Tugas Bank Darah dan Immunohematologi

Jurnal Review
“Evolution in Cross Matching & HLA
Typing Techniques And their Clinical
Significance”

Mohammad Reza Taufiq Pratama

G4C018007

S2 SainsLaboratoriumMedis
UniversitasMuhammadiyah Semarang
 2019
A. Pendahuluan
pada tahun 1967 Sejak penemuan mayor histokompatibilitas kompleks (MHC), telah
ada perkembangan yang signifikan di bidang organ dan transplantasi jaringan. Protein
permukaan sel ini adalah faktor penentu antigenik Penolakan transplantasi. Kehadiran HLA
khusus antibodi donor pada penerima transplantasi ginjal bisa diidentifikasi dengan
crossmatching. Sejak 1969,. Peningkatan sensitivitas dan spesifisitas virtual crossmatch bila
dibandingkan dengan CDC dan flow crossmatches telah merevolusi pra transplantasi proses
crossmatch, tetapi juga sangat meningkatkan kompleksitas.
Antigen HLA adalah kompleks glikoprotein yang dikodekan oleh sekitar 200 gen
yang membentuk MHC pada kromosom 6 pada manusia. Gen-gen ini diatur menjadi 3 klaster
pengkodean 3 berbeda gen polimorfik (Gambar 1). MHC Kelas I gen alfa rantai MHC-A,
MHC-B dan MHC-C diekspresikan pada semua sel berinti. MHC kelas II Alfa dan beta rantai
gen yang bergabung membentuk MHC-DR, MHC-DP dan MHC-DQ diekspresikan pada
Antigen Presenting Cells (APCs). Kelas MHC Gen III mengkodekan berbagai komponen
larut komplemen dan sitokin lainnya.

B. Test Pra Transplantasi

PRA; Golongan darah ABO; HLA tissue typing; Serum cross-matching.

Keterangan: U, usually :V, variable :R, rarely: I, increasing use

1. Panel Reactive Antibodies (PRA)

PRA telah digunakan untuk mengukur kepekaan HLA pasien Mulai dari sebelumnya
dibentuk Antibodi spesifik donor, HLA dikaitkan dengan penolakan hiperakut dalam
transplantasi ginjal pada 1960-an [2]. Tujuan dari tes ini adalah untuk menentukan seberapa
mudah atau sulitnya menemukan donor yang kompatibel. dinyatakan sebagai persentase
yang mewakili persentase populasi yang tidak cocok donor. Panel donor 20-50 limfosit yaitu
dipilih dari populasi donor untuk diwakili distribusi alel HLA. Jika limfosit mengekspresikan
antigen HLA di mana penerima memiliki antibodi, komplemen membran-serangan bentuk
kompleks pada membran sel limfosit, menyebabkan sel-sel ambil pewarna. Seorang pasien
ginjal dengan PRA> 85% dianggap sangat peka.

2. Molecular genetic techniques [Molecular HLA Typing]

Prosedur berbasis DNA telah meningkatkan akurasi dari HLA typing dan mengarah
pada identifikasi alel yang tidak terdeteksi secara serologis dan dari banyak subtipe
spesifisitas serologis. metode Berbasis DNA untuk typing untuk alel HLA berfokus pada
analisis variasi nukleotida terjadi pada kedua ekson 2 dan 3 gen kelas I dan ekson-2 gen kelas
II. Amplifikasi ekson 2 (Kira-kira 270 bp) HLA kelas II cukup untuk mencapai tingkat
resolusi tertinggi. Untuk mengetik HLA kelas I, baik exon 2 dan 3 dan intron intervening
(fragmen lebih dari 900 bp) diperkuat oleh sepasang primer.berikut perbandingan metode
typing DNA

