Modul Kromatografi

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam
teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak
yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam yang juga bisa berupa cairan
ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,
mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom
yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk
melukiskan daerah-daerah yang berwarna bergerak kebawah kolom. Pada waktu
yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk
memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai
penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.
Perkembangan tentang kromatografi digunakan suatu teknik dalam bentuk

kromatografi padatan cair (LSC). Akhir tahun 1930 an sampai tahun 1940 an,
kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) pada tahun
1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun
1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941, tidak
hanya mengubah kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin
dan James mempublikasikan kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun
1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair
Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High
Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) berhasil dikembangkan. Saat ini
dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat, KCKT mencapai suatu
keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
Kromatografi berkembang menjadi teknik pemisahan untuk zat kimiawi dengan sifat
yang sangat mirip, dan dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif dan penetapan
ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

kuantitatif untuk zat-zat yang sudah dipisahkan. Keuntungan-keuntungan dari
Kromatografi diantaranya :
1. Kromatografi merupakan metoda pemisahan yang cepat, mudah dan

menggunakan peralatan yang murah serta sederhana, kecuali unt uk
kromatografi gas, hingga campuran yang kompleks dapat dipisahkan
dengan mudah.
2. Kromatografi hanya membutuhkan campuran cuplikan . yang sangat

sedikit sekali, bahkan tidak menggunakan jumlah yang besar,
disamping itu kromatografi pekerjaannya dapat diulang.
B. Tujuan :
Adanya modul ini diharapkan peserta diklat dapat melakukan analisis kromatografi
C. Ruang Lingkup
Modul melakukan analisis kromatografi meliputi : menjelaskan dasar-dasar analisis
kromatografi, menyiapkan sampel dan standar, melaksanakan pemisahan
kromatografi, melaksanakan pengukuran analisis, melaksanakan perhitungan hasil
analisis.

BAB II
RANCANG BANGUN PEMBELAJARAN MATA DIKLAT/GBPP/SILABUS
Nama Diklat : Pengingkatan Kompetensi Guru Bidang Produktif

Kimia Analis
Mata Diklat : Melakukan Analisis Kromatografi
Jenjang Diklat : Tingkat Menengah
Kode Kompetensi : TR.TK.KA.052.M.1
Alokasi Waktu : 14 X 45 Menit
Tujuan : Peserta diklat diharapkan mampu melakukan analisis
kromatografi
Deskripsi Materi : Melakukan analisis kromatografi meliputi materi :
menjelaskan dasar-dasar analisis kromatografi,
menyiapkan sampel dan standar, melaksanakan
pemisahan kromatografi, melaksanakan pengukuran
analisis, melaksanakan perhitungan hasil analisis.
KOMPETENSI MATERI KEGIATAN

INDIKATOR PENILAIAN WAKTU SUMBER
DASAR PEMBELAJARAN PEMBELAJARAN
JAM BELAJAR
1. Menjelaskan  Prinsip dasar  Menjelaskan  Jenis-jenis  Tes tulis 2  Job Sheet

dasar-dasar kromatografi prinsip dasar kromatografi  Observasi  Modul
analisis  Kasifikasi kromatografi dikenali  Laporan  Peralatan
 Tahap- praktek
kromatografi jenis  Mengklasifikasi
tahap  SOP di Lab
kromatografi kan jenis analisis Kimia.
 Sifat kromatografi kromatografi
Kromatografi diketahui.
 Mengenal alat
analisis
kromatografi
2. Menyiapkan  Identifikasi  Mengidentifikasi  Alat dan  Tes tulis 2  Job Sheet
sampel dan alat dan alat dan bahan bahan  Observasi  Modul
standar bahan analisis analisis disiapkan  Laporan  Peralatan
sesuai praktek
kromatografi kromatografi
kebutuhan  SOP di Lab
 Prefarasi  Melakukan Kimia
sampel prefarasi
analisis bahan/sampel
kromatografi 
 Standarisasi
bahan kimia
(larutan)

KOMPETENSI MATERI KEGIATAN
INDIKATOR PENILAIAN WAKTU SUMBER
DASAR PEMBELAJARAN PEMBELAJARAN
JAM BELAJAR
3.     
Melaksanakan
pemisahan
kromatografi

BAB II
KEGIATAN PEMBELAJARAN
A. KEGIATAN PEMBELAJARAN 1. MENJELASKAN DASAR-DASAR ANALISIS

KROMATOGRAFI.
1. LEMBAR INFORMASI
1.1. DASAR-DASAR KROMATOGRAFI
a. Prinsip Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Istilah
kromatografi berasal dari kata “chroma” (warna) dan “graphein”
(menuliskan). Teknik pemisahan analitik yang paling banyak digunakan
ditemukan pada tahun 1903 oleh TSWETT, ia telah menggunakan
kromatografi untuk pemisahan s e n ya wa - s e n ya wa ya n g berwarna dan
nama kromatografi diambil dari senyawa yang berwarna.
b. Klasifikasi Kromatografi
Kromatografi
B. Kromatografi Gas A. Kromatografi Cair
Planar Kolom
Kertas Lapis Tipis Terbuka Tertutup

(Twsett) (KCKT)
Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen

dalam fasa diam dan fasa gerak berdasarkan perbedaan sifat fisik komponen
yang akan dipisahkan.

Kromatografi dapat digunakan untuk preparatif atau analisa kualitatif dan
kuantitatif. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa
yaitu fasa tetap (stationary) dan fasa bergerak (mobile), pemisahan-
pemisahannya tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut.
Persyaratan utama kromatografi adalah :
1). Ada fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam tidak boleh bereaksi
dengan fasa gerak.
2). Komponen sampel (contoh) harus larut dalam fasa gerak dan
berinteraksi dengan fasa tetap (diam).
3). Fasa gerak harus bisa mengalir melewati fasa diam, sedangkan
fasa diam harus terikat kuat di posisinya.
Berdasarkan cara kontak antara fasa diam dan fasa gerak, dikenal kelompok
kromatografi kolom dan kromatografi planar,sebagai berikut :
1. Kromatografi kolom : fasa diam ditahan dalam sebuah kolom

sempit (terbuka di kedua ujungnya). Fasa ger ak mengalir karena
efek gravitasi atau tekanan. Fasa diam umumnya berupa
padatan atau cairan. Fasa gerak umumnya berupa cairan atau gas
dan dialirkan terus menerus. Hasil pemisahan adalah spesi yang
keluar dari kolom.
2. Kromatografi planar : fasa diam didukung oleh (dilapiskan pada)
plat datar atau lembaran. Fasa gerak bergerak berdasarkan aksi
kapiler atau gaya gravitasi. Fasa diam umumnya adalah padatan,
sedangkan fasa gerak umumnya adalah cairan. Fasa gerak
dialirkan hanya sampai mendekati akhir bidang fasa diam. Hasil
pemisahan berua spot-spot pada lintasan (tract) yang dijalani oleh
sampel.
Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap,
yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat
maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption
chromatography), dan jika zaf cair dikenal sebagai kromatografi partisi

(partition chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas
maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat rnacam sistem
kromatografi tersebut adalah :
1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.
2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat
3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai
kromatografi partisi dan kromatografi kertas.
4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas -air dan
Kromatografi kolom kapiler.
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa -

senyawa yang dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa
gerak dan fasa tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda -beda
dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain.
c. Kromatografi Partisi
Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana
dalam kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti
kieselguhr, yang dilapisi dengan lapisan dari zat cair sering
menggunakan air. Fasa tetap adalah lapisan zat cair dan zat padat yang
berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika fasa -fasa bergerak dan
tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh kromatografi zat cair-
cair.
Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak

tergantung pada kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair
sehingga senyawa-senyawa yang lebih larut akan bergerak lebih lambat
turunnya dalam kolom daripada yang kurang kelarutannya. Selama
bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di antara dua fasa, dan
pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.
Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, d imana lembaran kertas

adalah sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi

campuran dari senyawa yang dipisahkan membentuk suatu jalur dalam kolom.
1.2. Kromatografi Serapan/Kolom
a. Kolom Serapan
Untuk memisahkan suatu campuran, kolom seperti gambar l.a dapat
digunakan dan diisi dengan penyerap zat padat seperti alumina sebagai fasa
tetap dan dialiri dengan pelarut seperti benzena sebagai fasa gerak
b a
gambar I
1a. Pemisahan suatu campuran dengan kolom kromatografi. 1b.
Jalur-jalur serapan
Sejumlah kecil cuplikan dari campuran dimasukkan melalui sebelah atas dari
kolom yang kemudian membentuk jalur-jalur serapan dari senyawa, seperti
gambar Ib. Bila pelarut dibiarkan mengalir melalui kolom ia akan
mengangkut senyawa-senyawa yang merupakan komponen-komponen
dari campuran.
Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada berapa

besarnya zat terhambat/tertahan oleh penyerap di dalam kolom. Jadi
suatu senyawa yang diserap lemah akan bergerak lebih cepat daripada
yang diserap kuat. Akan terlihat bahwa jika perbedaan -perbedaan dalam
serapan cukup besar maka akan terjadi pemisahan yang sempurna,
seperti terlihat pada gambar 1b.
Bentuk kolom serapan yang sederhana telah ditunjukkan seperti dalam garnbar
1a. Bentuk ini merupakan jenis yang pertama-tama digunakan untuk pemisahan-
pernisahan kromatografi hingga sampai sekarang.

