pebruari 2004. Disetujui: 17 Mei 2004

ABSTRACT

This work studied the separation and detection of several carbamates (propoxur, carbaryl, BPMC). The separation was carried out in
HPLC and the detection was done by UV detector (HPLC-UV) and by fluorosence detector after on line post column derivatization
(HPLC-fluoresence). Comparison between the two method were evaluated to obtain the best analytical method. It was observed that
sensitivity was much higher in the fluorosence detection. The slope of HPLC-UV for propoxur was 3,29; carbaryl was 4,59 and BPMC
was 0,82; while the slope of HPLC-fluorosence for propoxur was (6,11.103), carbaryl was (2,69. 103) and BPMC was (0,97. 103). The
LOD of HPLC-UV for propoxur was 44,56 ng; carbaryl 11,56 ng and BPMC was 4653 ng; while the LOD HPLC-fluorosence for
propoxur was 0,59 ng, carbaryl was 1,71 and BPMC was 2,24 ng.

Keywords: carbamates, HPLV-UV; HPLC-fluorosence.

PENDAHULUAN Kerja pestisida haruslah sangat spesifik untuk

Pestisida telah banyak digunakan dalam berbagai
bidang pertanian, misalnya untuk pemberantasan hama dan
gulma tanaman. Dalam bidang pasca penen hasil-hasil
pertanian, pestisida digunakan untuk mencegah hasil-hasil
pertanian dari serangan serangga, tikus atau untuk
mencegah pertumbuhan jamur dalam hasil-hasil pertanian
yang disimpan. Dalam bidang kesehatan, pestisida
digunakan untuk pemberantasan nyamuk malaria dan
beberapa serangga vektor lainnya (Sastrawijaya, 1991).
Pestisida secara kimia dapat diklasifikasikan menjadi
pestisida organik dan anorganik. Pestisida organik terdiri
dari pestisida organik alam dan organik buatan. Pestisida
organik buatan diklasifikasikan antara lain sebagai
golongan organoklorin, dimana golongan ini di Indonesia
sudah tidak digunakan lagi. Golongan organofosfat, karena
banyak yang bersifat toksis maka hanya sebagian saja yang
digunakan. Golongan yang banyak digunakan adalah
pestisida golongan karbamat dan golongan piretroida.
Salah satu contoh golongan karbamat yang sebagai
insektisida adalah propoksur, karbaril, BPMC dan
karbofuran (Kuhr dan Dorough, 1976)
♥ Alamat korespondensi:
Jl. Kapas 9 Semaki Yogyakarta 55166
Tel.: +62-274-563515. Fax.: +62-274-564004
e-mail: biology@mipa.uns.ac.id (ed.)
organisme yang ditargetkan untuk dibunuh dan tidak
merusak organisme yang bukan sasarannya. Kenyataannya
sebagian besar dari bahan-bahan kimia yang digunakan
sebagai pestisida tidaklah sangat selektif. Pada umumnya
pestisida meracuni banyak species yang bukan sasaran
meliputi manusia dan bentuk kehidupan lain di lingkungan
(Kuhr dan Dorough, 1976).
Dengan semakin meluasnya penggunaan pestisida,
dampak negatifnya juga semakin bertambah, terutama
pestisida yang mempunyai kestabilan tinggi dan sulit
diuraikan oleh lingkungan alam (Connel dan Miller, 1984).
Akibatnya akan terjadi pencemaran lingkungan terutama
pada sistem perairan. Residu pestisida dapat diartikan
sebagai sisa-sisa penggunaan pestisida beserta hasil
degradasinya (metabolit) yang beracun, yang terdapat pada
bagian permukaan atau dibagian dalam suatu bahan
pangan, tanaman, binatang serta lingkungan lainnya (Chau,
1981).
Pencemaan pestisida ternyata telah menimbulkan pula
permasalahan yang cukup rumit dalam analisis kimia.
Kimia analisis merupakan bagian penting dalam kegiatan
pemantauan residu pestisida yang berfungsi sebagai
pemberi informasi, baik kualitatif maupun kuantitatif.
Banyak eksperimen telah dilakukan menunjukkan bahwa
pemisahan sejumlah metabolit yang mempunyai sifat fisika
kimia yang sangat mirip dengan senyawa induknya,
merupakan pekerjaan yang sulit. Berdasarkan alasan ini,

