MAKALAH FITOKIMIA

“PENENTUAN KONTEN SENYAWA SIANOGENIK DALAM

SINGKONG TRANSGENIK AKYANOGENIK KENYA
(MANIHOT ESCULENTA CRANTZ) GENOTIPE”

Disusun Oleh:

1. Riska Pandala Putri (17330721?

2. Rauzatul Ulfa (17330716)
3. Ika Septiana (17330726)
4. Nurul Fajriah (173307 )
5. Yunus Adil zebua (173307 )
6. Vega Lacerta VAE (17330734)
7. Wayan esa sari putri (173307 )
8. Eka Riyani (18330719)
9.

FAKULTAS FARMASI
INSTITUT SAINS DAN TEKNOOGI NASIONAL JAKARTA
2019
 BAB 1

PENDAHULUAN

Glikosida sianogen adalah sekelompok senyawa sekunder tanaman yang mengandung

nitril yang menghasilkan sianida (sianogenesis) setelah pemecahan enzimatiknya.
Fungsi glikosida sianogenik masih harus ditentukan di banyak tanaman. Diperkirakan
bahwa antara 3.000 dan 12.000 spesies tanaman menghasilkan dan menyita glikosida
sianogen. Tanaman yang dapat dimakan utama di mana glikosida sianogenik terjadi
adalah almond, sorgum, singkong, lima kacang, buah-buahan batu dan rebung.

Dalam biji sapindaceous tertentu, HCN dapat muncul selama hidrolisis sianolipid.
Lebih sering, produksi HCN di tanaman yang lebih tinggi dihasilkan dari katabolisme
glikosida sianogenik. Sekitar 75 glikosida sianogenik yang terdokumentasi adalah
semua turunan O-β-glikosidik dari ahydroxynitriles. Tergantung pada asam amino
prekursor mereka, mereka mungkin aromatik, alifatik, atau siklopentenoid di alam.
Sebagian besar adalah monosakarida sianogenik di mana gugus sianohidrin yang
tidak stabil distabilkan oleh hubungan glikosidik dengan residu gula tunggal. Atau,
dalam disakarida sianogenik [mis. (R) -amygdalin, (R) -vicianin, dan linustatin] atau
trisaccharides (mis. Xeranthin), masing-masing dua atau tiga gugus gula, terlibat
dalam stabilisasi tersebut. Turunan-turunan glikosida sianogen yang tersulfasi,
malonilasi, dan terasilasi juga diketahui juga dikenal. Sianogenesis tidak eksklusif
untuk spesies tanaman yang mengumpulkan sianolipid dan glikosida sianogen..

Sianogenesis juga dikenal pada hewan, tetapi terbatas pada artropoda, terutama untuk
kelabang, kelabang, dan serangga tertentu. Pada jamur dan bakteri, HCN dapat
berasal melalui dekarboksilasi oksidatif glisin.Sianida terjadi di singkong dalam
bentuk dua glikosida sianogen; linamarin dan lotaustralin.

Toksisitas singkong pada manusia adalah masalah terdokumentasi dengan baik. Umbi
singkong bervariasi dalam konten sianogen mereka, meskipun sebagian besar varietas
mengandung 15-400 mg HCN per kg berat segar. Dosis sianida dari 50 sampai 100
mg dilaporkan mematikan untuk orang dewasa.

Teknik-teknik yang berbeda dari pengolahan singkong bertujuan untuk mengurangi

tingkat senyawa sianogen untuk mendapatkan makanan yang aman. Metode
tradisional biasanya termasuk chipping, perendaman, fermentasi, memasak,
mengukus, pengeringan dan pemanggangan. Mereka semua mengizinkan linamarase
enzim untuk berinteraksi dengan senyawa sianogen untuk melepaskan HCN. HCN
maka baik larut dalam air atau lolos ke udara. Namun, sering tidak mungkin untuk
menghapus semua senyawa sianogen melalui pengolahan konvensional. Pendekatan
rekayasa genetika menawarkan metode alternatif untuk mengurangi senyawa
sianogen di singkong.

