24

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat yang digunakan untuk mengambil dan menyimpan

sampel darah adalah kasa, kapas, jarum suntik sekali pakai ukuran 3

cc (Nipro®), jarum abboceth No.20 (Vasofix®), plester kasa

(Hipavix®) dan tabung vacuum K3EDTA (Vacuntainer®). Alat untuk

keperluan analisis kadar trisulfa dalam serum adalah tabung reaksi

(Pyrex®) 5 mL dan 10 mL, rak tabung, micropipette 1000 µL

Hamilton, pipet ukur 1 mL dan 5 mL, ballfiller, lemari pendingin,

penghomogen (vortex), pemusing (sentrifuge), neraca analitik listrik

dan spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu®).

III.1.2 Bahan

Bahan yang diteliti adalah cuplikan plasma yang diperoleh

dari darah subjek penelitian. Sediaan trisulfa yang digunakan untuk

penelitian adalah tablet 500 mg produksi Indonesia (Kimia Farma®).

Larutan NaOH (Merck®) 1 N, larutan TCA (Merck®) 5 %, larutan

natrium nitrit (Merck®) 0,1 %, larutan amonium sulfamat(Merck®)

0,5 %, larutan N(1-naftil) etilendiamin(Merck®) 0,1 % dan akuades

untuk keperluan analisis penetapan trisulfa dalam serum. Bahan yang

 25

digunakan untuk pengambilan sampel darah adalah etanol 70 % dan

larutan fisiologis natrium klorida 0,9 % steril (Otsuka®).

III.1.3 Subyek Uji

Subyek uji pada penelitian ini adalah laki-laki dewasa (umur

17-34 tahun) dengan berat badan sekitar 55-70 kilogram, suku

Dayak Kanayatn murni minimal tiga generasi, dan bertempat tinggal

di kota Pontianak, Kalimantan Barat. Probandus dalam keadaan

sehat, dibuktikan dengan hasil pemeriksaan klinik dan laboratorium

yang meliputi pemeriksaan fungsi hati dan ginjal. Calon probandus

yang pada pemeriksaan kesehatan didapatkan kelainan ginjal,

mempunyai riwayat penyakit hati, mempunyai riwayat alergi

terhadap trisulfa atau mempunyai kebiasaan merokok atau minum

alkohol tidak disertakan dalam penelitian ini.

III.2 Prosedur Penelitian

III.2.1 Validasi Metode

III.2.1.1 Menetapkan Panjang Gelombang Maksimum Trisulfa

Digunakan larutan Trisulfa dengan kadar 100 dan 400

µg/mL dan diukur resapannya darp panjang gelombang 450

sampai dengan 600 nm.

 26

III.2.1.2 Pembuatan Kurva Baku Trisulfa

a. Kurva Baku Eksternal

Ke dalam tabung reaksi yang telah berisi akuades

500 µL ditambahkan 500 µL larutan stok obat dengan kadar

0; 10; 15; 20; 25; 50; 100 dan 200 µg/mL kemudian

divortex. Ditambah Tricloroasetat acid (TCA) 5% sebanyak

4 mL dan disentrifuse pada 2500 rpm selama 5 menit.

Masing-masing tabung diambil sebanyak 3 mL dan

ditambah dengan akuades sebanyak 4 mL. Selanjutnya

ditambahkan dengan Natrium Nitrit 0,1 % sebanyak 0,2

mL, divortex dan diamkan selama 3 menit. Ditambahkan

larutan Amonium Sulfamat 0,5% sebanyak 0,4 mL dan

divortex, diamkan selama 3 menit. Terakhir ditambahkan N-

(1-naftil)-etilendiamin (NED) 0,1% sebanyak 0,4 mL,

divortex dan diamkan selama 5 menit ditempat gelap.

Selanjutnya masing-masing tabung dengan seri kadar

tertentu diukur intensitas warna pada Spektrovotometer UV-

Visible dengan panjang gelombang yang telah didapat pada

saat penentuan panjang gelombang maksimum.

b. Kurva Baku Internal
Ke dalam blangko darah 500 µL yang

mengandung anti koagulan ditambahkan 500 µL larutan

stok obat dengan kadar 0; 10; 15; 20; 25; 50; 100 dan 200

µg/mL kemudian divortex. Ditambah Tricloroasetat acid

(TCA) 5% sebanyak 4 mL dan disentrifuse pada 2500 rpm

 27

selama 5 menit. Masing-masing tabung diambil sebanyak 3

mL dan ditambah dengan akuades sebanyak 4 mL.

Selanjutnya ditambahkan dengan Natrium Nitrit 0,1 %

sebanyak 0,2 mL, divortex dan diamkan selama 3 menit.