Kolom krornatografi dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan
gelas penyaring di dalamnya. Meskipun kolom-kolom dapat dibuat secara
sederhana dari tabung gelas, kadang-kadang buret pun dapat digunakan.
Ukuran kolom tergantung pada banyaknya zat yang akan dipisahkan. Untuk
menahan penyerap yang diletakkan di dalam kolom dapat digunakan gelas wool
atau kapas, lihat gambar 2 a dan b.
b.
Gambar 2
Kolom untuk kromatografi
a. Pengisian Kolom
Pengisian kolom adalah tidak mudah untuk mernperoleh pengisian kolom yang
homogen, tetapi perlu dicoba hingga mendapatkan hasil yang maksimurn.
Pengisian yang tidak teratur dari penyerap akan mengakibatkan merusak batas-
batas pita krommatografi. Putusnya penyerap dalam kolom biasanya
disebabkan oleh gelembung-gelembung udara selama pengisian. Untuk

rnencegah hal-hal tersebut sedapat mungkin zat pengisi/penyerap dibuat
menjadi "bubur" dengan pelarut kemudian dituangkan perlahan-lahan dalam
tabung. Jika penyerap dibiarkan turun perlahan-lahan dapat ditolong dengan
mengguncang perlahan-lahan maka akan diperoleh pengisian yang homogen.
Jika besarnya partikel-partikel penyerap sama, akan lebih mudah untuk
mendapatkan pengisian yang homogen. Tetapi hal ini sangat jarang. Harus
diperhatikan penyerap yang telah dimasukkan jangan sampai ada bagian yang
kering baik selama pengisian atau selama pemisahan.
1.3. Kromatografi Kertas

Kromatografi kertas termasuk dalam kelompok kromatografi planar,
dimana pemisahannya menggunakan medium pemisah dalam bentuk
bidang datar yaitu benuk kertas. Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase
diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase
gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa
komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen
yang berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula.
Kromatografi kertas, fase diam adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase
gerak adalah pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan Kromatografi kertas

telah dilakukan dimana proses dikenal sebagai "analisa Kapiler". Metoda-
metoda ini sangat sesuai dengan kromatografi serapan, dan sekarang
kromatografi kertas dipandang sebagai perkembangan dari sistem partisi.
Salah satu zat padat dapat digunakan untuk menyokong fasa tetap yaitu
bubuk selulosa.
Mula-mula telah dilakukan pemisahan asam -asam amino dan peptida-

peptida yang merupakan hasil hidrolisa protein wool dengan suatu cara
di mana kolom yang berisi bubuk diganti dengan lem baran kertas dan
kemudian diletakkan dalam bejana tertutup yang berisi uap jenuh
larutan. Ini adalah merupakan jenis dari sistem partisi dimana fasa tetap
adalah air, disokong oleh molekul-molekul selulose dari kertas, dan fasa

bergerak biasanya merupakan campuran dari satu atau lebih pelarut - pelarut
organik dan air.
Suatu hal yang perlu diperhatikan disini adalah tentang peralatan. Pada
kromatografi Kertas peralatan yang dipakai tidak perlu alat-alat yang teliti
atau mahal. Hasil-hasil yang baik dapat diperoleh dengan peralatan dan
materi-materi yang sangat sederhana. Senyawa-senyawa yang
terpisahkan dapat dideteksi pada kertas da n dapat segera diidentifikasi.
Bahkan komponen-komponen yang terpisahkan dapat diambil dari
kertas dengan jalan memotong-motongnya yang kemudian dilarutkan
secara terpisah.
Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi sangat sulit

dijelaskan apabila membadingkannya dengan kromatografi lapis tipis.
Penjelasannya tergantung tingkatan pemilihan pelarut yang anda gunakan, dan
beberapa sumber untuk mengatasi masalah secara tuntas. Jika anda telah
pernah melakukannya, ini sangat membantu jika anda dapat membaca
penjelasan bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja.
 Struktur dasar kertas
Kertas dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari gula
sederhana, yaitu glukosa.
Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam

kerangka bahwa senyawa-senyawa berbeda diserap pada tingkatan yang
berbeda pada permukaan kertas. Dengan kata lain, akan baik menggunakan
beberapa penjelasan untuk kromatografi lapis tipis dan kertas. Sayangnya, hal
ini lebih kompleks daripada itu! Kompleksitas timbul karena serat-serat selulosa
beratraksi dengan uap air dari atmosfer sebagaimana halnya air yang timbul

pada saat pembuatan kertas. Oleh karenanya, anda dapat berpikir yakni kertas
sebagai serat-serat selulosa dengan lapisan yang sangat tipis dari molekul-
molekul air yang berikatan pada permukaan. Interaksi ini dengan air merupakan
efek yang sangat penting selama pengerjaan kromatografi kertas.
1.3. Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC )
Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan selulosa)

dilapiskan di permukaan sebuah plat pendukung (umumnya dibuat dari
bahan kaca atau lembaran logam Al). Bila noda telah kering plat
diletakkan secara vertikal dalam bejana yang sesuai dengan tepi yang di
bawah dicelupkan ke dalam fasa gerak, maka pemisahan kromatografi
penaikan akan diperoleh. Pada akhir perkembangan, pelarut dibiarkan
menguap dari plat dan noda-noda yang terpisah dilokalisir dan
diidentifikasi dengan cara fisika dan kimia seperti yang digunakan dalam
kromatografi kertas.
1) Metoda Kromatografi Lapisan Tipis

Kromatografi serapan dalam bentuk lapisan tipis yang dilekatkan pada
suatu penyokong telah diketengahkan dalam tahun 1938. Pertamakali
dicoba untuk memisahkan terpen-terpen. Pada "Cromatostrip" yang
dibuat melapisi ` potongan gelas kecil dengan penyerap yang dicampur
dengan pati atau perekat sebagai pengikat.
Perkembangan lebih lanjut STHAL telah mernbuat cara-cara pembuatan

potongan gelas dan cara melapiskannya serta menunjukkan bahwa kromatografi
lapisan tipis dapat digunakan untuk keperluan yang luas dalam pernisahan-
pemisahan. Metoda kromatografi kertas memberikan hasil pemisahan dengan
waktu yang lebih cepat dan lebih baik.
2) Jenis Penyerap
Sifat-sifat umum dari penyerap untuk kromatografi lapisan tipis adalah
mirip dengan sifat-sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat yang
penting dari penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena
adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada jenis penyerap. Besar

partikel yang biasa digunakan adalah 1 - 25 mikron. Partikel yang
butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan
dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah
menggunakan penyerap yang butirannya halus. Sedangkan dalam kolom
partikel yang sangat halus akan mengakibatkan aliran pelarut men jadi
lambat, pada lapisan tipis butiran yang halus memberikan aliran pelarut
yang lebih cepat.
Beberapa contoh penyerap yang digu nakan untuk pemisahan dalam kromatografi
lapisan tipis adalah sebagai berikut dalam tabel 1.
Tabel 1. Jenis Penyerap untuk Kromatografi Lapisan Tipis
zat padat Digunakan untuk memisahkan
- Silika  Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam

lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation
organik, sterol, terpenoid
- Alumina  Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-
vitamin, karoten, asam-asam amino
 Gula, oligosakarida, asam-asam dibasa, asam-
- Kieselguhr
asam lemak, Irigliscrida, asam-asam amino,
steroid alkaloid, nukleotida
 asam-asam amino
-Bubuk selulosa
 asam-asam amino,protein
- Pati
e. Kromatografi Gas
Kromatografi gas merupakan sekelompok teknik pemisahan kromatografi
yang menggunakan gas sebagai fasa gerak. Karena gas bersifat menyebar ke
ruang disekelilingnya. maka tidak ada kromatografi gas dalam bentuk planar,
semua kromatografi gas berbentuk kolom. Kolom untuk kromatografi gas
biasanya dibuat dari bahan logam nir-karat atau dari bahan gelas. Di dalam
alur pemisahan, fasa sampel juga berupa gas. Karena umumnya sampel

untuk kromatografi gas berfasa cair, maka sistem pemisahan kromatografi
gas memerlukan pemanasan. Disisi lain, stabilitas gas sangat dipengaruhi
temperatur, sehingga walaupun sampel sudah berfasa gas, sistem
pemanasan untuk memungkinkan pengendalian temperatur tetap diperlukan.
Kromatografi gas (Gas chromatography, disingkat GC) termasuk alat-alat

analisa. Analisa dapat dibagi menjadi :
1. Analisa Kualitatif, yaitu penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau

campuran dari komponen.
2. Analisa Kuantitati, yaitu penentuan jumlah dari suatu komponen atau

komponen-komponen dalam suatu campuran.
Kromatograf i ga s dija jarkan seba gai cara analisa yang dapat

diguna kan untuk menganalisa sen ya wa -sen ya wa organ ik.
Berdasarkan f asa diam, dikena l ada dua tipe kromatograf i gas
ya itu :
1. Kromatograf i padat - gas (Gas So lid Cromatograph y, GSC).

2. Kromatograf i caira n - gas (Gas L iquid Cromato graph y, GL C).
Dalam kedua hal ini seba gai f asa gera k adalah ga s (hin gga
keduanya disebut kromatograf i gas) tetapi f asa diamnya berbeda .
Meskipun demikia n kedua cara tersebut mempunya i banyak
persa maan cara kerja . Pada GS C kita mempun yai absorbsi
(absorp si) dan d alam GLC kita mempunyai pa rtisi (la rutan).
Pengoperasian GSC memerlukan tingkat keahlian yang lebih tinggi dari
GLC, shingga relatif jarang digunakan. penyebabnya adalah GSC
berdasarkan fasa diam padat, sehingga gaya tambat analit berdasarkan
adsorpsi fisik. Gaya tambat ini bersifat semi permanen terhadap molekul
polar atau molekul aktif sehingga proses adsorpsi bersifat tidak linier,
akibatnya pik hasil elusi menjadi sangat berekor (tailing). GLC relatif lebih
mudah dioperasikan sehingga digunakan secara luas disegala bidang sains,
dan nama GLC sering disingkat menjadi Kromatografi Gas (GC).
a). Kromatografi padat -gas (Gas Sol i d Cr oma tography, GSC).

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat
yang mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa
diam (stationary phase). Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan).
Dengan alasan ini maka GSC sangat sukar untuk digunakan secara
berulang dengan hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh kenyataan-
kenyataan bahwa :
1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara

pembuatannya.
2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah
pembuatannya.
Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang
menyebabkan "Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai
adalah :
a. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak

homogen dari penyerap.
b. Waktu retensi relatif panjang.
c. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.
d. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.
Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk

senyawa yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun
demikian ada keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa
diam tidak dapat diuapkan, karena tekanan uap dari padatan sangat rendah.
Hingga dapat menggunakan detektor-detektor yang sensitif, karena di sini
tidak terjadi "column bleeding".
Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah
diketemukannya penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh
penyerap adalah :
1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa
polar yang titik didihnya tinggi.

2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-
silikat), dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari
diameter pori dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai
ukuran dari 3A° hingga 13A°. Zeolit sangat stabil, pada suhu hingga 600°C.
Molecular sieves hanya menyerap molekul-molekul yang lebih kecil dari pori-
porinya. Air sangat cepat diserap hingga merupakan pengering yang
sangat efisien. Molecular sieves mempunyai sifat katalisator yaitu dapat
merupakan zat dehidrator (dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat
mengubah alkohol menjadi hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum
digunakan biasanya molecular sieves diaktifkan dengan memanaskannya
selama 12 jam pada suhu 150°C sambil dialiri gas H2 yang kering.
Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon

menyerap sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit
tidak digunakan bila CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.
Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer-

polimer yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama
perdagangannya) juga CHROMOSORB.
Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :
1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH

dan glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.
2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.
Kromatografi gas yang paling tua digunakan adalah GSC. Dalam
tahun 1800 gas-gas telah dimurnikan dengan menyerapkan pada fasa
diam yang berupa : alumina (AI 2 0 3 ), atau pada silica gel (Si O, pasir
yang dimurnikan). Kadang-kadang penyerap ini menjadi tidak aktif bila
terkena oleh air.
b) Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)
Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :
1. Kecepatan :

a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengada -
kan kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam.
b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingga

waktu pemisahan sangat cepat (diukur dalam menit).
2. Sederhana :
Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi langsung dari

data yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat GLC relatif
murah.
3. Sensitif :
GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat

mendeteksi konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 10 0 ppm). Alat-
alat GLC yang lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang
Konsentrasirrya hanya beberapa
Alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan kemampuan

mendeteksi "parts per billion", hingga dalam jangkauan
pikogram = 10 g.
Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka hanya

memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam
ukuran mikroliter.
4. Pemisahan : (resolution = performance).
Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku -molekul dari

suatu campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-
cara yang lain.
Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :
1) Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg

CH3(CH,)t6 COOH.
2) Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg
CH3(CH,)7CH = CH(CHZ)7COOH:

3) Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg
CHj(CHZ)4 CH = CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.
Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara
distilasi atau dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan
dengan GLC, yang hanya membutuhkan waktu sekitar 23 menit.
5. Analisa dapat digunakan sebagai :
1) Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.

2) Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.
3) Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-
ulang.
c) Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan
ke dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa
gerak). Pada kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul-
molekul analit. Fungsi fasa gerak, hanya berfungsi sebagai transpor analit
atau cuplikan untuk bergerak di sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi
karena perbedaan interaksi analit dengan fasa diam.
Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah
teruapkan masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-
komponen dari cuplikan. Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh
detektor, dan sinyal dalam bentuk puncak akan dihasilkan oleh pencatat.
f. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode

kromatografi yang mampu memisahkan campuran makromolekul, senyawa
ionik, produk alam yang labil, senyawa polimerik dan kelompok polifungsional
yang memiliki berat molekul tinggi dengan cara penyarian berfraksi,
penyerapan atau penukaran ion.

Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena
fasa diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari
proses pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau
kromatografi partisi. KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam
analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan
serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan
kromatografi kolom.
Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik

anatara molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.
KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan,

dengan keunggulan-keunggulan:
1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,

2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang
mudah rusak oleh panas,
3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik
seperti untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat,
hidrokarbon, karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik,
steroid, spesi metal organik, dan berbagai senyawaan norganik.
KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau
padatan, dan bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam
bisa berupa cairan atau padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe
utama yaitu:
1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik

berukuran kecil)
2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan
spesi non-polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti
pemisahan hidrokarbon alifatik dari alkohol alifatik)
3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)
4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr
> 1000) yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.

2. EVALUASI
1. Definisi kromatografi adalah :...
a. pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan
komponen dalam medium tertentu
b. Teknik pemisahan dengan menggunakan suatu pelarut
anorganik
c. Pemisahan antara satu komponen yang komplek
d. Pemisahan suatu zat dari senyawa yang tak dapat dipisahka n
e. Teknik Teknik pemisahan dari suatu sampel yang sangat
banyak jumlahnya
2. Persyaratan utama yang harus diperhatikan dalam kromatografi

adalah :...
a. Fasa diam harus bereaksi dengan fasa gerak.
b. Adanya fasa diam dan fasa gerak
c. Fasa gerak tidak perlu mengalir melewati fasa diam
d. Komponen sampel tidak larut dalam fasa gerak
e. Fasa gerak tidak berinteraksi dengan fasa diam.
3. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fasa yaitu :

...
a. Fasa tetap dan fasa bergerak
b. Fasa tetap dan fasa diam
c. Fasa tetap dan stationary
d. Fasa mobile dan fasa cair
e. Fasa gas dan fasa cair
4. Fase diam dalam kromatografi kertas adalah :...

a. Kertas serap
b. Pelarut atau campuran pelarut yang sesuai
c. Medium plat

d. Lapisan tipis dalam kaca/plat
e. Membran

B. KEGIATAN PEMBELAJARAN 2. MENYIAPKAN SAMPEL DAN STANDAR
3. LEMBAR INFORMASI
1.1. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Kertas

a. Sampel dalam bentuk cair biasanya langsung di totolkan diatas kertas,
seanndainya sampel tersebut terlalu encer dilakukan penguapan
sampai agak kental.
b. Sampel dalam bentuk padat sebelum dilakukan pemisahan dengan

kromatografi kertas harus dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan cara
dihaluskan dan dilarutkan dengan pelarut organik misal
khloroform/heksan/dietil eter/alkohol dan lain-lain sampai diperoleh sampel
yang siap untuk ditotolkan diatas kertas.
c. Langkah Kerja Kromatografi Kertas

Setetes dari larutan cuplikan yang mengandung campuran yang akan
dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tan da di
atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda
yang bulat. Bila noda telah kering, kertas dimasukkan dalam bejana
tertutup yang sesuai dengan satu ujung dimana tetesan cuplikan
ditempatkan dan tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa
bergerak (jangan sampai noda tercelup karena senyawa yang akan
dipisahkan akan terlarut dari kertas), lihat gambar 4a.
Pelarut bergerak melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler dan
menggerakkan komponen-komponen dari campuran cuplikan pada
perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Perlu diperhatikan bahwa per-
mukaan dari kertas jangan sampai terlalu basah dengan pelarut karena
hal ini tak akan memisahkan sama sekali atau daerah-daerah noda akan
menjadi kabur. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang
cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, maka kertas
diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda
dan lembaran kertas dibiarkan kering.

Gambar 4. Kromatografi pita/noda.
Jika senyawa-senyawa tak berwarna maka mereka dideteksi dengan cara

fisika dan kimia. Cara yang biasa adalah menggunakan suatu pereaksi
atau pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap
beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Sering juga menggunakan
cara deteksi dengan sinar ultra ungu atau teknik radio kimia. Bila daerah-
daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, adalah perlu untuk
mengidentifikasi tiap-tiap individu dari senyawa.
Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada

kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan
harga Rf. Terutama pada gugus-gugus yang besar dari senyawa-senyawa
yang susunan kimianya mirip, seperti asam-asam amino, harga Rf sangat
berdekatan satu sama lain. Dalam hal ini perlu melakukan teknik dua
jalan. Kertas yang berbentuk persegi digunakan dan cuplikan ditempatkan
pada satu sudut. Pengembangan dengan campuran pelarut 1, dengan
ujung kertas AB dicelupkan, memberikan pemisahan sebagian seperti
ditunjukkan dalam gambar 5 a. Lembaran kertas diambil dan dikeringkan
dan kemudian dimasukkan dalam bejana kedua dengan ujung AC
dicelupkan dalam pelarut 2. Pengembangan dengan pelarut ini, diikuti
dengan pengeringan dan pemberian pereaksi tertentu akan memberikan
noda-noda seperti gambar 5b.

A B
Permukaan pelarut
C D
Pelarut 2
5. a 5. b
Gambar 5. kromatografi dua jalan
Kertas saring dapat digantungkan/diletakkan sehingga pelarut bergerak

ke atas, ke bawah atau mendatar. Hasil-hasil dari metoda pertama dan
kedua adalah mirip tetapi berbeda dari metoda ketiga.
Dalam metoda penaikkan (ascending) kertas dicelupkan hingga ujung di

mana aliran mulai bergerak terletak sedikit di atas permukaan dari pelarut
dan pelarut naik melalui serat-serat dari kertas oleh gaya kapiler. Di
dalam metoda penurunan (descending) ujung alas dari kertas dicelupkan
dalam pelarut dan mengalir, meskipun diawali oleh gaya kapiler
diteruskan oleh gravitasi. Metoda mendatar (horizontal) sangat berbeda
dari kedua metoda di atas. Noda cuplikan ditempatkan pada pusat dari
kertas (biasanya kertas saring berbentuk bulat) dan pelarut diteteskan
juga di pusat kertas. Aliran juga oleh gaya kapiler, senyawa-senyawa
dalam campuran segera berkembang dengan pelarut.
Bila akan melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas, maka hal-

hal yang perlu diperhatikan adalah :
1. Metoda (penaikan, penurunan atau mendatar)

2. Macam dari kertas
3. Pemilihan dan pembuatan pelarut (fasa bergerak)
4. Kesetimbangan dalam bejana yang dipilih

5. Pembuatan cuplikan
6. Waktu pengembangan
7. Metoda deteksi dan identifikasi
Disamping sifat-sifat dari kertas dan pelarut, ada faktor-faktor penting

yang mempengaruhi pemisahan yaitu : suhu, besarnya bejana, waktu
pengembangan dan arah dari aliran pelarut.
d. Alat dan Teknik

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau
campuran pelarut yang sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa
batas pelarut berada dibawah garis pada bercak diatasnya. Gambar
berikutnya tidak menunjukkan terperinci bagaimana kertas di
gantungkan karena terlalu banyak kemungkinan untuk mengerjakannnya
dan dapat mengacaukan gambar. Kadang-kadang kertas hanya
digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan klip kertas
pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan
posisi berdiri pada bawah wadah.
Alasan penutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa astmosfer
dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara
dalam gelas kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama
halnyadengan pergerakan pelarut pada kertas.
Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan
campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
Gambar menunjukkan apa yang tampak setelah pelarut telah bergerak

hampir seluruhnya ke atas.
Dengan sangat mudah dijelaskan melihat dari kromatogram akhir dari

pena yang ditulis pada pesan yang mengandung pewarna yang sama
dengan pena 2. Anda juga dapat melihat bahwa pena 1 mengandung dua
campuran berwarna biru yang kemungkinan salah satunya mengandung
pewarna tunggal terdapat dalam pena 3. Nilai Rf.
Beberapa senyawa dalam campuran bergerak sejauh dengan jarak yang
ditempuh pelarut; beberapa lainnya tetap lebih dekat pada garis dasar.
Jarak tempuh relative pada pelarut adalah konstan untuk senyawa
tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatunya tetap sama,
misalnya jenis kertas dan komposisi pelarut yang tepat. Jarak relative
pada pelarut disebut sebagai nilai Rf. Untuk setiap senyawa berlaku
rumus sebagai berikut:
jarak yang ditempuh oleh senyawa
Rf =
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bergerak 9.6 cm dari
garis dasar, sedangkan pelarut bergerak sejauh 12.0 cm, jadi Rf untuk
komponen itu:
Dalam contoh kita melihat ada beberapa pena, tidak perlu menghitung
nilai Rf karena anda akan membuat perbandingan langsung dengan
hanya melihat kromatogram. Anda membuat asumsi bahwa jika anda
memiliki dua bercak pada kromatogram akhir dengan warna yang sama
dan telah bergerak pada jarak yang sama pada kertas, dua bercak

tersebut merupakan senyawa yang hampir sama. Hal ini tidak selalu
benar. Anda dapat saja mempunyai senyawa-senyawa berwarna yang
sangat mirip dengan nilai Rf yang juga sangat mirip.
d. Bagaimana Jika Substansi yang Diidentifikasi Tidak Berwarna?