Metode yang berbeda tersedia untuk penentuan kuantitatif senyawa sianogenik

(linamarin, sianohidrin dan sianida bebas). Mayoritas membutuhkan tiga langkah.
Langkah pertama, ekstraksi sianogen, biasanya dilakukan dalam asam encer untuk
menghentikan degradasi senyawa sianogen. Langkah kedua melibatkan degradasi
linamarin untuk sianohidrin dan glukosa dan, kemudian, untuk HCN. Hal ini dapat
dicapai baik dengan autolisis, yang bergantung pada linamarase endogeneous, oleh
hidrolisis enzimatik dengan menambahkan linamarase eksogen atau dengan
hidrolisis alkalinic dengan penambahan NaOH.

Untuk langkah ketiga, penentuan HCN, berbagai metode telah dikembangkan, seperti
titrasi dengan AgNO 3, reaksi dengan picrate alkali, dan yang paling banyak
digunakan, metode fotometri berdasarkan reaksi König.

Metode berdasarkan reaksi König cocok untuk laboratorium dengan peralatan

terbatas dan untuk analisis lapangan, dan karena itu dipilih untuk penelitian ini.
Penelitian ini dirancang untuk menentukan tingkat senyawa sianogen dalam tiga baris
singkong Kenya transgenik yang digunakan dalam penelitian ini bersama dengan
model kultivar eksotis, TMS 60444.
 BAB II
METODOLOGI PENELITIAN

2.1 Penentuan Senyawa Sianogen

Singkong dipanen, dikupas, dipotong-potong dan dicuci tiga kali dengan air
dingin. Sejak sianida konten bervariasi baik secara longitudinal dan radial,
sampel homogen diperoleh dengan menghapus kedua ujung batang dan ujung
distal dari umbi dan memotong akar ke dalam kubus. Mereka dikeringkan
pada ruang suhu (25 ° C) dan kemudian ditumbuk menjadi bubuk. Daun juga
dipanen dari kedua transgenik dan tipe liar Singkong dicuci sekali dengan air
dingin dan dikeringkan pada suhu kamar setelah mereka tanah untuk bubuk.
Untuk penentuan distribusi total kandungan sianida di akar, bubuk dari bagian
akar yang berbeda disiapkan secara terpisah untuk analisis terpisah. Bagian
yang berbeda dari akar disiapkan adalah disc pusat, ujung akar distal, ujung
akar apikal, bagian radial luar dan akar korteks.

2.2 Ekstraksi senyawa sianogen

Sampel dari 10 g dihomogenasi dalam 30 ml media ekstraksi asam (Polytron).

Jumlah sampel bervariasi, tetapi rasio sampel untuk ekstraksi media selalu
sekitar 1: 3. Sampel yang telah di homogenkan selama 10 menit kemudian
disentrifugasi pada 10.000 g selama 10 menit. Supernatan disimpan pada suhu
4 ° C sampai diuji untuk senyawa sianogen.

2.3 Prosedur Enzimatik

Reagen yang digunakan dalam tes enzimatik sebagai berikut: Buffer fosfat pH
7,0, 6,0 dan 4,0 dibuat dari 0.1MH 3 PO 4 dan 0,1 M Na 3 P0 4. Linamarase
dari BDH dilarutkan dalam buffer fosfat pH 6,0 untuk memberikan aktivitas 5
unit enzim (EU) / ml (hidrolisis 5 umol dari linamarin per menit pada 30 ° C
dalam buffer fosfat, pH 6,0). Chloramin T reagen dibuat dengan melarutkan
 0,5 g chloramin T di 100 ml air. Reagen asam / asam barbiturat isonikotinat
dibuat dengan melarutkan 3,5 g asam barbiturat dan 2,85 g asam isonikotinat
dalam larutan 0,5 M NaOH. PH reagen ini disesuaikan antara 7 dan 8 dengan
2M HCl atau NaOH, masing-masing. Aseton sianohidrin, digunakan untuk
mengkalibrasi sampel, dibuat sebagai berikut: Sebuah solusi stok 628 mg
sianohidrin per liter di 0,1 M asam fosfat (sesuai dengan 200 mg HCN / L)
diencerkan dalam 0,1 M asam fosfat sehingga solusi standar yang terkandung
3.1, 9.4, 15.7, 25.1, 31.4, 47.1 dan 62.8 mg / l sianohidrin.

