BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram

negative, berdasarkan sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi

nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1853-1938

yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan pneumokokus

dan bakteri klebsiella pneumoniae.

Dalam melakukan pewarnaan gram diperlukan empat macam pewarnaan

dengan fungsi yang berbeda yaitu :

· Pewarnaan primer,(dapat memberikan warna pada semua jenis bakteri)

· Pengikat (memperkuat ikatan kompleks antara pewarna dengan komponen

dinding bakteri

· Penghilang warna (melarutkan sisa zat warna dan kompleks zat warna dengan

lipid pada dinding bakteri)

· Pewarnaan pengganti (memberikan warna pada dinding bakteri yang

kehilangan pewarna primernya.

 Pada dasarnya bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu (tongkat), kokus dan

spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa

macam. Pada bentuk basil pembagianya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.

Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak),

diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur). Khusus pada

spirul hanya dibagi 2 yaitu setenggah melengkung dan tidak

melengkung.Stapylococcus aureus adalah bakteri gram positif yang berbentuk bola.

Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah anggur.Beberapa

karakteristik yang dimiliki staphylococcus Aureuss diantaranya hemolytic pada darah

agar, catalase-oxidase-positif dan negative, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15

sampai 45 derajat dan lingkungan NaCI pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan

menghasilkan enzim coagulase. Selain itu, biasanya Stapylococcus aureus merupaka

pathogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru, radang

kelenjar dada, radang urat darah serata menyebabkan keracunan makanan yaitu

dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan

melepaskan superantigens kedalam aliran darah.

E.coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2

mikrometer dan diameter 0,5 mikrometer. Volume sel E.coli berkisar 0.6-0,7

mikrometer kubik. Bakteri ini termasuk umumnya hidup pada rentang 20-40 derajat

C, optimum pada 37 derajat. Kita mungkin banyak yang tidak tahu jika diusus besar

manusia terkandung sejumlah E.colli yang berfungsi membusukkan sisa makanan.

I.2 Maksud dan Tujuan

I.2.1 Maksud Percobaan

Mampu mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan

sederhana dan pewarnaan gram.

I.2.2 Tujuan Percobaan

1. Mengamati morfologi bakteri dengan menggunakan metode pewarnaan sederhana,

dan pewarnaan gram.

2. Menentukan penggolongan bakteri dengan metode pewarnaan gram

I.3 Prinsip Percobaan

Pewarnaan Gram : merupakan pewarnaan diferensial yang membedakan antara

bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri

mempertahankan warna para rosanilin, seperti kristal violet, metil violet atau gentian

violet setelah proses dekolorisasi dengan aseton, alkohol atau aseton iodium.

Pewarnaan Sederhana : didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya terdiri dari

satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang tepat

untuk melihat morfologi bakteri secara umum.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Teori Umum

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak

digunakan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,karena

selain bakteri itu tidak berwarna juga tranparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal

tersebut maka dikembangkan suatu tekhnik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat

terlihat jelas dan mudah diamat. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini

merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian

mikrobiologi.

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen

selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.

Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun

pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan asam dan

pewarna basa.

Pewarna asam dapat terjadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif.

Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif,

sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka

sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam

misalnya: tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat, eosin, dll.

 Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan

diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Contoh

dari pewarna basa misalnya metilen biru, kristal violet, safranin, dan lain-lain. Teknik

pewarnaa asam basa ini hanya menggunaka satu jenis senyawa pewarna, teknik ini

disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati

morfologi, baik bentuknya maupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah

pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu

jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan

gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk

mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora, dan nukleus.

II.2 Metode pewarnaan

Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preaparat

ulas, pewarnaan mikroorganisme dan pengamat dengan mikroskop pewarna bereaksi

secara kimiawi dengan protoplas bakteri, apabila sel belum mati, proses pewarnaan

akan membunuhnya. Proses ini merupakan proses yang cepat dan menghasilkan suatu

artefak.

1.Pewarnaan Gram

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarnaan basa, Kristal

violet. Larutan iodine kemudian ditambahkan, semua bakteri akan diwarnai biru pada

fase ini. Sel kemudian diberi alcohol. Sel gram positif akan tetap mengikat senyawa

Kristal violet-iodine, tetapi berwarna biru, sel warna negative warnanya hilang oleh

alcohol. Sebagai langakah terakhir, counterstain ( mis. Safranin pewarna merah )

ditambahkan, sehingga sel gram negative yang tidak berwarna, akan mengambil

nama kontras, sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru. Dasar perbedaan

reaksi gram adalah struktur dinding sel.

Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar

yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, ada kemungkinan hasil

pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding

selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu

dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding

yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan kompleks warna Kristal violet-iodine

sehingga terlihat sebagai bakteri gram negative.

Reagen yang digunakan dalam pewarnaan ini adalah:

Crystal Violet

Larutan A: Kristal Violet 20 gram

Etanol (95%) 20 ml

Larutan B: Ammonium Oksalat 0,8 gram

Aquadest 8 gram

Campurkan larutan A dan B , simpan selama 24 jam sebelum digunakan

Garam iodine/lugol
Iodine Kristal 1,0 gr

Potassium iodine 2.0 gr

Aquadest 300 ml

Gerus Kristal dalam mortar. Tambahkan aquadest sedikit demi sedit hingga iodine

larut

Larutan safranin

Larutan stok :

safranin O 2,5 gr

Etanol 100 ml

Cara penggunaan ; campur larutan stok 10 ml dengan aquadest 90 ml

2.Pewarnaan Negatif

Pewarnaan negative untuk melihat adanya kapsul disekelilingi mikroorganisme.

Prosedur ini meliputi pewarnaan latar belakang dengan pewarna asam, dan

membiarkan sel tidak berwarna pada metode ini preparat tidak dipanaskan diatas api,

melainkan di keringkan di udara.

3.Pewarnaan Sederhana

Prosedur pewarnaan sederhana untuk melihat bentuk, ukuran dan penataan

mikroorganisme. Pada bakteri dikenal bentuk, yaitu bulat, (kokus), batang (basil),

koma (vibrio ) dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan

bakteri seperti rantai (streptococcus), buah anggur (statiflococcus) dsb. Pewarnaan

sederhana disebut juga pewarnaan loeffers methylene blue. Reagen yang digunakan

dalam pewarnaan ini adalah : metilen biru 0,3 gr dalam aquadest 100 ml.

Bakteri gram positf dan gram negative dan 4 bentuk bakteri yaitu : coccus, batang,

vibrio dan spiral.

II.3 Klasifikasi

a) Escherichia coli

Divisi :Protophyta

Kelas :Schizomycetes

Ordo :Eubacteriales

Famili :Enterobacteriaceae

Genus :Escherichia

Spesies : Escherichia coli

b) Streptococcus mutan

Kingdom : Monera

Divisio : Firmicutes
Class : Bacilli

Ordo : Lactobacilalles

Family : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Species : Streptococcus mutans

Streptococcus mutans merupakan bakteri gram positif, bersifat nonmotil

berbentuk bulat atau bulat telur dan tersusun dalam rantai..Bakteri ini tumbuh secara
0 0
optimal pada suhu sekitar 18 -40 Celsius. Streptococcus mutans biasanya ditemukan

pada rongga gigi manusia yang luka dan menjadi bakteri yang paling kondusif

menyebabkan karies untuk email gigi. (tidak bergerak), bakteri anaerob fakultatif.

Memiliki bentuk kokus yang sendirian.

Bakteri Escheria Coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif,

berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang

lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang

bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula,

berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm, dapat bertahan hidup di medium sederhana

dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam dan gas, kandungan G+C DNA

ialah 50 sampai 51 mol % (Pelczar dan Chan, 1988:949) .

II.4 Uraian Bahan :

1. Alkohol

Nama resmi : Aethanolum

Nama lain : Etanol/Alkohol

Pemerian : cairan tak berwarnah, jernih, mudah menguap dan mudah

bergerak ; bau khas; rasa panas. Mudah terbakar dengan memberikan

nyala biru yang tidak berasap

Penyimpanan : dalam wadah tertutup, terlindungi dari cahaya; di tempat sejuk, jauh

dari nyala api.

Kegunaan : sebagai pembersih dan sebagai gram C pada pengecatan gram.

2. Air suling

Nama resmi : Aqua destilata

Nama lain : Air suling/aquadest

RM/RB : H2O/18,02

Pemerian : Cairan jernih tidak berwarna, mudah menguap,bau khas, dan tidak

mempunyai rasa.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup

Kegunaan : sebagai pembilas

3. Kristal violet

Nama resmi : Kristal violet

Pemerian : Sukar larut dalam air, agak suka larut dalam etanol (95%) P

larutannya berwarna lembayung tua.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup.

Kegunaan : Sebagai cat utama atau gram A dalam pengecatan gram.