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan membuat bercak menjadi tampak
dengan mereaksikannya dari beberapa pereaksi yang menghasilkan
produk yang berwarna. Contoh yang baik yaitu kromatogram yang
dihasilkan dari campuran asam amino.
Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin
memisahkan asam amino tertentu yang terdapat dalam campuran. Untuk
menyederhanakan, mari berasumsi bahwa anda telah mengetahui
kemungkinan campuran hanya mengandung lima asam amino yang
umum.
Setetes larutan campuran ditempatkan pada garis dasar kertas, dan
dengan cara yang sama ditempatkan asam amino yang telah diketahui
diteteskan disampingnya. Kertas lalu ditempatkan dalam pelarut yang
sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran
adalah M, dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1 sampai 5.
Posisi pelarut depan ditandai dengan pinsil dan kromatogram lalu
dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin
bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa berwarna,
utamanya coklat atau ungu.
Gambar di sebelah kiri menunjukkan kertas setelah dilalui pelarut

hampir pada bagian atas kertas. Bercak masih belum tampak. Gambar
kedua menunjukkan apa yang mungkin tampak setelah penyemprotan

ninhidrin.
Tidak diperlukan untuk menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah
dapat membandingkan bercak dalam campuran dengan asam amino-
asam amino yang telah diketahui berdasarkan posisi dan warnanya.
Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino yang diberi
tanda 1,4 dan 5. Bagaimana jika campuran mengandung asam amino
lain selain dari asam amino yang anda gunakan untuk perbandingan?
Akan terdapat bercak dalam campuran yang tidak sesuai dari asam
amino yang telah diketahui. Anda harus mengulangi percobaan
menggunakan asam amino-asam amino sebagai bahan perbandingan.
e. Kromatografi Kertas Dua Arah.

Kromatografi kertas dua arah dapat digunakan dalam menyelesaikan
masalah pemisahan substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat
serupa.
Pada senyawa-senyawa berwarna lebih mudah melihat apa yang
terjadi. Anda dapat mengerjakannya secara sempurna hal ini dengan
senyawa-senyawa yang tidak berwarna, tetapi anda harus
menggunakan banyak imajinasi dalam menjelaskan apa yang terjadi.
Kromatogram dibuat dari bercak tunggal dari campuran yang

ditempatkan kedepan dari garis dasar. Kromatogram ditempatkan dalam
sebuah pelarut sebelum dan sesudah sampai pelarut mendekati bagian
atas kertas. Dalam gambar, posisi pelarut ditandai dengan pinsil
sebelum kertas kering. Posisi ini ditandai sebagai SF1 yaitu pelarut
depan untuk pelarut pertama. Kita akan menggunakan dua pelarut yang
berbeda

Jika anda melihatnya lebih dekat, anda dapat melihat bahwa bercak
pusat besar dalam kromatogram sebagian biru dan sebagian hijau. Dua
pewarna dalam campuran memiliki nilai Rf yang hampir sama.
Tentunya, nilai-nilai ini bisa saja sama, keduanya memiliki warna yang
sama; dalam hal ini anda tidak dapat mengatakan bahwa ada satu atau
lebih pewarna dalam dalam bercak itu. Apa yang anda kerjakan
sekarang adalah menunggu kertas kering seluruhnya, dan putar 90o C
dan perlakukan kromatogram kembali dengan pelarut yang berbeda.
Gambar berikutnya menunjukkan apa yang mungkin terjadi pada

berbagai bercak pada kromatogram awal. Posisi pelarut kedua juga
ditandai.
Tentunya anda tidak dapat melihat bercak-bercak dalam posisi awal dan
akhir; Bercak-bercak telah bergerak! Kromatogram akhir akan tampak
seperti ini:
Kromatografi dua arah secara seluruhnya terpisah dari campuran

menjadi empat bercak yang berbeda. Jika anda akan mengidentifikasi
bercak-bercak dalam campuran, secara jelas anda tidak dapat
melaksanakannya dengan perbandingan substansi pada kromatogram
yang sama seperti pada contoh sebelumnya menggunakan pena atau
asam amino-asam amino. Anda dapat berakhir dengan kekacauan pada
bercak-bercak yang tanpa arti. Meskipun demikian, anda dapat bekerja

dengan nilai Rf untuk setiap bercak-bercak dalam pelarut-pelarut, dan
kemudian membandingkan nilai-nilai yang anda telah ukur dari senyawa
yang telah diketahui pada kondisi yang tepat sama.
f. Jenis Kertas
Pekerjaan mula-mula dalam kromatografi kertas dilakukan dengan

menggunakan kertas saring Whatmann No, 1. Jenis kertas whatman
dengan berbagai nomer banyak digunakan dengan kemurnian yang
tinggi dan tebal merata. Kertas dalam pemisahan terutama
mempunyai pengaruh pada kecepatan aliran pelarut. Sedangkan fungsi
dari kertas sendiri sangat kompleks. Efek-efek serapan disebabkan
oleh sifat polar dari gugus-gugus hidroksil. Kecepatan aliran naik
dengan penurunan kekentalan dari pelarut (dengan kenaikan dalam
suhu), tetapi aliran pelarut pada suhu yang tertentu ditentukan oleh
kerapatan dan tebal dari kertas. Penurunan kerapatan atau kenaikan
tebal memberikan kecepatan aliran yang lebih tinggi. Kertas
disediakan dalam bermacam-macam standar lembaran, bulatan,
gulungan dan dalam bentuk tertentu. kertas harus disimpan ditempat
jauh dari setiap sumber dari uap (terutama ammunia yang mempunyai
afinitas yang tinggi terhadap selulosa).

g. Jenis Pelarut
Fasa gerak merupakan campuran yang terdiri dari stu komponen

organik utama, air, dan berbagai tambahan misalnya asam-asam,
basa atau pereaksi komplek. Pelarut harus sangat mudah menguap,
karena terlampau cepat mengadakan kesetimbangan, keadaan lain
volatilitas yang tinggi mengakibatkan lebih cepat hilang
meninggalkan lembaran kertas setelah bergerak. Ion-ion anorganik
dipisahkan sebagai ion-ion komplek dengan beberapa kelarutan
dalam pelarut-pelarut organik, misal besi membentuk ion klorida
kompleks yang larut dalam aseton berair, sedang nikel tidak segera
membentuk ion seperti besi sehingga besi dan nikel dapat
dipisahkan dengan pelarut ini, sejauh asam klorida berada untuk
menstabilkan ion kompleks. Beberapa contoh dari macam-macam
campuran pelarut dapat dilihat seperti pada tabel 3.
Untuk mendapatkan hasil campuran pelarut yang tak dapat diulang lagi
maka harus dibuat hati-hati meskipun hanya dengan gelas ukur. Pelarut
jangan dipakai setelah selang beberapa lama. Untuk pengembangan
selama satu malam pelarut hanya digunakan satu kali pakai. Untuk
penggunaan pelarut-pelarut yang mudah menguap maka pemakaiannya
dalam keadaan yang baru saja dibuat.
Tabel 3. Jenis-jenis Pelarut untuk KromatografI Kertas
Pemi sahan Pel arut Perbandi ngan

Asam- asam atnino f enol/ air lar utan jenuh
n-but anol/as.cuka/ air 4: 1:5
n-but anol/as.cuka/ air 12:3: 5
n-bu O H/pir idin/air 1: 1:1
Kar bihidr at (gula) et il aset at/pir idin/air 2: 1:2
et il aset at/n- PrO H/air 6: 1:3
Etil asetat/ as. cuka/air 3: 1:3
Asam- asam lemak n-but anol/1, 5 M NH3 Larut an j enuh
Fe, CI, Hr, J
(gar am-garam Na) pir idin/air 90: 10
Hg, Pb, Cd, Cu. Bi
(klor ida-klor ida) n-but anol/3M HCl lar utan jenuh
h. Cara Penempatan Cuplikan pada Kertas

Larutan carnpuran yang akan dipisahkan ditempatkan pada kertas yang
berupa noda. la biasanya dibiarkan untuk berkembang membentuk suatu
bulatan. Bagian dari kertas yang ditetesi dibiarkan dalam keadaan
mendatar, sehingga larutan tetap dalam keadaan kompak dalam bentuk
bulatan. Kertas jangan sampai tersentuh oleh zat-zat yang tak dikehendaki.
Besarnya noda tergantung pada percobaan, tetapi diameter harus tak lebih
dari kira-kira 0,5 cm. Diameter ini dihubungkan dengan tebal dan
karakteristik serapan dari kertas, tetapi biasanya noda yang lebih kecil
akan menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Dalam penempatan cuplikan dalam kertas yang penting bukan jumlah

volume, tetapi banyaknya campuran yang tertinggal bila pelarut telah
teruapkan. Jika larutan terlalu encer untuk ditempatkan sekali, maka
[arutan dapat "dipekatkan" di atas kertas dengan cara meneteskan berkali-
kali pada tempat yang sama, dengan jarak waktu setelah tetes yang per-
tama kering baru tetes yang kedua dan seterusnya. Noda sebaiknya
dibiarkan kering dalam udara, tetapi bila mungkin dapat dikeringkan
dengan menggunakan kipas angin. Dalam pengeringan jangan
menggunakan udara panas, terutama jika larutan bersifat asam, karena ia
dapat menyebabkan kertas menjadi hitam.
Harus dicegah penempatan larutan terlalu banyak. Karena kelebihan setiap

komponen akan menyebabkan tidak akan tercapainya kesetimbangan
partisi selama ia bergerak, hingga ia akan mengakibatkan terjadinya
kedudukan/lokasi yang kabur. Ada beberapa cara pembuatan noda. Salah
satu caranya adalah dengan menggunakan gelas kapiler dengan diameter
yang sama, di mana cara ini yang sering digunakan. Sedangkan cara yang
lain dapat menggunakan alat penyuntik.
Kedudukan dari permukaan pelarut yang terdapat pada kertas harus selalu
diberi tanda segera setelah lembaran kertas diambil dan kemudian
dikeringkan, dengan cara digantungkan. Penandaan dapat menggunakan
pensil pada sisi samping kertas. Pengeringan sebaiknya dibiarkan dalam
udara, bila dikehendaki dapat menggunakan kipas angin, jangan
mengeringkan dengan menggunakan udara panas, karena dapat merusak

beberapa konstituen dari campuran. Aliran udara harus paralel terhadap
permukaan dari kertas.
Kebanyakan dari pelarut-pelarut kromatografi cepat menguap tanpa