Metode Ringkasan Kelebihan Kelemahan

Serology Pengujian serologis
mengekspresikan ntigen HIA
pada permukaan limfosit
dengan menggunakan antibodi
monoklonal
PCR-RFLP DNA teramplifikasi PCR
dicerna dengan enzim restriksi
untuk menghasilkan
pola pembatasan spesifik dan
alel diidentifikasi berdasarkan
pola yang ada
PCR-SSO Labeled sequence specific
probes digabungkan menjadi
DNA teramplifikasi PCR dan
kemudian terdeteksi
PCR—SSP DNA yang diamplifikasi PCR
menggunakan Sequence
specific primer (SSP). Primer
dirancang dengan kekhususan-
Tergantung nukleotida di
ujung 3 '
PCR-SBT DNA diamplifikasi oleh PCR
menggunakan primer khusus
Lebih cepat dan lebih murah
daripada metode molekuler
Membedakan polimorfisme
yang terkait dengan haplotipe
DR3, DR5 dan DR6.
Spesifisitas lebih tinggi
daripada metode serologis
Teknik yang paling spesifik.
Typing resolusi tinggi dalam
10 jam. Mudah menangani
beberapa sampel dalam sekali
proses. Tidak memerlukan
kontrol di setiap langkah
Lebih cepat dari PCR - RFLP
dan PCR - SSO. Seakurat
PCR - SSO. Lebih murah dar
Metode i yang lain
Lebih dapat diandalkan dan
spesifik daripada metode lain.
Tidak memberikan Informasi
langsung tentang variasi
urutan dalam alel. Tidak
mampu mendeteksi beberapa
perbedaan dalam molekul
DR
Kurang akurasi dalam allele
typing yang tepat, terutama
haplotype DR4.
Prosedur panjang dan
penanganan sampel yang luas
Urutan alel harus diketahui.
Temperatur hibridisasi sangat
penting, dapat menyebabkan
hibridisasi negatif palsu.
Kurang akurasi dalam
mengetik allele secara tepat
Typing jelas dari delapan alel
DB1806 yang telah diamati
Alat yang dibutuhkan mahal
 untuk situs yang diinginkan. Alel baru dapat dideteksi
PCR dengan mudah
produk dimurnikan dan
kemudian diurutkan

a. PCR Based Methods / Three Categories

 Sequence Specific Priming (SSP)
Dalam tes ini, primer oligonukleotida yang digunakan untuk memulai PCR
memiliki urutan gratis untuk diketahui urutan yang merupakan karakteristik HLA
tertentu. Primer, yang khusus untuk HLA-DR15, misalnya, tidak akan bisa
mempengaruhi PCR untuk HLA-DR17. Typing dapat diselesaikan dengan
menggunakan satu set PCR yang berbeda, masing-masing dengan primer spesifik
untuk antigen HLA yang berbeda. SSP metode rapid typing yang menggunakan
set pasangan primer untuk memperkuat wilayah spesifik genom DNA.
 Sequence Specific Oligonucleotide (SSO) Typing
Dengan metode ini, DNA untuk keseluruhan lokasi (mis. Lokasi gen DR HLA)
amplifikasi pada PCR. DNA yang diamplifikasi kemudian uji dengan
menambahkan oligonukleotida berlabel (mis. Radioaktif).Probe, yang saling
melengkapi untuk DNA urutan, karakteristik untuk antigen HLA tertentu. Probe
ini kemudian akan "menggolongkan" untuk keberadaan sekuens DNA spesifik
gen HLA. Metode ini melibatkan amplifikasi selektif target diikuti oleh
hibridisasi ke panel probe oligonukleotida. Spesifisitas Lokus HLA dicapai
dengan memilih primer PCR spesifik untuk urutan di wilayah conserf ekson
kedua.
 Sequence Based HLA Typing (SBT)
Urutan dasar berbasis HLA melibatkan penentuan urutan nukleotida dari segmen
yang diamplifikasi gen HLA. SBT memberikan keunggulan lebih dari prosedur
lain karena relatif cepat 24-48 jam, resolusi tingkat tinggi. Produk yang
mengandung polimorfisme internal yang dapat diidentifikasi dengan teknik kedua
misal: Urutan PCR spesifik penyelidikan oligonukleotida (SSOP), PCR-RFLP,
diikuti oleh urutan.