2.4 Prosedur Pengujian

1. Total sianida (cyanogenic glikosida + sianohidrin + HCN)
Dalam tabung tersumbat 1,5 ml, 0,1 ml ekstrak dan 0,05 ml linamarase
ditambahkan 0,45 ml dapar fosfat pH 7,0. Setelah inkubasi pada 37 ° C selama
30 menit, campuran dipindahkan ke tabung 15 ml mengandung 0,6 ml 0,2 M
NaOH. Setelah 5 menit, sampel diencerkan dengan tambahan 2,8 ml dapar fosfat
(pH 6,0) dan dianalisis dalam prosedur spektrofotometri.

2. Sianida bebas (HCN sianohidrin +)

Sejumlah ekstrak 0,1 ml dicampur dengan 0,4 ml dapar fosfat pH 4.0

dalam tabung 15 ml, dan ditambahkan NaOH 2M 0,6 ml. Setelah 5 menit,
tambahkan 2,9 ml buffer fosfat (pH 4.0) dan campuran dianalisis secara
spektrofotometri.

2.5 Standar Kalibrasi

Solusi standar diuji seperti yang dijelaskan dalam IITA. Kurva kalibrasi
ditetapkan setidaknya sekali setiap hari. Untuk sampel, 0,1 ml kloramin T
ditambahkan dan kocok. Setelah 5 menit, pereaksi warna 0,6 ml (asam
isonicotinic / pereaksi asam barbiturat) ditambahkan dan dicampur dengan baik.
Absorbansi diukur secara spektrofotometri setelah 20 menit pada 600 nm.
Analisis duplikat untuk sampel dan solusi standar dilakukan.
2.6 Perhitungan konten sianida

Total sianida, sianida bebas dan konten HCN dari sampel dihitung sebagai
setara HCN mg / kg dwt menggunakan formula di bawah ini.

berat sampel (g)+media ekstraksi (mL)

Faktor ekstraksi =
berat sampel (g)

absorbansi sampel−Y−intersep standar

Konten sianida (mg / l) =
slop standar

Konten sianida (mg / kg fwt) = sampel faktor pengenceran × faktor ekstraksi × larutan
sampel konten sianida

konten sianida (mg/kgfwt x 100)

Konten sianida (mg / kg dwt) =
berat sampel kering

Glikosida sianogenik dihitung sebagai (sianida total dikurangi sianida bebas)

dan sianohidrin sebagai (sianida bebas dikurangi HCN).

2.1 Analisis Data

Data tentang kadar glikosida sianogenik ditentukan, dihitung dan dicatat

dalam mg / kg berat badan baru. Tingkat komputasi glikosida sianogenik
dalam daun, batang dan bagian akar yang berbeda dari jenis liar dan singkong
transgenik dianalisis dengan uji-t siswa yang tidak berpasangan pada tingkat
kepercayaan 95% (P <0,05). Perangkat lunak statistik Minitab (versi 2012)
digunakan untuk analisis data.
 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Penentuan kandungan senyawa sianogen dalam akar dan daun singkong

Kedua jenis singkong liar dan transgenik Kenya dianalisis untuk mengetahui
kandungan senyawa sianogenik linamarin, sianohidrin dan asam hidrosianat
(HCN). Di semua jalur transgenik, ada penurunan yang luar biasa dalam kadar
senyawa sianogenik dibandingkan dengan rekan tipe liar mereka. Jenis liar
Kibanda meno memiliki kadar linamarin dan asam hidrosianat tertinggi,
sedangkan jenis liar Serere memiliki kadar sianohidrin tertinggi. Tipe liar dari
model kultivar TMS 60444 memiliki tingkat terendah dari semua senyawa
sianogenik yang ditentukan dalam penelitian ini.

Kadar linamarin pada genotipe tipe liar lebih tinggi dari 10 mg / kg fwt, yang
merupakan level maksimum yang direkomendasikan linamarin oleh FAO.
Dalam semua genotipe transgenik, kadar linamarin berkurang ke tingkat di
bawah FAO maksimum yang direkomendasikan linamarin.