meninggalkan residu. Hanya untuk fenol, di mana untuk menguapkan
sempurna membutuhkan waktu kira-kira empat jam. Harus diusahakan
penghilangan pelarut secara sempurna, hal ini untuk mencegah pengaruh
pada penambahan pereaksi. Yang penting lagi terutama dalam
kromatografi dua jalan di mana jejak pelarut yang pertama harus hilang
sebelum penjalanan yang kedua. Untuk alasan ini adalah paling baik
menggunakan pertama-tama pelarut yang lebih mudah menguap (jadi, n-
butanol/asam cuka/air). Untuk mendapatkan hasil yang dapat diulang
kembali maka urutan pekerjaan harus dilakukan sama.
i. Deteksi Daerah-daerah Noda
Keberhasilan dari pemisahan kromatografi tergantung juga pada proses

deteksi. Senyawa-senyawa yang berwarna tentu saja terlihat sebagai noda-
noda berwarna yang terpisah pada akhir pengembangan. Un[uk senyawa-
senyawa tak berwarna memerlukan deteksi secara kimia clan fisika. Sering
menjadi pekerjaan rutin bahwa kromatogram-kromatogram diuji di bawah
sinar ultra violet sebelum dan sesudah setiap metoda dikerjakan.
Panjang gelombang yang digunakan biasanya 370 millimikron dan 254

millimikron. Beberapa senyawa terlihat sebagai bintik fluoresence. Metoda
fisika lainnya, terutama hanya dapat dipakai terhadap senyawa-senyawa
radioaktif, yaitu berdasarkan autoradiografi dan pencacahan. Metode-
metode kimia adalah merupakan deteksi yang paling penting. Pereaksi-
pereaksi yang digunakan biasanya dinyatakan sebagai "pereaksi-pereaksi
lokasi". Pereaksi lokasi menggunakan pelarut yang baik, yang diikuti
dengan penguapan. Pelarut yang ideal adalah semua senyawa-senyawa
yang terpisah tidak larut tetapi hal ini tidak mungkin. Cara menggunakan
untuk mendeteksi noda yaitu dengan jalan penyemprotan.
Penyemprotan dilakukan perlahan-lahan dari samping ke samping dan dari

atas ke bawah. Pelarut yang digunakan untuk penyemprotan harus tidak

menguap. Tetapi di lain fihak, penguapan yang cepat dari kertas diperlukan
untuk mencegah difusi dari noda-noda yang terpisah. Pelarut-pelarut yang
digunakan adalah etanol, propanol, n-butanol atau kloroform atau
campuran daripadanya. Campuran berair dapat digunakan, tetapi terlalu
banyak air harus dicegah jika mungkin, karena dapat memberikan efek
melemahkan kertas. Penyemprotan kertas harus dilakukan dalam lemari
asam. Selesai penyemprotan alat harus dibersihkan untuk mencegah
lobang penyemprot menjadi buntu.
Pereaksi yang digunakan untuk mendeteksi asam-asam amino biasanya

ninhidrin (indanatrion hidrat). Pada suhu kamar pereaksi baru mernberikan
warna pada asam-asam amino kira-kira setelah dua puluh empat jam. Tetapi pada
pernanasan pada 100°C warna akan timbul setelah kira-kira empat menit.
Di dalam teknik pencelupan, larutan pereaksi dimasukkan dalam tempat

bejana yang dangkal, dan lembaran atau potongan kertas dicelupkan di
dalamnya. Ada beberapa keuntungan dalam pencelupan hanya
membutuhkan bejana yang murah. Pelarut yang lebih mudah menguap
dapat digunakan, hingga dapat mengurangi waktu yang dibutuhkan untuk
pengeringan hingga mengurangi bahaya difusi dari noda-noda selama
pengeringan. Aseton dapat digunakan sebagai pelarut. Tetapi yang sering
terjadi adalah bahwa senyawa-senyawa yang terpisah sangat larut dalam
pelarut yang terbaik untuk pereaksi lokasi. Hingga metoda pencelupan
sering menyebabkan hilangnya materi maka dalam hal ini metoda penyem-
protan sangat penting.
j. Identifikasi dari Senyawa-senyawa
Mengidentifikasi noda-noda dalam kertas menggunakan harga Rf

(retordation factor) yang didefinisikan sebagai :
Jarak yang digerakkan oleh senyawa

Rf =
Jarak yang digerakan oleh pelarut
Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

1) Pelarut disebabkan pentingnya koefisien partisi, rnaka perubahan-
perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat
menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2) Suhu.Perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga
kecepatan aliran.
3) Ukuran dari bejana. Volume dari bejana mempenyaruhi homogenitas
dari atmosfer jadi mernpengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-
komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada
tendensi perambat lebih lama, seperti perubahan-perubahan
komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan
berttbah juga. Dua faktor yaitu penguapan clan kornposisi mempe-
ngaruhi harga Rf.
4) Kertas. Pengaruh utama kertas pada harga -harga Rf timbul dari
perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam -macam
kertas. Kertas-kertas mempengaruhi kecepatan aliran dan akan
mempengaruhi pada kesetimbangan partisi.
5) Sifat dari rantpuran. Berbagai senyawa mengalami partisi di an -
tara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak.
Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteris tik dari kelarutan
satu terhadap lainnya hingga terhadap harga -harga Rf.
Untuk mengukur Rf perlu melokalisir permukaan pelarut. Harga -harga
Rf biasanya dinyatakan sebagai fraksi/bagian. Perbedaan dalam harga-
harga Rf untuk dua senyawa yang dipisahkan terg antung pada
besarnya noda-noda dan panjangnya aliran terlarut. Cara yang paling
mudah dalam pengukuran Rf adalah dengan menggunakan mistar.
Ujung nol ditempatkan pada titik mula -mula dan ujung yang lain
direntangkan ke arah permukaan pelarut dan harga Rf langsung dapat
dibaca pada titik di mana angka mistar tepat pada noda. Dalam
penentuan Rf perlu mengukur dari pusat pita atau noda.
Biasanya identifikasi dari senyawa yang tak diketahui dilakukan

pemisahan berulang. Daerah yang mengandung senyawa yang ta k
diketahui dipotong dan senyawa dielusi dengan pelarut yang sesuai.
Bila hanya diperoleh satu noda dengan menggunakan lebih dari satu

pelarut dengan menunjuk senyawa yang sama maka dapat diambil
kesimpulan bahwa kemungkinan keduanya adalah identik
Cara lain untuk mengidentifikasi senyawa -senyawa yaitu dengan reaksi-

reaksi warna yang karakteristik. Reaksi kebanyakan sangat berguna dalam
pemisahan senyawa-senyawa anorganik, tetapi untuk senyawa organik
sangat kecil kejadiannya, karena kebanyakan konstituen-konstituen dari
campuran mempunyai sifat -sifat kimia yang mirip.
1.2. Menyiapkan Sampel dan Standar untuk Kromatografi Lapis Tipis
a. Sampel dipersiapkan sama seperti preparasi sampel untuk

kromatografi kertas, yaitu sampel padat dilarutkan dengan pelarut
organik atau diekstraksi.
b. Perlu membuat plat kromatografi, yaitu untuk membentangkan
penyerap dalam palisan tipis yang berguna sebagai penyokong
yang inert. Penyerap padat berbentuk bubuk halus dibuat
menjadi bubur (slury) dengan air (kurang umum dengan zat cair
organik yang mudah menguap) dan dibentangkan di atas plat gelas.
Pembuatan lapisan tipis di atas kaca ada beberapa cara yaitu
dengan jalan menyemprotkan atau pencelupan, di samping
dikerjakan dengan tangan dapat juga dengan mesin. Plat yang telah
dilapisi dipanaskan atau di-"aktif'"-kan dengan jalan memanaskan
pada suhu kira-kira 100 ° C selama beberapa waktu lamanya.
Larutan cuplikan dalam pelarut yang mudah menguap diletak kan di
atas lapisan dengan menggunakan pipet atau alat penyuntik.
c. Waktu rata-rata untuk kromatografi lapisan tipis dengan panjang 10
cm pada silika gel adalah sekitar 20 - 30 menit (tergantung dari sifat
fasa bergerak), sedangkan pemisahan yang sama dengan
memerlukan waktu dua jam. Untuk pemisahan-pemisahan secara
kualitatif pada plat yang kecil memerlukan waktu sekitar 5 menit.
d. Hasil pemisahan yang baik ternyata bahwa penyerap dalam
kromatografi lapisan tipis mempunyai kapasitas yang lebih besar
bila dibandingkan dengan kertas. Keuntungan dari sistem serapan

ialah dapat digunakan untuk memisahkan senyawa -senyawa yang
sifatnya hidrofobi, seperti lipida-lipida dan hidrokarbon. Pemisahan
dengan lapisan tipis banyak digunakan dalam kimia organik dan beberapa
dalam kimia anorganik.
e. Pembuatan Lapisan Tipis
Penyerap dibentangkan di atas permukaan plat kaca. Untuk

pemisahan secara kualitatif yang cepat sering digunakan gelas
mikroskop (microscope slide). Kebanyakan alat-alat digunakan
dalam bentuk plat kaca dengan ukuran 20 x 5 cm atau 20 x 20 cm,
dua ukuran ini dianggap sebagai "standard" dan permukaan dari
plat harus rata.
Flat-plat kaca sebelum dipakai dicuci dulu menggunakan detergent
kemudian dikeringkan. Pencucian terakhir dapat memakai aseton (jika
perlu). Suatu hal yang perlu diperhatikan jangan menyentuh permukaan
dari plat yang bersih dengan jari-jari.
f. Pada dasarnya ada empat cara yang digunakan dalam pembuatan

lapisan tipis, yaitu pembentangan, penuangan, penyemprotan dan
pencelupan. Metoda-pembentangan dan penyernprotan dapat dikerjakan
dengan tangan atau dengan alat. Banyak pemakai yang tak
menggunakan metoda penuangan secara mekanik. Jika penyerap
sangat halus dan partikel-partikelnya homogen, dan jika tak
menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituangkan di atas plat dan
dibiarkan hingga melapisinya. Pembuatan dengan penuangan biasanya
mudah dengan menggunakan jenis alumina, dan pembuatan buburnya
tidak menggunakan air, melainkan menggunakan cairan yang mudah
menguap seperti etanol (atau campuran etanol-air) atau etil asetat.
g. Pencelupan. Plat-plat yang kecil, seperti gelas mikroskop, dapat dilapisi

dengan pencelupan dalam bubur dari penyerap dalam kloroform atau zat
cair mudah menguap yang lain. Sekali lagi lebal lapisan yang pasti tidak
diketahui dan kemungkinan lapisan tak dapat dibuat dengan baik,

meskipun demikian metoda ini cukup memuaskan untuk membuat
sejumlah dari plat-plat untuk pemisahan secara kualitatif dengan cepat.
Setelah pembentangan plat dibiarkan kering selama kira-kira 5 -10
menit, ini bila dibuat dengan bubur yang berair, selanjutnya dipanaskan
dan di"aktif"kan dengan pemanasan pada suhu kira-kira 100°C selama
30 menit. Plat-plat yang dibuat dengan zat-zat cair organik yang mudah
menguap tak perlu pemanasan lebih lanjut. Penyentuhan dengan jari-jari
akan merusak lapisan dan melepaskan partikel-partikel dari permukaan.
h. Fasa Bergerak dan Penempatan Cuplikan