b. Gene chip or DNA microarray

Informasi jumlah dan urutan target dapat ditentukan oleh intensitas sinyal hibridisasi.
Chip gen atau DNA Teknologi microarray pertama kali dikembangkan oleh
 Affymetrix USA. Ini didasarkan pada prinsip hibridisasi titik balik. Ribuan probe
oligonukleotida mewakili berbeda gen terlihat di permukaan padat oleh robot. Probe
ini akan berikatan dengan isotop radioaktif atau pewarna fluoresen berlabel DNA atau
cDNA urutan pelengkap. Setelah autoradiografi atau deteksi fluoresensi, sinyal
diproses dan dianalisis dengan perangkat lunak komputer. Yang konsisten tingkat hasil
genotip dari microarray dan PCR-SSO adalah 99,9%.

3. Cross matching
Cross Matching dilakukan agar meminimalisir hyper acute rejection (HAR) yaitu
hasil dari antibodi yang terbentuk terhadap donor; disebut sebagai antibodi spesifik donor
(DSA). Ada beberapa metode diantaranya:
 Cell-based
 Solid phase immunoassays (SPI):
1) ELISA
2) Bead based :
a. Flow cytometry
b. Luminex
Berikut perbandingan Sensitivitas dari beberapametode identifikasi DSA:

a. Cell based Complement dependent cytotoxicity (CDC)

Crosscatching CDC dipelopori oleh Terasaki dan kolega di tahun 1960-an. Metode ini
menggunakan limfosit hidup untuk mendeteksi limfosit spesifik antibodi dengan
aktivasi sistem komplemen dan pembunuhan limfosit. Ini memiliki kelemahan:
dibatasi oleh panel sel yang digunakan; Tergantung pada kualitas limfosit dan
komplemen kelinci; mendeteksi antigen non-HLA dan hanya mendeteksi melengkapi
fixing antibodi . CDC crossmatch melibatkan penempatan serum penerima
 (berpotensi mengandung antibodi anti-HLA khusus donor) ke limfosit donor
(mengandung HLA antigen). Reaksi sitotoksik (dianggap ‘positif’) menunjukkan
adanya DSA yang terbentuk sebelumnya. CDC mengidentifikasi HLA spesifik donor
yang signifikan secara klinis tanggapan yang dimediasi antibodi untuk penerima yang
diberikan. Limfosit dari donor diisolasi dan dipisahkan menjadi sel T dan B penerima
dicampur dengan limfosit dalam multiwell plate. Komplemen kemudian ditambahkan
(biasanya berasal dari serum kelinci). Jika khusus donor antibodi hadir dan mengikat
sel donor, yaitu kaskade komplemen akan diaktifkan melalui jalur klasik
menghasilkan lisis pada limfosit. Pembacaan tes adalah persentase sel mati relatif
terhadap sel hidup dan ditentukan dengan mikroskop.

b. Solid phase assays

Molekul HLA yang dimurnikan diimobilisasi ke dalam permukaan padat. Metode ini
memiliki sensitivitas yang lebih tinggi daripada CDC tes. Memiliki Keuntungan
seperti Peningkatan sensitivitas dan kekhususan; hasil cepat, otomatisasi, dan waktu
perputaran yang cepat; Reaksi dinilai pada a skala kontinu.memiliki Keterbatasan
seperti Antigen variabilitas; jumlah; kondisi; Gangguan oleh faktor eksternal; IVIg;
Thymoglobulin; Gangguan oleh faktor intrinsik (autoantibodi, imun kompleks, dan
tingkat IgM yang tinggi); Relevansi tingkat antibodi yang rendah.

