Nama / NPM : Valerie Yovita Edward / 1802101020001

: Anggi Anggraini Ulfa / 1802101020011

ELISA

Pengertian, prinsip, tujuan dan fungsi ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan suatu uji serologi, yang
didasarkan pada prinsip terjadinya ikatan antara antigen dan antibodi spesifik. Ikatan antara
antigen dan antibodi akan dilabel dengan enzim dan substrat yang selanjutnya
divisualisasikan dengan terbentuknya warna yang dapat dibaca oleh ELISA reader (Rasmana,
2009). Metode ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan
Eva Engvall dalam bidang imunologi (ELISA konvensional). Metode tersebut dikembangkan
untuk mendeteksi keberadaan antigen maupun antibodi di dalam suatu sampel, dimana
interaksi tersebut menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pemberi sinyal (Sugiono
dkk., 2010). Seiring perkembangan ilmu pengetahuan, metode ELISA juga telah diaplikasi
dalam bentuk yang lain, seperti analisis hormon pada darah, urin, air liur, feses, dan kultur
jaringan. Fungsi dari uji ELISA yaitu bukan hanya untuk mengetahui keberadaan suatu
antigen dengan antibodi tetapi juga untuk mengukur kadar antigen atau antibodi tersebut
dengan menggunakan alat spektrofotometer.

Teknik ELISA
Teknik ELISA mempunyai 3 metode, yaitu dierect, indirect dan sandwich
1. ELISA Sandwich
 Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif
ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya
saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun,
karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibodi primer
spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini
cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan
antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, sedangkan antibodi
sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan
dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat
sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen tersebut
untuk berinteraksi dengan kedua antibodi. Pada ELISA sandwich, pertama microtiter diisi
dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut
dapat menempel pada bagian dinding lubang microtiter.
Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang tidak
menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung
antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi
interaksi antara antibodi penangkap dengan antigen yang diinginkan. Selanjutnya, microtiter
kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak berinteraksi dengan antibodi penangkap.
Lalu, kedalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi detektor, sehingga
pada lubang microtiter tersebut terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan
antibodi detektor. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor yang
tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap akhir ELISA indirect,
ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut pada
antibodi detektor yang telah berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi
dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat
sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi penangkap yang
berhasil menempel pada dinding lubang microtiter dan Afinitas dari antibodi penangkap dan
antibodi detektor terhadap antigen Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan
pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun
demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat
diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua
jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda
(epitopnya harus berbeda).

2. ELISA Direct

Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini
seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel.
ELISA direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi
keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Prinsip kerja Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang
mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada
bagian dinding-dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang
antigen yang tidak menempel pada dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah
ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang- lubang microtiter sehingga
antibodi dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan dengan
membilas microtiter untuk membuang antibodi tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi
dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter tersebut ditambahkan substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah
berinteraksi dengan antigen yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan
menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan
antigen tersebut selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri,
chemiluminescent, atau fluorescent end-point.
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain :
 Immunoreaktivitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
 Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.
 Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
 Amplifikasi signal hanya sedikit.
 Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
 Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibodi
 Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibodi lain (antibodi sekunder) dapat diminimalisasi

3. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang
paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik
(monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.
 Prinsip Kerja :
Pada ELISA indirect, pertama microtiter diisi dengan larutan yang mengandung
antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapat menempel pada bagian dinding
lubang microtiter. Selanjutnya microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
menempel pada dinding lubang microtiter. Kemudian larutan sampel yang mengandung
antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang microtiter, sehingga terjadi
interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan.
Selanjutnya, microtiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak
berinteraksi dengan antigen spesifik. Lalu, ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan
yang berisi antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal, sehingga pada lubang microtiter
tersebut terjadi interaksi antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder spesifik
tertaut enzim signal. Selanjutnya microtiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder
tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik. Kemudian pada tahap
akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu
enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah berinteraksi dengan antibodi
yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.
ELISA indirect memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
 Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA direct
karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat
terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan
antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,
sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu
pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi
spesifik tertaut enzim signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:
 Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang terjual bebas.
 Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada
wadah berbeda.
 Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder
Komponen Perangkat (Kit) ELISA
Pengukuran konsentrasi hormon atau serologi dengan metode ELISA memerlukan kit
ELISA. Komponen utama kit ELISA secara umum terdiri atas Antibodi (Ab), Antigen (Ag),
imunoprob, substrat, blocking reagent, buffer, dan plate. Kit ELISA dapat diperoleh
berbentuk hasil produksi sendiri (home assay kit) maupun komersial dari berbagai macam
perusahaan. Adapun kegunaannya sebagai berikut:
Antibodi adalah immunoglobulin (Ig) dari hewan yang diimunisasi antigen patogen
sasaran (AgP). Berdasarkan teknik produksi dan spesifisitas reaksinya, Ab dibedakan menjadi
Ab poliklonal (PAb) dan Ab monoklonal (MAb), sedangkan menurut bentuk molekulnya
dibedakan menjadi Ab dan F(ab’)2. Ab juga dibedakan menjadi Ab primer (AbP) dan Ab
sekunder (AbS). AbP adalah Ab yang homolog atau bereaksi dengan AgP, diproduksi dengan
mengimunisasi hewan, seperti mencit dan kelinci, dengan AgP. AbS atau anti-AbP adalah Ab
yang diproduksi dengan mengimunisasi hewan lain seperti kambing dengan AbP.