Pemilihan fasa bergerak tergantung pada faktor-faktor seperti dalarn
pemisahan dalam kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan
campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin,
karena dapat mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran
pelarut. Jika komponen-kornponen yang mempunyai sifat polar tinggi
(terutama air) dalam campuran akan merubah sistem menjadi sistem
partisi. Campuran yang baik memberikan fasa-fasa bergerak yang
mernpunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya tidak
mencampur lebih dari dua komponen, karena campuran yang lebih
kompleks cepat mengalami perubahan-perubahan fasa terhadap
perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting dalarn
lapisan tipis daripada bentuk-bentuk kromatografi lain, karena
digunakan sejumlah materi yang sedikit.
Cara menempatkan cuplikan pada lapisan tipis seperti cara-cara yang

digunakan pada kromatografi kertas, yaitu dengan pipa kapiler atau
mikro pipet. Pada penempatan cuplikan ujung penetes dapat mengenai
permukaan lapisan, meskipun demikian harus diusahakan sedekat
mungkin. Pelarut cuplikan merupakan pelarut yang mudah menguap dan
mempunyai polaritas yang rendah.
Kedudukan noda tak dapat diberi tanda dengan pensil, seperti dikerjakan
pada kertas, penunjuk noda dapat digunakan misal dengan penggaris
yang diletakkan di samping plat kaca. Penempatan noda di atas plat kira-
kira 1 cm dari salah satu ujungnya di mana ujung ini nanti

dicelupkan dalam pelarut. Untuk plat kaca yang mempunyai ukuran 20 x
20 cm, penempatan noda-noda kira-kira 1,5 cm dari ujung bawah dan
dimulai clan diakhiri kira-kira 0,5 cm dari samping kaca dan noda-noda
diteteskan masing-masing pada jarak kira-kira 1 cm dari masing-masing
pusat noda. Untuk pekerjaan pemisahan yang besar penempatan noda
dapat diteteskan hingga membentuk garis, lihat gambar 6.
Gambar 6. Plat Kaca Kromatografi Lapisan Tipis, Ukuran 20 x 20 cm

untuk Kromatografi Penaikan Satu Arah
Garis awal diberi tanda pada ujung dari plat dengan pensil dan garis akhir
dapat dibuat di bagian atas dengan menggoreskan pensil, yang
menyebabkan goresan dari aliran pelarut akan ditahan bila permukaan
pelarut sampai pada garis. Jangan terlalu lama mencelupkan plat dalam
bejana bila permukaan pelarut telah mencapai garis akhir, karena oleh
pengaruh difusi dan penguapan dapat menyebabkan pemancaran dari noda-
noda yang terpisah. Ujung plat yang dicelupkan dalam fasa bergerak jangan
dibiarkan hingga rusak. Bila akan dilakukan pemisahan dua jalan, maka
lapisan dari dua sisi yang berdekatan tidak perlu dihilangkan.
i. Pengembangan Kromatografi dan Lokasi

Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah ditempatkan di
atasnya, kemudian dimasukkan dalarn bejana yang cocok dengan ujung
yang paling bawah, di mana cuplikan ditempatkan, dicelupkan dalam fasa
bergerak yang telah dipilih sedalam kira-kira 0,5 - 1,0 cm. Biasanya dua
plat dapat dimasukkan dalam bejana, dalam hal ini akan diperoleh
kromatografi penaikkan. Bejana diusahakan jangan sampai bocor.
Sering tidak rnemerlukan waktu kesetimbangan, tetapi untuk meyakinkan

homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana
dapat dilapisi dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam
dalam fasa bergerak. Sedapat mungkin menggunakan bejana yang kecil

sehingga atmosfer di dalam bejana mempunyai volume sekecil mungkin.
Untuk plat kaca yang kecil, microscope slide, sebagai bejana dapat dipakai
gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500 ml, juga dinding sebelah
dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang ujungnya dicelupkan
dalam fasa bergerak.
Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai berhubungan

dengan atmosfer luar, karena dapat mengakibatkan komponen-komponen
yang mudah menguap. Kalau dikehendaki perkembangan dengan jenis
penurunan atau mendatar, maka alat yang digunakan menjadi agak sukar.
Misal menghendaki perkembangan jenis penurunan, maka tempat fasa
bergerak ditempatkan di bagian atas dari bejana. Dan untuk mengalirkan
pelarut ke tempat plat diperlukan perantara yang dapat berupa kapas atau
gulungan kertas lihat gambar 7.
a. Tempat pelarut
b. Gulungan kertas
c. Lapisan kromatografi
Gambar 7. Kromatografi Lapisan Tipis Jenis Penurunan.
Setelah pengembangan, plat diambil dari bejana dan dibiarkan kering tanpa
pemanasan. Bila diperlukan, aliran udara dapat digunakan dan diarahkan
pada permukaan yang mendatar. Seperti dalam kromatografi kertas, dalam
pemisahan dua jalan, maka pelarut yang pertama harus hilang sebelum
pemisahan/pengembangan berikutnya.
Pada umumnya metoda lokasi dari senyawa tak berwarna pada lapisan
tipis adalah mirip seperti dikerjakan dalam kromatografi kertas. Metoda-
metoda fisika yang sering digunakan meliputi fluoresensi sinar ultra ungu
dan pencacahan radioaktif. Jika pereaksi kimia digunakan untuk lokasi,
maka dapat dilakukan dengan penyemprotan dan tidak dengan pencelupan

seperti diutarakan pada kromatografi kertas. Senyawa-senyawa organik
dapat dilokasi dengan penyemprotan menggunakan asam sulfat pekat
kemudian dipanaskan pada suhu sekitar 200°C selama lebih kurang
sepuluh menit. Noda dari senyawa akan menjadi hitam. Ini merupakan cara
lokasi yang efektif, tetapi sedikit meinberikan pertolongan dalam
identifikasi. Pereaksi lokasi yang lain untuk senyawa organik adalah Iod.
Plat kaca yang mengandung noda-noda dibiarkan terkena uap Yod, yaitu
dengan jalan meletakkan plat dalam bejana atau gelas piala yang tertutup
yang berisi kristal Iod untuk beberapa saat lamanya. Warna dari bejana
akan menjadi ungu, untuk senyawa-senyawa tak jenuh akan memberikan
noda-noda yang tak berwarna, tetapi banyak senyawa organik yang jenuh
akan menimbulkan noda-noda yang berwarna coklat. Semua warna ini
akan cepat hilang dibiarkan diatmosfer.
j. Identifikasi dan Harga-harga Rf

Identifikasi dari snyawa-senyawa yang terpisah pada lapisan tipis lebih baik
dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna.
Untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam

lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Seperti halnya
pada kertas harga Rf didefinisikan sebagai berikut:
Jarak yang digerakkan oleh senyawa dari titik asal

Harga Rf =
Jarak yang digerakkan oleh palarut dari titik asal
Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan

harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang
diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang
digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran
dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.
Pengukuran lain yang sering dipakai adalah menggunakan pengertian R x

atau Rstd yang didefinisikan sebagai berikut :
Jarak yang digerakkan oleh senyawa yang tak diketahui

Rx atau Rstd =
Jarak yang digerakkan oleh senyawa standard yang diketahui

Senyawa standard biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip dengan
senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Misal perbandingan suatu
hidrolisa protein dengan glisin atau alanin.
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi
lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah :
1) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2) Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.(Biasanya aktifitas dicapai
dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-
molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap).
Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar
terhadap harga Rf meskipun menggunakan fasa bergerak dan solute
yang sama tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama,
jika menggunakan penyerap yang sama, ukuran partikel tetap dan
jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap, dalam prakteknya tebal
lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal
lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut
menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak. Kemurnian dari
pelarut yang digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi
lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut
digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul
diperhatikan.
5) Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang
digunakan.
6) Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang
hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun
teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
7) Jumlah cuplikan yang digunakan.

Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil
penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan

efek tak kesetimbangan lainnya, hingga akan mengakibatkan
kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8) S u h u. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu

tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam
komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-
perubahan fasa.
9) Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting
dalarn kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer
dalam bejana jenuh dengan uap pelarut. Suatu gejala bila atmosfer
dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut
campuran, akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut
yang berbentuk cekung dan fasa bergerak lebih cepat pada bagian
tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.
1.3. Menyiapkan sampel dan Standar untuk Kromatografi Serapan/

Kolom
a. Sampel dipersiapkan sama dengan preparasi sampel untuk

kromatografi kertas, yaitu bila sampel padat diekstaksi terlebih dahulu.
b. Penyiapan pelarut atau pemilihan dari pelarut tergantung dari sifat
kelarutannya. Tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tak
tergantung pada kekuatan elusi, sehingga zat-zat elusi yang lebih
kuat dapat dicoba. "Kekuatan" dari zat elusi adalah daya penyerapan
pada penyerap dalam kolom. Biasanya untuk penyerap-penyerap
yang polar seperti alumina dan silika gel, maka kekuatan penyerapan
naik dengan kenaikan polaritas dari zat yang diserap.
Menurut TRAPPE, kekuatan elusi dari deret-deret pelarut untuk

senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel akan diturunkan
dalam urutan sebagai berikut :
air murni < metanol < etsnol < propanol < aseton < etil-asetat <
dietileter < kloroform < rnetilena klorida < benzena < toluena <
trikloroetilena < karbon tetraklorida < sikloheksana < heksana.

Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada
karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid
diturunkan dalam urutan :
etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol <
air murni.
Urutan ini adalah dari kenaikan polaritas atau penurunan panjang

rantai dari homolog. Sedangkan untuk alumina dan silika gel
urutannya adalah sebaliknya. Kemurnian dari pelarut-pelarut harus
setinggi mungkin.
c. Penyiapan penyerap
Penyerap yang sering digunakan adalah alumina. Suatu pengertian

yang digunakan dalam hubungannya dengan penyerap-penyerap
adalah "aktifasi". Kadang-kadang dihubungkan dengan luas
permukaan spesifik dari zat padat, yaitu luas permukaan yang diukur
dalam meter persegi tiap gram, dalam hal karbon, silika gel dan
alumina dapat dibuat menjadi aktif dengan memiliki permukaan
spesifik beratus-ratus meter persegi. Sedangkan seperti kalsium,
karbonat dan kalsium hidroksida, mempunyai permukaan spesifik
yang mempunyai ukuran dalam puluhan meter persegi atau kurang
sampai dikategorikan relatif tak aktif.
Banyak zat-zat padat yang telah digunakan sebagai penyerap,

diantaranya adalah sebagai berikut :
Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Alumina/magnesia  Sterol-sterol, zat warna, vitamin-vitamin, ester-ester,

alkaloid-alkaloid, senyawa-senyawa anorganik.
Silika gel  sterol-sterol, asam-asam amino.
Karbon  Peptida-peptida, karbohidrat-karbohidrat, asam-asam

amino
Magnesium silikat  Sterol-sterol, ester-ester, gliserida-gliserida, alkaloida-

alkaloida
Magnesium  Porphirin,Karotenoida-karotenoida
karbonat
 Karotenoida-karotenoida, xantofil

Kalsium  Enzim-enzim, protein-protein, polinukleotida-
hidroksida polinukleotida
Kalsium karbonat  Sterol-sterol

Kalsium fosfat  Enzim-enzim
Aluminium silikat  Klorofil- Klorofil
Banyak penyerap seperti alumina, silika gel, karbon aktif dan

magnesium silikat dapat diperoleh diperdagangan. Penyerap tersebut
sering memerlukan aktivasi sebelum dipakai, hal ini dapat dilakukan
dengan pemanasan dan mungkin dengan pengurangan tekanan.
Suhu optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar 400°C dan
waktu pemanasan cukup selama 4 jam. Untuk kebanyakan zat-zat
padat, pemanasan pada suhu 200°C selama 2 jam.
Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi

kolom sering merupakan katalisator yang baik; ini rnerupakan bahaya
yang perlu mendapat perhatian. Alumina sering menimbulkan
perubahan-perubahan kimia dan menimbulkan reaksi-reaksi misal
dapat menyebabkan kondensasi dari aldehida-aldehida dan keton-
keton, sehingga bila hal ini terjadi, maka harus menggunakan alumina
yang bersifat netral. Silika gel dapat menyebabkan isomerisasi dari
berbagai senyawa-senyawa seperti terpen dan sterol.
d. Kolom Partisi
Didalam kromatografi partisi, penyerap zat padat diganti dengan fasa
tetap zat cair, yang biasanya hanya sebagian dapat bercampur
dengan zat cair yang mengalir sebagai fasa bergerak. Zat yang
dilarutkan (solute) akan didistribusikan dengan sendirinya diantara
dua fasa zat cair (tetap dan bergerak) sesuai dengan koefisien
partisinya. Disebabkan perbedaan-perbedaan dalam koeffisien partisi
dari berbagai komponen, maka campuran akan terpisah dengan cara
yang sama seperti pada sistem-sistem penyerap.
d. Fasa tetap harus disokong dalarn beberapa cara, yaitu fasa tetap zat
cair disokong pada zat padat yang bersifat inert terhadap senyawa-
senyawa yang akan dipisahkan. Zat padat yang menyokong ini

ditempatkan dalam kolom seperti pada kromatografi serapan.
Kenyataan sangat kecil sekali perbedaan antara dua macam jenis
kromatografi ini. Zat yang menyokong harus penyerap dan menahan
fasa tetap dan harus membuat luas permukaannya menjadi seluas
mungkin untuk fasa yang mengalir. la harus stabil, mudah diisikan
dalam kolom bila menyerap fasa tetap zat cair dan harus tidak
merintangi aliran pelarut. Fasa bergerak dalam kromatografi partisi
dapat berupa zat cair atau gas. Hal hal yang perlu diperhatikan dalam
kolom partisi adalah :
(1) Zat-zat padat penyokong
Zat-zat penyokong yang digunakan kebanyakan ialah silika gel, bubuk

selulosa dan tanah diatome (kieselguhr, celit dan sebagainya) zat
padat lainnya seperti pati hanya digunakan secara terbatas. Silika gel
hampir selalu digunakan dengan air atau larutan berair sebagai bufer
sebagai fasa tetap. Jumlah zat cair yang digunakan kira-kira 0,6 ml
untuk setiap gram silika gel.
(2) Peralatan
Kolom dan alat-alat lain yang digunakan untuk kromatografi partisi

adalah sama seperti yang digunakan dalam kromatografi serapan.
Tabung-tabung yang digunakan di laboratorium panjangnya antara 25
- 50 cm dengan diameter hingga 4 cm. Aliran pelarut yang melalui
kolom partisi mempunyai tendensi agak lambat tetapi dapat
dipercepat dengan menggunakan tekanan udara di atas kolom seperti
halnya pada kolom serapan.
(3) Cara memasukkan penyerap
Pengisian penyerap dalam kolom adalah sangat penting seperti dalam

kromatografi serapan. Pertama mencampur penyokong dengan fasa
tetap diaduk dengan sejumlah fasa bergerak yang digunakan. Bubur
ini kemudian dituangkan sedikit demi sedikit dalam tabung yang
mengandung sedikit zat cair yang sama. Setiap pemasukan
bubur ke dalam tabung disertai dengan penekanan dengan

batang gelas yang ujungnya datar sedikit lebih kecil daripada diameter
tabung. Kelebihan dari pelarut dapat dibiarkan hingga lepas melalui
kolom atau diambil dengan pipet. Berhasilnya pemisahan tergantung
pada kekompakan pengisian dan keteraturan pita-pita kromatografi.
(4) Pemasukan Cuplikan
Pemasukan cuplikan adalah menggunakan pipet seperti

dilakukan pada kolom serapan. Mula -mula melarutkan cuplikan
dalam sejumlah fasa bergerak dan me ncampurkan dengan
sejumlah zat padat penyokong hingga diperoleh bubuk yang
kering. Bubuk ini kemudian diletakkan di atas kolom dan sedikit
fasa bergerak ditambahkan.
(5) Elusi
Teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi adalah sama

seperti yang di gunakan dalam kolom serapan. Jika fasa tetap
adalah berair, maka fasa bergerak yang digunakan zat cair
organik atau campuran. Jika penyokong yang digunakan tak
suka air, maka fasa tetap berupa zat organik dan fasa bergerak
berair adalah menjadi mungkin. Ini dikenal sebagai kromatografi
“fasa berbalik” dan telah digunakan untuk memisahkan senyawa-
senyawa yang sangat larut dalam pelarut -pelarut organik.
Tabel 2. Contoh Beberapa Pemisahan pada Kolom Partisi
Pemisahan Penyokong Fase Fase bergerak

tetap
Alkolurl-alkohol C1-C4 Calite Air CHCl3 atau CCl4
Asanrasam lemak Cz-C8 Silica gel Air CHCl3/n -BuoH
Atam-asam amina Pati Air n-ProH atau n -
Fenol-fenol Selulosa Air BaOH/HCl
Lipida-lipida Silica gel Air MeOH/n-
BaOH/CHCl3

Bermacam-macam
2. LEMBAR KEJA
I. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KOLOM
Acara : Menetapkan zat warna di dalam sampel dengan khromatografi kolom.

Tujuan : Melakukan penetapan zat warna dengan menggunakan khromatografi
kolom
Alat :
 Beaker glas
 Batang pengaduk
 Mortal dan martil
 Corong
 Kolom
 Erlenmeyer kecil
Bahan :
 Minuman/makanan/daun-daunan/bunga yang berwarna.
 CaCO3
 n- Hexan
 Etanol
 Kertas saring
 Glass woll/kapas
Cara Kerja :
A. Penyiapan sampel :
1. Sampel/daun/wortel di ekstrak dengan pelarut organic (etanol atau n-Hexan).
2. Ekstrak disaring dengan kapas atau kertas saring, filtratnya diuapkan hingga
diperoleh larutan yang pekat (Jangan sampai kering).
B. Penyiapan kolom dan pembuatan penyerap.

1. Masukkan glass woll atau kapas ke dalam kolom hingga bagian bawah,
2. Masukkan serbuk CaCO3 perlahan-lahan hingga merata sampai 1/3 isi kolom,
atau serbuk CaCO3 dilarutkan dahulu dalam pelarut organik (Petroleum eter)
hingga diperoleh bubur.

3. Tuangkan bubur CaCO3 ke dalam kolom sampai 1/3 dari panjang kolom.
4. Beri kertas saring berbentuk bulatan diatas permukaan penyerap.
5. Teteskan larutan sampel (A) ke dalam kolom penyerap dengan menggunakan
pipet, berikut tambahkan pelarut, dan jaga jangan sampai di atas permukaan
penyerap kering.
6. Tunggu beberapa lama sampai diperoleh pita-pita yang berwarna terpisah.
7. Amati warna pita-pita yang terbentuk dan tuliskan warna apa yang terpisah
tersebut.
II. LEMBAR KERJA : KROMATOGRAFI KERTAS

Acara : Penetapan zat warna yang terdapat dalam bahan dengan khrometografi
kertas menaik.
Tujuan : Melakukan penetapan zat pewarna yang terdapat dalam

ninuman/makanan/ekstrak daun dll.
Alat :
 Gelas piala
 Hot palte
 Bejana kromatografi
 Kertas kromatografi
 Mikropipet
 Mortar dan matil
 Corong gelas
 Cawan penguap
 Kertas saring
Bahan :
 Asam asetat
 Aquadest
 Etanol 50%
 Aseton
 Hexan

 Minuman fanta (merah), the botol, jelly, jenis daun (Hijau), kembang gula.
Cara Kerja :
A. Mempersiapkan sampel :
1. Minuman teh botol/minuman ringan ditambah asam asetat hingga bereksi
asam.
2. Untuk kembang gula larutkan dalan aquadest dan asam asetat.
B. Mempersiapkan kertas kromatografi :