C. Kesimpulan
Human Leukocyte Antigen (HLA) adalah alloantigen yang membentuk kompleks
histokompatibilitas utama pada manusia. (HLA) bertanggung jawab atas penolakan
transplantasi, juga memainkan peran utama dalam patogenesis, pengembangan kanker dan
beberapa penyakit menular. Tes human leucocyte antigen (HLA) berguna dalam kedokteran
forensik, pengujian paternitas dan imunogenetik. Artikel ini menjelaskan kemajuan terkini
dalam identifikasi HLA dan teknik tisuue typing. Dari banyak metode yang dibahas
disimpulkan bahwa metode biologi molekuler adalah yang terbaik meskipun ada beberapa
keterbatasan.
 Referensi

1. Terasaki PI, McClelland JD. Microdroplet assay of human serum

cytotoxins.. Nature 1964; 204: 998-1000.
2. Patel R, Terasaki PI. Significance of the positive crossmatch test in
kidney transplantation. New England Journal of Medicine
1969;280(14):735-739.
3. Cecka JM. Calculated PRA (CPRA): the new measure of sensitization
for transplant candidates. American journal of transplantation 2010;
10(1): 26-29.
4. Bidwell J. DNA-RFLP analysis and genotyping of HLA-DR and DQ
antigens. Immunology today 1988; 9(1): 18-23.
5. Morimoto T, Terasaki M, Higashiyama H, Tanaka K, Uemoto S, Tanaka
A, Shimahara Y, Mori K, Kim HJ, Kamiyama Y, Yamaoka Y. Clinical
application of arterialization of portal vein in living related donor
partial liver transplantation. Transplant international 1992; 5(3):151-
154.
6. Terasaki PI. Humoral theory of transplantation. American journal of
transplantation: oficial journal of the American Society of
Transplantation and the American Society of 8.Transplant Surgeons
2003; 3(6): 665-673.
7. Stegall MD, Gloor J, Winters JL, Moore SB, Degoey S. A Comparison
of Plasmapheresis Versus High Dose IVIG Desensitization in Renal
Allograft Recipients with High Levels of Donor Specific Alloantibody.
American journal of transplantation 2006;6(2):346-351.
8. Mahoney RJ, S Taranto, E Edwards. B-Cell crossmatching and kidney
allograft outcome in 9031 United States transplant
recipients.Human immunology 2002; 63(4): 324-335.
9. Le Bas-Bernardet S, Hourmant M, Valentin N, Paitier C, Giral-Classe
M, Curry S, Follea G, Soulillou JP, Bignon JD. Identification of the
antibodies involved in B-cell crossmatch positivity in renal
transplantation. Transplantation 2003;75(4):477-482.
10. Pollinger HS, Stegall MD, Gloor JM, Moore SB, Degoey SR,
Ploeger NA, Park WD Kidney transplantation in patients with
antibodies against donor HLA class II. American journal of
transplantation 2007;7(4):857-863.
11. Eng HS, Bennett G, Tsiopelas E, Lake M, Humphreys I, Chang
SH, Coates PT, Russ GR. Anti HLA Donor Specific AntibodiesDetected
in Positive B Cell Crossmatches by Luminex® Predict Late Graft
Loss. AmericanJournal of Transplantation 2008;8(11):2335-2342.
12. Limaye S, O’Kelly P, Harmon G, O’Neill D,Dorman AM, Walshe
J, Donohoe J, Little D, Conlon PJ, Keogan MT. Improved graftsurvival
in highly sensitized patients undergoing renal transplantation after
the introduction of a clinically validated flow cytometry rossmatch.
Transplantation 2009;87(7):1052-1056.
13. Bryan CF, Baier KA, Nelson PW, Luger AM, Martinez J, Pierce
GE, Ross G, Shield III CF, Warady BA, Aeder MI, Helling TS. Longterm
 graft survival is improved in cadaveric renal retransplantation by
flow cytometric crossmatching1. Transplantation 1998;66 (12):
1827-32.
14. Christiaans MH, Overhof R, ten Haaft A, Nieman F, van Hoof
JP, van den Berg- Loonen EM. No advantage of flow cytometry
crossmatch over complement-dependent cytotoxicity in
immunologically welldocumented renal allograft recipients.
Transplantation 1996; 62(9): 341-7.
15. Ilham MA, Winkler S, Coates E, Rizzello A, Rees TJ, Asderakis A.
Clinical significance of a positive flow crossmatch on the outcomes
of cadaveric renal transplants. In transplantation proceedings 2008;
31 (40): 1839-1843.
.