Antigen yang digunakan sebagai AgP pada teknik ELISA adalah partikel virus, sel
bakteri, propagul jamur, atau senyawa protein dan polisakarida patogen yang antigenik, dapat
merangsang timbulnya Ab pada hewan yang diimunisasi. AgP digunakan sebagai kontrol
positif pada uji ELISA.

Imunoprob untuk ELISA dibuat dengan mengkonjugasikan Ab dengan suatu enzim

menjadi ‛konjugat Ab-enzim’. Konjugat ini dapat dibuat dengan mengkonjugasikan AbP atau
AbS dengan enzim tertentu. Enzim yang digunakan untuk membuat konjugat beragam, yang
paling umum adalah Alkaline Phosphatase (AP) dan Horse-radish Peroxidase (HRP)
(Converse dan Martin 1990).

Substrat merupakan senyawa kimia yang digunakan sebagai media (substrate) untuk
reaksi enzimatik berbeda-beda, bergantung pada enzim yang digunakan. Enzim AP
memerlukan p-nitrophenylphosphate (PNPP) yang dilarutkan dalam diethanolamine 10%.
Substrat ini dihidrolisis oleh enzim menjadi p-nitrophenyl (PNP) yang berwarna kuning.
Enzim HRP menggunakan substrat tetramethyl benzidine (TMB) yang dilarutkan dalam
dimethylsulsulfoxide (DMSO), substrat ini dihidrolisis menjadi enzim menjadi produk
berwarna biru (Priou 2001).

Reagen lain yang diperlukan dalam ELISA adalah buffer, blocking reagent, dan
pelarut substrat. Buffer dasar yang paling sering digunakan dalam ELISA adalah buffer fosfat
(Phosphate-Buffered Saline, PBS) dan buffer karbonat. Buffer lain, seperti buffer ekstraksi,
buffer pencuci, buffer Ab, buffer konjugat, dan buffer substrat dibuat dengan menambahkan
senyawa kimia tertentu seperti Tween-20, polyvinylpirrolidone (PVP), dan 2-
mercaptoethanol pada bufer dasar. Senyawa yang sering digunakan untuk blocking reagents
adalah bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OA), gelatin, susu skim, NaOH, dan asam
sulfat (H2SO4) (Lazarovits, 1990).

Plate, reaksi ELISA yang pertama kali digunakan adalah plate polystyrene berlubang
dengan jumlah 96 sumur yang disebut ELISA plate atau microtiter plate. Plate lain yang
digunakan ada juga yang terbuat dari polyvinyl dan bahan plastik. Plate ELISA diproduksi
oleh berbagai perusahaan dengan bahan dan merek berbeda memiliki kualitas pengikatan Ab
(Ab binding capacity) yang bervariasi, sehingga perlu melakukan uji coba untuk memperoleh
hasil optimal (Converse dan Martin 1990).

Penyakit yang dapat diuji mengunakan ELISA

Beberapa penyakit yang dapat diuji menggunakan ELISA antara lain paratuberkulois,
motil aeromonas septicemia, Brucellosis, rabies, toxoplasmosis dll. ELISA dapat menguji
beberapa penyakit berdasarkan jenis dan produk kit yang digunakan/diproduksi seperti kit
yang diproduksi oleh r-biopharm, kit ini hanya dapat menguji dua jenis penyakit yang
disebabkan oleh bakteri seperti salmonella dan staphylococcus aureus, akan tetapi kit ini
tidak dapat di gunakan untuk penyakit viral.