 2004 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta

76 B i o S M A R T Vol. 6, No. 2, Oktober 2004, hal. 75-78
teknik pemisahan secara kromatografi biasanya menjadi
pilihan dalam kegiatan analisis residu pestisida (Noegrohati
dan Narsito, 1997).
Karena sifat racunnya yang dapat membahayakan
lingkungan dan kehidupan manusia, analisis kimia terhadap
senyawa karbamat yang merupakan salah satu contoh
pestisida yang banyak digunakan di Indonesia menarik
perhatian ahli kimia. Metode analisis residu pestisida
karbamat yang telah dikembangkan antara lain
kromatografi gas (GLC) dengan menggunakan derivat 1-
fluoro-2,4-dinitrobenzen, detektor ECD (Grobb, 1995).
Kelemahan dengan metode ini, karbamat merupakan
senyawa yang bersifat thermolabil, sehingga mudah
mengalami degradasi. Keterbatasan metode analisis
karbamat dengan GLC telah mengundang minat para ahli
untuk mengembangkan metode lain (Smith, 1988).
Telah dikembangkan metode kromatografi cair tekanan
tinggi (HPLC) sebagai metode analisis. Teknik analisis
yang dipilih didasarkan pada hidrolisis katalitik yang
kemudian hasil hidrolisis direaksikan dengan reagen
derivatisati dan selanjutnya dideteksi dengan detektor
fluoresen. Selektivitas dan sensitivitas metode analisis ini
cukup baik (Snyder et al., 1997).
Berdasarkan permasalahan yang timbul dalam analisis
pestisida di atas penelitian ini dimaksudkan untuk
mempelajari pemisahan senyawa N-metilkarbamat dalam
kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) secara kualititatif.
Dalam kromatografi, pemisahan terjadi karena perbedaan
distribusi senyawa dalam fase diam dan fase gerak,
sehingga apabila suatu campuran dilewatkan melalui kedua
fase tersebut akan terjadi perbedaan kecepatan migrasi dan
pemisahan akan terjadi. Secara kuantitatif, koefisien
distribusi dapat disajikan sebagai berikut:
K = Cs / Cm
K = koefisien partisis
Cs = Konsentrasi komponen dalam fase diam
Cm = Konsentrasi komponen dalam fase gerak
Di samping pengamatan visual atas bentuk puncak
kromatogram, untuk mengevaluasi pemisahan, ada
beberapa parameter yang perlu diperhatikan. Parameter
tersebut ialah harga N (jumlah plat teoritik), HETP, Rs
(resolusi) , k’ (kapasitas kolom) dan α (selektivitas kolom).
Idealnya, puncak kromatogram berbentuk kurva Gauss
dengan dasar pita yang sempit. Adanya puncak
kromatogram yang mengekor atau melebar akan
menimbulkan kesulitan dalam analisis kuantitatif (Snyder
et al., 1997).
Pada pelaksanaan analisis dengan HPLC, kemungkinan
banyak sekali senyawa-senyawa yang tidak dapat dianalisis
dengan mudah, karena detektor yang digunakan tidak
memberikan respon terhadap senyawa yang dianalisis.
Keadaan ini disebabkan karena senyawa tersebut
memberikan absorbansi pada panjang gelombangnya diluar
daerah UV-Vis, atau senyawa yang akan ditentukan dengan
detektor fluoresen ternyata senyawa tersebut tidak
berfluoresensi (Smith, 1988).
Derivatisasi senyawa analit pada HPLC bertujuan untuk
mengatasi keadaan tersebut, dengan jalan mereaksikan
senyawa yang dianalisis dengan zat tertentu, sehingga akan
terjadi pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih
panjang (pergeseran batokromik). Cara lain yaitu dengan
mereaksikan dengan zat tertentu sehingga akan
menghasilkan senyawa yang berfluorosen. Teknik
derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum (pre) atau sesudah
(post) kolom tetapi sebelum detektor. Salah satu reagen
derivatisasi pasca-kolom adalah orhto pthaldialdehida
(OPA) (Poole dan Poole, 1991).
BAHAN DAN METODE
Bahan: Standar karbaril dengan kemurnian 99,50%,
standar propoksur dengan kemurnian 98,81%, standar
BPMC dengan kemurnian 98,11% . Bahan yang digunakan
berkualitas p.a. dari E.Merck, meliputi: metanol, natrium
tetraborat, merkaptoetanol, natrium hidroksida, aseton,
aquabides, ortophtaldialdehida (OPA), contoh tanah,
larutan buffer standar pH 4.
Alat: Seperangkat HPLC Shimadzu LC-6A, 2 buah
pompa HPLC merck Shimadzu, 2 buah pompa korteks K-
35 D, seperangkat alat ekstraksi Soxhlet, detektor spetkro-
otometer UV-Vis SPD-6AV, detektor spektrofluorometer
Shimadzu RF-535, pengatur temperatur reaktor TC 1900
ICI, rekorder Shimadzu C-R 36A, koil hidrolisis 593 cm
dan koil derivatisasi OPA 137 cm.
Jalan Penelitian: (i) Melakukan optimasi terhadap
sistem HPLC dengan detektor UV yang meliputi pemilihan
fase gerak dan fase diam (ii) Hasil optimasi sistem HPLC
dengan detektor UV, digunakan untuk menentukan kondisi
optimum terhadap sistim HPLC derivativasi pasca-kolom
dengan OPA menggunakan detektor fluorosensi. Kondisi
optimum tersebut meliputi temperatur hidrolisis,
konsentrasi NaOH, kecepatan alir NaOH, kecepatan alir
OPA dan lamanya waktu hidrolisis di dalam koil hidrolisis
(iii) Melakukan evaluasi terhadap hasil optimasi yang
meliputi penentuan sensitivitas dengan uji batas deteksi
(LOD) serta linieritas, komparasi proses pemisahan dengan
dan tanpa derivatisasi pasca-kolom dengan OPA. 4)
Melakukan uji pungut ulang (recovery) terhadap contoh
tanah.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi fase gerak dan fase diam dengan HPLC
detektor UV adalah menggunakan C18 dengan panjang
kolom 20 cm, ukuran partikel 5 µm dan diameter dalam 0,4
mm. Optimasi fase gerak menggunakan program elusi
gradien dengan metanol 50% selama 15 menit, kemudian
secara gradien konsentrasi metanol dinaikkan hingga 70%
pada menit ke-30 dan dibiarkan 70% sampai menit ke-40.
Kecepatan alir yang digunakan 1 ml/menit. Kondisi
optimum ini, digunakan untuk mengoptimumkan HPLC
derivatisasi pasca-kolom dengan detektor fluoresenci.
Kondisi optimum dengan HPLC derivatisasi pasca-
kolom menggunakan OPA yaitu, panjang gelombang
 GUNTARTI dkk. – Analisis N-metilkarbamat dengan HPLC 77