4.1 Penentuan distribusi total kandungan sianida dalam akar singkong

Secara umum, bagian yang lebih dekat ke korteks akar dan lebih dekat ke
ujung akar basal mengandung lebih banyak sianida daripada bagian di dekat
pusat akar. Untuk tipe liar dari model kultivar TMS 60444, total kandungan
sianida berkisar dari 73 mg / kg fwt untuk bagian cakram pusat dari akar
hingga 286 mg / kg fwt untuk korteks akar. Di sisi lain untuk garis transgenik
TMS 60444, total kandungan sianida berkisar dari 14 mg / kg fwt untuk ujung
akar basal hingga 55 mg / kg fwt untuk wilayah kortikal akar. Akar jenis liar
Adhiambo lera memiliki kadar sianida total mulai dari 69 mg / kg fwt untuk
disk pusat akar hingga 289 mg / kg fwt untuk korteks akar. Total kadar
sianida dalam akar relatif transgeniknya berkisar dari 17 mg / kg fwt untuk
ujung akar basal hingga 62 mg / kg fwt untuk korteks akar. Ada perbedaan
nyata yang nyata dalam kadar sianida total antara garis tipe transgenik dan liar
(P <0,05).

Tingkat sianogenik dari kultivar singkong berkisar dari 10 mg / kg fwt hingga

500 mg / kg fwt . Total kandungan sianida di akar jenis singkong transgenik
liar yang digunakan dalam penelitian ini tidak melampaui batas yang
direkomendasikan Organisasi Kesehatan Dunia yaitu 10 mg/kg singkong
segar.

Distribusi sianida total dalam akar singkong yang dievaluasi dalam penelitian ini
berbeda di antara genotipe yang diteliti. Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa
tingkat ekspresi gen CYP79D1 / D2 bervariasi di antara genotipe singkong. Ini
menyiratkan bahwa beberapa genotipe singkong lebih sianogen daripada yang lain.
 BAB IV
KESIMPULAN

Distribusi sianida total dalam akar singkong yang dievaluasi dalam penelitian ini berbeda di
antara genotipe yang diteliti. Hal ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa tingkat ekspresi gen
CYP79D1 / D2 bervariasi di antara genotipe singkong. Ini menyiratkan bahwa beberapa
genotipe singkong lebih sianogen daripada yang lain.

Tingkat sianogenik dari kultivar singkong berkisar dari 10 mg / kg fwt hingga 500 mg / kg
fwt . Total kandungan sianida di akar jenis singkong transgenik liar yang digunakan dalam
penelitian ini tidak melampaui batas yang direkomendasikan Organisasi Kesehatan Dunia
yaitu 10 mg/kg singkong segar.
 DAFTAR PUSTAKA