Ditambahkan larutan Amonium Sulfamat 0,5% sebanyak 0,4

mL dan divortex, diamkan selama 3 menit. Terakhir

ditambahkan N-(1-naftil)-etilendiamin (NED) 0,1%

sebanyak 0,4 mL, divortex dan diamkan selama 5 menit

ditempat gelap. Selanjutnya masing-masing tabung dengan

seri kadar tertentu diukur intensitas warna pada

Spektrovotometer UV-Visible dengan panjang gelombang

yang telah didapat pada saat penentuan panjang gelombang

maksimum.

III.2.1.3 Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak dan

Kesalahan Sistemik

Dibuat larutan obat dengan seri kadar 0; 25; 50; 100;

200 µg/mL. Tiap kadar dibuat 3 kali replikasi. Masing-masing

kadar diambil 0,1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi

berisi 3,9 mL akuades. Berdasarkan persamaan garis dari kurva

baku yang telah dibuat, ditentukan kadar masing-masing.

Dihitung kadar rata-rata dan simpangan bakunya.

 28

Perolehan kembali (Recovery) merupakan tolak ukur

efisiensi analisis. Perolehan kembali dapat dicari dengan

menggunakan rumus di bawah ini :

Perolehan Kembali (R %) = x 100%

Kesalahan sistematik (Systematical error) merupakan

tolak ukur inakurasi penetapan kadar, bisa merupakan

kesalahan konstan dan kesalahan proporsional. Kesalahan

sistematik dapat dicari dengan menggunakan rumus di bawah

ini :

Kesalahan Sistematik = (100-R)%

Kesalahan acak (Random analytical error) merupakan

tolak ukur inpresisi suatu analisis dan dapat bersifat positif

atau negatif. Kesalahan acak identik dengan variabilitas

pengukuran dan dicerminkan oleh tetapan variasi. Kesalahan

acak dapat diperoleh dengan menggunakan rumus di bawah

ini:

Kesalahan Acak (CV) = x 100%

III.2.2 Penetapan Kadar Trisulfa Dalam Darah

III.2.2.1 Perlakuan Pra Penelitian

 29

Paling tidak 2 minggu sebelum dilakukan penelitian,

probandus tidak minum obat apapun, demikian pula selama

menjalani penelitian. Semalam sebelum dilakukan penelitian,

probandus diminta berpuasa (10-12 jam) hanya air putih boleh

diminum secukupnya. Pada hari saat penelitian dilakukan

probandus datang ke ruang uji pada pukul 07.00 WIB. Probandus

diberikan trisulfa dengan dosis 500 mg (1 kaplet) secara oral.

III.2.2.2 Pengambilan Sampel Darah

Pengambilan sampel darah sebanyak 2-3 mL dilakukan

pada menit ke 0 (sebelum minum obat) dan menit ke 5, 10, 15,

30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390,

420, 450, 480, 510 dan 540 setelah obat diminum. Kemudian

kadar trisulfa dalam darah ditetapkan dengan metode Bratton-

Marshall.

III.2.2.3 Penetapan Kadar Trisulfa

Metode Bratton-Marshall (Annino, 1964) dalam 500 μL

cuplikan darah yang mengandung antikoagulan ditambahkan 500

μL aquadest. Setelah homogen, ditambah dengan TCA 5 %

sebanyak 4,0 mL; setelah itu, campuran tersebut disentrifugasi

dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit; diambil supernatan

sebanyak 3 mL dan encerkan dengan akuades 4 mL, kemudian

ditambahkan natrium nitrit 0,1 % 0,2 mL dan didiamkan selama 3

menit. Selanjutnya ditambahkan amonium sulfamat 0,5 %

 30

sebanyak 0,4 mL dan didiamkan selama 2 menit, kemudian

ditambahkan N(1-naftil) etilendiamin (NED) 0,1 % 0,4 mL dan

didiamkan 5 menit ditempat gelap. Intensitas warna yang terjadi

dibaca pada spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum yang sebelumnya telah ditentukan terlebih dahulu

(545 nm menurut literatur). Perlakuan terhadap blanko darah

sebagai kontrol yang diproses dengan cara yang sama. Kadar

trisulfa diukur menggunakan kurva baku internal yang telah diuji

liniearitas dengan menggunakan seri kadar trisulfa (0; 5; 10; 15;

20; 25; 30; 40; 50; 100; 200; 400 µg/mL darah).

III.2.2.4 Pembuatan Profil Kadar Trisulfa

Berdasarkan data plasma yang didapat dalam setiap waktu,

dapat dibuat suatu kurva konsentrasi plasma (C p) terhadap waktu

(t). Data plasma sebagai sumbu y dan waktu sebagai sumbu x.

III.2.2.5 Perbandingan Profil Kadar Trisulfa Suku Dayak Kanayatn

Profil kadar trisulfa pada suku Dayak Kanayatn yang

didapat kemudian dibandingkan dengan profil farmakokinetika

pada suku Melayu dan Tionghoa.