Tabel 1. Persamaan regresi linier dan kisaran linieritas senyawa N-metilkarbamat.

Persamaan garis regresi: y = (a ± Sa ) + (b ± Sb) x

Nama HPLC detektor UV HPLC derivatisasi OPA
Pestisida Kisaran 2 Kisaran
(a ± Sa ) x (10 ) (b ± Sb) R (a ± Sa ) (102) (b ± Sb) (103) R
berat (µg) Berat (µg)
Propoksur 17,5-87,5 0,60±0,04 3,29±0,07 0,999 0,08-0,34 -4,17±0,84 6,11±0,37 0,995
Karbaril 17,5-87,5 3,25±0,20 4,59±0,35 0,992 0,21-0,84 -5,13±1,18 2,69±0,21 0,991
BPMC 125,0-38,0 a. 1,27±0,11 a. 0,82±0,05 0,995 0,79-26,10 14,85±5,66 0,97±0,05 0,996
b. 3,59±0,04 b. 0,96±0,57 0,996

Tabel 2. Hasil perhitungan LOD senyawa N-metilkarbamat.

Persamaan garis regresi: y = (a ± Sa ) + (b ± Sb) x

Nama
HPLC detektor UV HPLC derivatisasi OPA
Pestisida
LOD (ng) (a ± Sa ) (b ± Sb) R LOD (ng) (a ± Sa ) (b ± Sb) (103) R
Propoksur 44,56 -15,49±1,07 46,04±1,44 0,998 0,59 -10,72±0,82 1,82±0,04 0,999
Karbaril 11,56 0,22±0,24 32,12±2,18 0,993 1,71 0,37±1,25 1,81±0,13 0,992
BPMC 46,53 9,75±1,28 1,24±0,09 0,993 2,24 -0,44±0,08 0,06±0,002 0,998

Tabel 3. Komparasi proses pemisahan dengan dan tanpa reaktor OPA pasca-kolom.