4. Iodium

Nama resmi : Iodum

Nama lain : Iodium

RM/BM : I/126,91

Pemerian : Keping atau butir, berat, mengkilat, seperti logam, hitam

kelabu, bau khas

Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 3500 bagian air, dalam 13 bagian etanol

(95%) P dalam lebih kurang 80 bagian gliserol P dan dalam lebih

kurang 4 bagian karbondisulfur P, larut dalam kloroform P dan dalam

karbontetrakloroda P.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.

Kegunaan : Sebagai komposisi cat B

5. Metilen blue

Nama resmi : Methylthionnini chloridum

Nama lain : Biru metilen

RM/BM : C16H18CIN3S.3H2O/373,90

Pemerian : Hablur atau serbuk hablur hijau tua, berkilauan seperti perunggu,

tidak berbau atau praktis tidak berbau. Stabil diudara; larutan dalam air

dan dalam etanol berwarnah biru tua.

Kelarutan : larut dalam air dan dalam kloroform; agak sukar larut dalam etanol
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan : Sebagai cat utama dalam pengecatan sederhana.

6. Safranin

Nama resmi : Safranin

Pemerian : Serbuk halus berwarna biru keunguan.

Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol.

Penyimpanan : Dalam tertutup wadah rapat.

Kegunaan : Sebagai komposisi cat D

 BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat yang digunakan

1. Lampu spiritus

2. Korek

3. Kaca preparat

4. Pipet tetes

5. Kasa asbes

6. Botol semprot

7. Mikroskop

8. Rak tabung

9. Tabung reaksi

10. Oce bulat

III.1.2 Bahan yang digunakan

1. Mehtylen blue

2. Escherichian colii

3. Streptococcus mutans

4. Alkohol asam

5. Lugol

6. Kristal violet

III.3 Cara Kerja

1.Pewarnaan Garam

a) Buatlah sediaan di atas kaca objek, keringkan pada suhu kamar dan

kemudiaan panaskan da atas nyala api 3-4 kali. Lalu dinginkan.

b) Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan.

c) Teteskan larutan Kristal violet lalu diam kan selama 1 menit.

d) Bilas dengan air.

e) Teteskan larutan lugol lalu diamkan selama 1 menit.

f) Bilas dengan air

g) Teteskan larutan alkohol asam selama 10-20 detik.

h) Bilas dengan air.

i) Teteskan dengan larutan safrani diamkan selam 15 detik .

j) Bilas dengan air kemudian keringkan.

k) Amati bentuk dan warna bakteri dengan menggunakan mikroskop dengan

lensa objektif 100 kali.

2.Pewarnaan Sederhana

a) Buatlah sediaan diatas kaca objek, keringkan pada suhu kamar dan kemudian

panaskan diatas nyala api 3-4 kali. Lalu dinginkan.

b) Letakkan sediaan diatas rak pewarnaan

c) Tuangkan larutan metilen biru hingga menutup sediaan. Diamkan 1 menit.

d) Bilas dengan air hingga warna hilang , kemudian keringkan

e) Lihat dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali, menggunakan minyak

imersi.

f) Hasil semua bakteri akan berwarna biru, bentuknya akan terlihat jelas.
 BAB IV

HASIL PENGAMATAN

IV.1 Hasil Pengamatan

Nama Bakteri Pewarnaan Gambar Keterangan

Escherichia coli Gram Gram negatif dan

berwarna merah

Escherichia coli Sederhana

Berbentuk basil

(batang)
Streptococcus Sederhana

mutans Berbentuk rantai

Streptococcus Gram Gram positif dan

mutans berwarna ungu

IV.2 Pembahasan

Macam-macam pewarnaan yang dilakukan dalam praktikum tentang cara-cara

pewarnaan antara lain :

a.Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan.

Berbagai macan tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu

mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.

Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Reagen yang

digunakan dalam pewarnaan ini adalah metilen blue terserap selama 1-2 menit,

dengan demikian bakteri yang terdapat pada sampel akan menyerap zat warna yang

diberikan.

Pewarnaan sederhana dalam praktikum kali ini dilakukan pada bakteri

Escherichia coli dan Streptococcus mutans. Escherichia coli ternyata bentuk dari

bakteri ini adalah basil atau batang sedangkan Streptococcus mutans berbentuk

coccus berantai.

b. Pewarnaan Gram

Tujuan dari pewarnaan gram adalah untuk melakukan pengamatan morfologi

bakteri dengan pewarnaan diferensial. Prinsip pewarnaan gram termasuk pewarnaan

diferensial (untuk membedakan) karna dapat membedakan bakteri-bakteri yang

bersifat gram negatif dan positif. Pewarnaan ini ditemukan pertama kali pada tahun

1884 oleh Criestian Gram.