1. Heuberger C (2005) Cyanide Content of Cassava and Fermented Products with

Focus on Attiéké and Attiéké Garba. Swiss Federal Institute of Technology,
Zurich, Switzerland.
2. Padmaja G (1995) Cyanide detoxification in cassava for food and feed uses. Crit
Rev Food Sci Nutr 35: 299-339.
3. Halstrom F, Moller KO (1945) The content of cyanide in human organs from
cases of poisoning with cyanide taken by mouth; with a contribution to the
toxicology of cyanides. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh) 1: 18-28.
4. Adewusi SR, Akindahunsi AA (1994) Cassava processing, consumption, and
cyanide toxicity. J Toxicol Environ Health 43: 13-23.
5. Siritunga SD (2002) Generation of acyanogenic cassava (Manihot esculenta
Crantz): transgenic approaches. The Ohio State University, USA.
6. Howlett WP, Brubaker GR, Mlingi N, Rosling H (1990) Konzo, an epidemic
upper motor neuron disease studied in Tanzania. Brain 113: 223-235.
7. Bradbury JH, Bradbury MG, Egan SV (1994) Comparison of methods of analysis
of cyanogens in cassava. Acta Horticulturae 375: 87-96.
8. Cooke RD, De la Cruz EM (1982) An evaluation of enzymic and autolytic assays
for cyanide in cassava. J Sci Food Agric 1001-1009.
9. Rao PO, Hahn SK (1984) An automated enzymatic assay for determining the
cyanide content of cassava (Manihot esculenta Crantz) and cassava products. J
Sci Food Agric 35: 426-436.
10. Approved Organic Analytical Calculations (1990) Hydrocyanic acid in beans.
Official Methods of Analysis AOAC Inc. Arlington, VA, USA.
11. Egan SV, Yeoh HH, Bradbury JH (1998) Simple picrate paper kit for
determination of the cyanogenic potential of cassava flour. J Sci Food Agric 76:
39-48.
12. Cooke RD, Howland AK, Hahn SK (1978) Screening cassava for low cyanide
using an enzymatic assay. Experimental Agriculture 14: 367-372.
13. Essers SAJA, Bosveld M, Van der GRM, Alfons GJV (1993) Studies on the
quantification of specific cyanogens in cassava products and introduction of a
new chromogen. J Sci Food Agric 63: 287-296.
14. Piero NM, Murugi NJ, Okoth OR, Ombori OR, Jalemba MA, et al. (2014) RNAi-
Mediated Downregulation of Cyano-Glycoside Biosynthesis in Kenyan Cassava
(Manihot esculenta Crantz) Genotypes. J Plant Biochem Physiol 3: 148.
15. Bradbury JH, Egan SV, Lynch MJ (1991) Analysis of cyanide in cassava using
acid hydrolysis of cyanogenic glucosides. J Sci Food Agric 55: 277-290.
16. Chávez AL, Sánchez T, Jaramillo G , Bedoya JM, Echeverry J, et al. (2005)
Variation of quality traits in cassava roots evaluated in landraces and improved
clones. Euphytica 143: 125-133.
17. Food and Agriculture Organization/World Health Organization Food standards
programme (1991) Codex Alimentarius Commission X11. Supplement 4. FAO/
UN, Rome, Italy.
18. Cumbana A, Mirione E, Cliff J, Bradbury JH (2007) Reduction of cyanide
content of cassava flour in Mozambique by the wetting Method. Food Chem 101:
894-897.
19. De Brujin GH (1971) Etude du Caractere Cynogenetique du Manioc (Manihot
esculenta, Crantz), Moded Land Hogesch. Wageningen, The Netherlands 71.
20. Cardoso AP, Mirione E, Ernesto M, Massaza F, Cliff J, et al. (2005) Processing of
cassava roots to remove cyanogens. J Food Compost Anal 18: 451-460.
21. Mburu FW, Swaleh S, Njue W (2012) Potential toxic levels of cyanide in cassava
(Manihot esculenta Crantz) grown in Kenya. African Journal of Food Science 6:
416-420.
22. Hidayat A, Zuraida N, Hararida I (2002) The Cyanogenic Potential of Roots and
Leaves of ninety nine cassava cultivars. Indonesian Journal of Agricultural
Science 3: 25-32.
23. Fukuba H, Igarashi O, Briones CM, Mendoza EMT (1984) Cyanogenic
clucxosides in cassava product: Determination and detoxification. Tropical Root
Crops. Postharvest physiology and processing. International Development
Research Centre, Ottawa 225-234.
24. Degró JDM (2009) Converting toxic cyanide into valuable aminoacids: Isolation
of Beta-cyanoalanine synthase in cassava (Manihot esculenta Crantz) and
evaluation of its physiological role. University of Puerto Rico, Mayaguez, Puerto
Rico.
25. Githunguri C, Ekanayake I, Chweya J, Imungi J (1998) The effect of different
ecological zones and plants age on cyanogenic potential of six selected cassava
clones. Post-harvest technology and commodity marketing. Proceedings of Post-
Harvest Conference 71-76.
26. Wheatly CC, Orrego AJI, Sanchez T, Granados FE (1993) Quality evaluation of
cassava core collection at CIAT. In: Roca AM, Thro AM (Eds) Proceedings of the
First International Scientific Meeting of Cassava Biotechnology Network; CIAT,
Cali, Columbia 379-383.
27. O’Brien GM, Wheatley CC, Iglesias C, Poulter NH (1994) Evaluation,
modification and comparison of two rapid assays for cyanogens in cassava. J Sci
Food Agric, 65: 391-399.
28. Food and Agriculture Organization (2007) Cassava production statistics, Rome,
Italy.
29. Bokanga M, Otoo E (1994) Cassava based foods: how safe are they? In: Ofori H,
Hahn SK (Eds) Proceedings of the 9th symposium of the international society for
tropical root crops 225-232.
30. Preuss S, Pikaard CS (2003) Targeted gene silencing in plants using RNA
interference. DNA Press, Saint Louis, USA.
31. Lawrence RJ, Pikaard CS (2003) Transgene-induced RNA interference: a
strategy for overcoming gene redundancy in polyploids to generate loss-of-
function mutations. Plant J 36: 114-121.