Komparasi proses pemisahan dengan dan tanpa reaktor OPA pasca-kolom

Nama pestisida Parameter sebelum derivatisasi Parameter setelah derivatisasi
Rs K` α HETP (µm) Rs K` α HETP (µm)
Propoksur-karbaril 24,32±0,69 - 1,39±0,01 - 17,84±1,54 - 1,39±0,01 -
Karbaril-BPMC 66,11±1,06 - 1,76±0,04 - 43,65±4,23 - 1,72±0,02 -
Propoksur - 6,47±0,05 - 2,55±0,05 - 7,86±0,09 - 2,55±0,05
Karbaril - 9,21±0,02 - 1,59±0,34 - 10,88±0,01 - 1,58±0,34
BPMC - 17,1±0,02 - 4,94±0,06 - 18,76±0,02 - 4,50±0,03

eksitasi maksimum 336 nm, emisi maksimum 455 nm,
konsentrasi NaOH 0,05 N, laju alir NaOH 0,3 ml/menit,
laju lair OPA 0,2 ml/menit, temperatur hidrolisis 95°C,
panjang koil hidrolisis 593 cm dan panjang koil derivatisasi
137 cm.
Sistem deteksi yang digunakan adalah detektor UV dan
fluorosensi. Sensitivitas adalah kenaikkan respon analitik
setiap satu satuan konsentrasi. Untuk mengetahui
peningkatan sensitivitas, dinyatakan dengan kenaikkan
slope dan penurunan batas deteksi (LOD; limit of
detection). Tabel 1 dan Tabel 2 menyajikan harga slope dan
harga LOD dari kedua sistem deteksi. Dari Tabel 1, terlihat
adanya peningkatan sensitivitas yang digambarkan sebagai
(b ± Sb), yaitu pada HPLC derivatisasi dengan detektor
fluorosen sampai 103 . Semakin tinggi harga (b ± Sb), maka
sensitivitasnya semakin baik. Linieritas dengan harga R >
0,99 dicapai dengan HPLC detektor UV pada kisaran berat
(17,5-87,5) mg untuk propoksur dan karbaril, sedangkan
BPMC (125-138) mg. Sedangkan dengan HPLC
derivatisasi kisaran beratnya semakin lebar. Kisaran berat
semakin lebar menunjukkan linieritas semakin baik.
Metode determinasi selain sensitivitas dan linieritas,
dapat juga dinyatakan dengan perhitungan harga LOD.
Semakin rendah harga LOD, maka metode itu semakin
sensitif. Dari Tabel 2, terlihat peningkatan sensitivitas pada
HPLC derivatisasi dengan detektor fluorocen. Harga LOD
senyawa propoksur menurun 100x, karbaril 10x dan BPMC
sampai 2000x.
Tambahan reaktor OPA pasca-kolom dapat mempe-
ngaruhi kinetika pemisahan. Tambahan pereaksi NaOH dan
OPA dapat mengakibatkan pemisahan (Rs) menjadi lebih
rendah, karena terjadinya pelebaran pita kromatogram.
Oleh karena itu perlu dilakukan komparasi parameter
pemisahan tanpa adanya reaktor OPA pasca-kolom.
Komparasi antara kromatogram sebelum derivatisasi dan
kromatogram setelah mengalami derivatisasi pasca-kolom
(HPLC derivatisasi dengan OPA), meliputi harga Rs
(resolusi0, k’ (kapasitas kolom) , HETP (efisiensi kolom)
dan α (selektivitas kolom). Harga Rs, k’ , HETP dan α
disajikan pada Tabel 3.
Dari Tabel 3., terlihat bahwa harga Rs pada HPLC
setelah derivatisasi lebih kecil, ini disebabkan oleh karena
adanya peningkatan proses difusi diantara fase gerak, solut,
reagen hidrolisis (NaOH) dan reagen derivatisasi (OPA),
sehingga akan memperlebar pita dasar kromatogram HPLC
derivatisasi, akibatnya harga Rs akan turun. Pemisahan
solut di dalam kolom sangat dipengaruhi oleh kepadatan,
jenis partikel pengisi kolom dan eluent yang digunakan.
78 B i o S M A R T Vol. 6, No. 2, Oktober 2004, hal. 75-78