 Bakteri garam positif ialah bakteri yang mengikat warna utama (crystal violet)

dengan kuat sehingga tidak dapat dilunturkan oleh peluntur dan tidak diwarnai lagi

oleh zat warna lawan (safranin) pada mikroskop sel-sel bakteri tampak berwarna

ungu.

Bakteri gram negatif ialah bakteri yang mempuyai daya mengikat zat warna

utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan oleh peluntur dan dapat diwarnai oleh

zat warna lawan (safranin) pada pengamatan mikroskop sel-sel bakteri tampak

berwarna merah. Fungsi zat warna:

Crystal violet yang berfungsi membentuk ikatan mg-Ribonucleid acid pada

membran/dinding sel bakteri sehingga membentuk kompleks mg-Ribonucleid acid-

crystal violet. Kompleks ini merupakan senyawa yang tidak luntur dengan alkohol.

Lugol’s iodin yang berfungsi sebagai penguat ikatan pada kompleks mg-

Ribonuclead acid.

Alkohol 95% berfungsi mencuci lemak pada dinding sel bakteri.

Safranin berfungsi sebagai zar warna tandingan (lawan) luruh nya kompleks

mg-Ribonucleid acid- crystal violet dari dinding sel bakteri gram negatif (Pelczar,

2007).

Pewarnaan gram dalam praktikum kali ini dilakukan juga pada bakteri

Escherichia coli dan Streptococcus mutans. Escherichia coli ternyata teridentifikasi

termasuk bakteri gram negatif karena ditandai dengan hasil akhir pengamatan

berwarna merah sedangkan Streptococcus mutans termasuk bakteri gram positif

dengan warna ungu.

 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Dari praktikum pewarnaan dan cara-cara pewarnaan dapat diambil

kesimpulan dalam praktikum kali ini digunakan 2 macam metode pewarnaan, yaitu:

pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram

Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan bakteri

dengan bentuk basil dan kokus serta berwarna ungu dalam pembesaran 100x. Pada

pewarnaan gram ditemukan bahwa bakteri Escherichia coli adalah bakteri jenis gram

negatif dengan warna merah dan memiliki bentuk basil pada perbesaran mikroskop

hingga 100x. Dan bakteri Streptococcus mutans adalah bakteri jenis gram positif

dengan warna ungu dan memiliki bentuk coccus (bulat) yang berantai pada

perbesaran mikroskop hingga 100x.

5.2 Saran

Sebaiknya pada praktikum selanjutnya praktikum lebih berhati-hati dan teliti

pada saat pengerjaan .Selain itu kerjasama antar praktikum dan pengawas juga lebih

ditingkatkan lagi agar praktikum berjalan dengan lancar.

 DAFTAR PUSTAKA

Anur,Israyanti.PewarnaanGram.Diakses 12 April
2015.http://israyantianur.blogspot.com/2013/05/pewarnaan-gram_31.html.

Meydasari,Selva.2012. Escherichia coli (taksonomi dan morfologi).

http://selvamei18.blogspot.com/2012/04/taksonomi-escherichiacoli-sebagai.html.
Diakses 12 April 2015

Firman.2012.SkripsiFirman.repository.unhas.ac.id/
bitstream/.../SKRIPSI%20FIRMAN%20FIX.docx?. Diakses 12 April 2015

Wahyuni,Ita Trie.2012.Laporan Mikrobiologi Pewarnaan.

http://itatrie.blogspot.com/2012/10/laporan-mikrobiologi-pewarnaan.html.
Diakses 12 April 2015

Semuacoretankuliah.2013.Laporan Pewarnaan
Mikrobiologi.http://semuacoretankuliah.blogspot.com/2013/09/laporan-
mikrobiologi-pewarnaan-dan-cara.html.Diakses 12 April 2015

Pakadang,Sesilia R.,dkk.2015.Buku Penuntun Praktikum Laboratorium

Mikrobiologi dan Parasitologi.Makassar:Tim penyusun.

Alex.2013.Praktikum Perwarnaan Bakteri.

http://alexschemistry.blogspot.com/2013/10/laporan-praktikum-pewarnaan-
bakteri_24.html . Diakses 17 April 2015