Efisiensi kolom dinyatakan dengan harga HETP (tinggi KESIMPULAN

plat teoritik). Harga HETP tidak berbeda jauh, hal ini
mudah dimengerti karena reaktor ditempatkan setelah
kolom, sehingga tidak terlalu merubah harga HETP-nya.
Untuk mengetahui selektivitas kolom dinyatakan dengan
harga α . Harga α juga tidak jauh berbeda. Karena kedua
komponen mengalami perubahan (dalam kondisi yang
sama), maka hasilnya tidak berbeda.
Kapasitas kolom dinyatakan dengan harga k’. Harga k’
tergantung pada volume fase diam dan fase gerak.
Masuknya reagen hidrolisis dan reagen derivatisasi ke
dalam sistem aliran pasca-kolom, menimbulkan (sedikit)
hambatan pada laju alir fase gerak dalam kolom dan dalam
pipa kapiler, sebagai akibatnya volume fase gerak menurun
dan harga k’ akan meningkat. Hal ini dapat terlihat pada
Tabel 3. Untuk memperkirakan ketepatan suatu metode,
dilakukan uji pungut ulang (recovery). Uji pungut ulang
dilakukan dalam contoh tanah. Hasil uji pungut ulang
disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil uji pungut ulang senyawa N-metilkarbamat pada
derivatisasi OPA pasca-kolom
Dari hasil penelitian ini dapat diambil beberapa
kesimpulan: (i) Optimasi fase gerak dan fase diam dengan
HPLC detektor UV adalah menggunakan C18 dengan
panjang kolom 20 cm, ukuran partikel 5 µm dan diameter
dalam 0,4 mm. Optimasi fase gerak menggunakan program
elusi gradien dengan metanol 50% selama 15 menit,
kemudian secara gradien konsentrasi metanol dinaikkan
hingga 70% pada menit ke-30 dan dibiarkan 70% sampai
menit ke-40. Kecepatan alir yang digunakan 1 ml/menit.
Kondisi optimum ini, digunakan untuk mengoptimumkan
HPLC derivatisasi pasca-kolom dengan detektor fluoresen;.
(ii) Kondisi optimum dengan HPLC derivatisasi pasca-
kolom menggunakan OPA yaitu, panjang gelombang
eksitasi maksimum 336 nm, emisi maksimum 455 nm,
konsentrasi NaOH 0,05 N, laju alir NaOH 0,3 ml/menit,
laju lair OPA 0,2 ml/menit, temperatur hidrolisis 95° C,
panjang koil hidrolisis 593 cm dan panjang koil derivatisasi
137 cm. (iii) Hasil uji pungut ulang (recovery) contoh tanah
senyawa N-metilkarbamat diatas 80%.

Pe yang Pe yang % Uji

Luas Area % Rata- DAFTAR PUSTAKA
Pe ditambahkan diperoleh Pungut
(mV) Rata
(mg) (mg) Ulang
Chau, A.S.Y. 1981. Analysis of Pesticides in Water. Vol. III. Menlo Park,
P 12,57 10,68 12628,760 84,96 86,13±1,65 Flo.: CRC Press.
10,97 12986,776 87,29 Connel, D.W. and G.J. Miller. 1984. Chemistry and Toxicology of
K 18,77 16,99 8612,945 90,51 81,92±9,68 Pollution. New York: John Willey and Sons Inc.
13,77 6881,167 73,33 Grob, R.L. 1995. Modern Practise of Gas Chromatography. 3rd ed. New
B 41,57 34,50 8176,383 83,80 84,36±079 York: John Willey and Sons Inc.
Kuhr, R.J. and H.W. Dorough. 1976. Carbamate Insecticides: Chemistry,
34,96 8264,720 84,92 Biochemistry and Toxicology. Ohio: CRC Press.
Keterangan: Pe = pestisida, P = propoksur, K = karbaril, B = Noegrohati dan Narsito. 1997. Pedoman Pengujian Residu Pestisida
BPMC. dalam Hasil Pertanian. Jakarta: Direktorat Perlindungan Tanaman
Pangan, Dep.Pertanian. R.I.
Dalam uji pungut ulang menggunakan metode Poole, C.F. and S.K. Poole. 1991. Chromatography Today. Amsterdam:
Elsevier Science Publishers.
ekstraksi. Uji ini hanya dilakukan pada HPLC derivatisasi
Sastrawidjaya, T. 1991. Pencemaran Lingkungan. Jakarta: Rineka Cipta
OPA pasca-kolom. Pada Tabel 4, hasil uji pungut ulang Press.
pada ketiga jenis senyawa N-metilkarbamat didapatkan Smith, R.M. 1988. Gas and Liquid Chromatography in Analytical
lebih dari 80%. Berarti metode ini dapat digunakan untuk Chemistry. New York: John Willey and Sons Inc.
Snyder, L.R., J.J. Kirkland, and J.L. Glajh. 1997. Practical HPLC Method
analisis karbamat dalam contoh tanah. Semakin mendekati
Development. 2nd ed. New York: John Willey and Sons Inc.
100% maka ketepatannya semakin baik, begitu pula
sebaliknya.