1. Potong kertas kromatografi dengan panjang dan lebar tertentu sesuai dengan
bejana kromatografi.
2. Buatlah garis dengan pinsil pada kertas khromatografi, sejajar dengan sisi
kertas bagian bawah dan berjarak 2 cm.
3. Pada garis tersebut buatlah noda atau bercak dengan mikro pipet atau jarum
injek, dan totolkan berturut-turut untuk masing-masing sampel dengan jarak 2
cm.
4. Sebelum kertas dimasukkan ke dalam bejana, bejana tersebut harus
dijenuhkan dahulu dengan uap pelarut.
5. Gantungkan kertas tersebut dalam bejana kromatografi dan tutuplah sampai
bejana jenuh dengan uap pelarut, kemudian celupkan kertas sampai tercelup
setinggi 1 cm
6. Setelah pelarut menaik sampai jarak tertentu dari tempat noda, keluarkan
kertas dan berilah tanda dengan pensil, kemudian keringkan (diangin-
anginkan).
7. Bandingkan noda sampel terhadap noda standar atau pembanding dan hitung
Rfnya.
3. EVALUASI
1. Kekuatan dari pelarut-pelarut yang berbeda menurut WILLIAMS, pada

karbon aktif dalam kolom untuk asam-asam amino dan sakarid
diturunkan dalam urutan :

a. etil asetat < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < air
murni
b. air murni < dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol < asam
asetat
c. dietil eter < propanol < aseton < etanol < rnetanol
d. aseton < etanol < rnetanol < asam asetat< air murni < dietil eter
e. air murni < dietil eter< rnetanol < asam asetat
2. Jika fasa tetap adalah air, maka fasa gerak yang digunakan
adalah : ...
a. Zat padat.
b. Zat cair organik
c. Zat cair
d. Larutan
e. Gas
3. Zat-zat penyokong yang sering digunakan dalam kromatografi kolom

adalah :...
a. Pasir, pati dan glas woll
b. Gula pasir, pati, dan sliika gel
c. Silika gel, bubuk selulosa dan tanah diatome
d. Pasir, tepung, dan pati
e. Silika gel, tepung dan gula
4. Zat-zat aktif yang digunakan sebagai penyerap dalam kromatografi kolom

adalah merupakan :
a. Reduktor
b. Kopaktor
c. Stabilisator
d. Katalisator
e. Oksidator
5. Silika gel merupakan zat padat yang digunakan sebagai penyerap, dalam
kromatografi kolom yaitu untuk memisahkan : ...

a. Karotenoid, sterol
b. Porphirin, karotenoid
c. Sterol-sterol, asam-asam amino
d. Enzim, protein, sterol
e. Enzim, pitamin dan sterol
6. Suhu optimum untuk aktivasi aluminium biasanya sekitar :...

a. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam.
b. 400°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam
c. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam
d. 600°C dan waktu pemanasan cukup selama 4 jam
e. 200°C dan waktu pemanasan cukup selama 1 jam
7. Salah satu cara untuk pembuatan noda pada kromatografi kertas adalah dengan
menggunakan :...
a. Gelas kapiler dengan diameter yang sama
b. Alat penyuntik dan gelas kapiler dengan diameter yang sama
c. Batang pengaduk dari gelas
d. Sendok atau batang dari kayu
e. Alat berupa kawat.
8. Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam kertas dapat menggunakan harga Rf

(retordation factoryang) yang didefinisikan sebagai :...
a. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh pelarut terhadap jarak yang
digerakkan oleh senyawa.
b. Jarak pelarut dan senyawa sama-sama bergerak ke satu arah
c. Perbandingan antara jarak yang digerakkan oleh senyawa terhadap jarak
yang digerakkan oleh pelarut.
d. Pelarut digerakkan ke arah yang samping dan pembawa digrakkan ke arah
atas.
e. Persentase dari Perbandingan antara pelarut dan pembawa
9. Kertas sebagai fasa diam dibuat dari serat selulosa. Selulosa merupakan polimer dari
gula sederhana, yaitu :...

a. Sukrosa
b. Maltosa
c. Galaktosa
d. Fruktosa
e. Glukosa
10. Perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat

menyebabkan :...
a. Perubahan harga Rf.
b. Harga Rf sama dengan nol
c. Perubahan fasa gerak dan fasa diam
d. Harga Rf tidak terdeteksi
e. Perubahan jarak noda
b. Soal Essay
1. Jelaskan 3 faktor yang menentukan harga Rf pada kromatografi kertas!

2. Jika salah satu komponen dari campuran bergerak 10,8 cm dari garis dasar,
sedangkan pelarut bergerak sejauh 13,6 cm, hitunglah harga Rf untuk komponen
tersebut!
3. Jelaskan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pemisahan dengan kromatografi
kertas!
4. Tuliskan struktur kimia dari selulosa!
5. Mengapa penetesan larutan sampel pada kertas kromatografi tidak boleh terlalu
banyak. Jelaskan!
6. Sebutkan 5 jenis zat penyokong yang sering digunakan dalam kolom partisi!
7. Zat padat Alumina/magnesia yang digunakan sebagai penyerap
digunakan untuk memisahkan :...
8. Jelaskan urutan kekuatan elusi menurut TRAPPE dari deret-deret pelarut
untuk senyawwa-senyawa dengan menggunakan silika gel!
9. Jelaskan teknik elusi yang digunakan dalam kolom partisi!
10. Jelaskan bagaimana cara pembuatan lapisan tipis di atas kaca pada
kromatografi lapis tipis!
11. jelaskan apa yang dimaksud dengan Rx atau Rstd

12. jelaskan faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi
lapisan tipis yang juga dapat mempengaruhi harga Rf !
13. Jelaskan cara-cara yang digunakan dalam pembuatan lapisan tipis!
14. Zat padat kieselguhr adalah sebagai zat penyerap untuk kromatografi lapis tipis
yang digunakan untuk memisahkan :...
C. KEGIATAN PEMBELAJARAN 3. MELAKSANAKAN PEMISAHAN

KROMATOGRAFI
1. LEMBAR INFORMASI
Cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap,
yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa tetap berupa zat padat
maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan (absorption
chromatography), dan jika zaf cair dikenal sebagai kromatografi partisi
(partition chromatography). Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas
maka semua ada empat macam sistem kromatografi. Keempat rnacam sistem
kromatografi tersebut adalah :
1). Fasa gerak zat cair - fasa tetap padat : Komatografi penukar ion.
2). Fasa gerak gas - fasa tetap padat : Kromatografi gas padat
3). Fasa gerak zat cair - fasa tetap zat cair, dikenal sebagai
kromatografi partisi dan kromatografi kertas.

4). Fasa gerak gas - fasa tetap zat cair : Kromatografi gas-air dan
Kromatografi kolom kapiler.
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa -

senyawa yang dipisahkan, sehingga terdistribusi sendiri diantara fasa
gerak dan fasa tetap dalam perbandingan yang sangat berbeda -beda
dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain.
a. Kromatografi Partisi
Perbedaan yang pokok adalah terletak pada sifat dari penyerap, dimana
dalam kromatografi partisi berupa materi yang berpori, seperti
kieselguhr, yang dilapisi dengan lapisan dari zat ca ir sering
menggunakan air. Fasa tetap adalah lapisan zat cair dan zat padat yang
berperan sebagai penyangga/penyokong. Jika fasa -fasa bergerak dan
tetap keduanya berupa zat cair maka akan diperoleh kromatografi zat cair-
cair.
Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak

tergantung pada kelarutannya dalam fasa tetap, yang berupa zat cair
sehingga senyawa-senyawa yang lebih larut akan bergerak lebih lambat
turunnya dalam kolom daripada yang kurang kelarutannya. Selama
bergerak senyawa-senaywa mengalami partisi di antara dua fasa, dan
pemisahan terjadi karena perbedaan dalam koefisien partisi.
Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, dimana lembaran kertas

adalah sebagai pengisi/pengganti dari kolom. Kromatografi campuran dari
senyawa yang dipisahkan membentuk suatu jalur dalam kolom.
b. Teknik-teknik Pemisahan
Untuk memperoleh pemisahan dari jalur-jafur komponen harus
dikerjakan lebih lanjut dengan melakukan satu dari tiga macam cara:
analisa elusi, analisa frontal atau analisa per pindahan gerakan.

I). Analisa elusi
Analisa elusi digunakan secara ekstensif dalam kromatografi partisi.
Dalam elusi aliran dari fasa bergerak (eluting agent) adalah terus
menerus hingga campuran terpisah sempurna menjadi komponen -
komponennya. Harus diperhatikan bahwa fasa bergerak yang dipilih
harus tidak mempunyai efek terhadap fasa tetap atau hanya sangat
lemah diserap olehnya.
Pengaliran pelarut secara terus menerus melalui kolom disebut elusi.

Elusi bisa dilakukan dengan memanfaatkan gaya gravitasi, gaya
kapiler, atau tekanan mekanis. Selama proses elusi berlangsung, spesi
sampel bisa berada didalam fasa gerak (berarti ikut mengalir) atau
berinteraksi dengan fasa diam (berarti tidak bergera k). Tiap molekul
satu jenis spesi akan bergantian masuk dan keluar fasa diam
dengan perbandingan waktu yang sama dan menghasilkan gerakan
kelompok yang sama. Waktu pergerakan spesi adalah waktu yang
dihabiskan oleh spesi ketika molekul spesi bera da dalam fasa gerak.
Karena tiap spesi memiliki perbandingan waktu yang khas untuk
berada dalam fasa gerak (ketika tidak berinteraksi dengan fasa diam),
maka terjadi pemisahan kelompok-kelompok spesi.
Elusi pertama-tama telah digunakan oleh TSWETT tahun 1903 untuk

pemisahan pigmen-pigmen daun, karena adanya warna maka cepat
terlihat lokasinya dalam kolom. Senyawa -senyawa tak berwarna dapat
juga dilihat lokasinya, karena flouresensi dalam sinar ultra -violet. Sekali
pemisahan terjadi pita komponen dapat diambil dengan jalan memotong
dari bagian-bagian yang mengandung berbagai komponen, kemudian
diekstrak dengan pelarut yang sesuai. Cara lain, aliran dari zat
pengelusi dapat diteruskan hingga tiap -tiap komponen tercuci sempurna
dari kolom. Untuk mengetahui tiap-tiap komponen dapat dideteksi
dengan menggunakan pereaksi kimia yang cocok atau test fisika.
Ekor (tailing)yaitu kejadian yang selalu terjadi dalam kromatografi

serapan bila teknik elusi yang digunakan tidak sesuai. Ekor menaikkan

kelebaran dari pita-pita hingga ada tendensi untuk menimbulkan penindihan pita
satu dengan pita lainnya (overlap).
2). Analisa Frontal

Di dalam analisa frontal, larutan campuran ditambahkan terus menerus
hingga kolom jenuh. Larutan yang keluar dari kolom sebelah bawah
diukur terus menerus. Sebagai contoh, campuran yang mengandung
tiga komponen A, B, dan C. Anggaplah bahwa komponen A yang paling
lemah diserap oleh penyerap dalam kolom, sedang komponen C yang
paling kuat diserap dan komponen B lebih kuat daripada A tetapi lebih
lemah diserap daripada C. Bila campuran ditambahkan terus menerus
maka A akan mempunyai tendensi keluar paling dahulu daripada yang
lainnya dan pada tingkat pertama akan diperoleh A yang murni.
Komponen B lebih kuat diserap daripada A dan leb ih lemah daripada C,
hingga ia akan bergerak yang tak akan mendahului A. Pada langkah
kedua akan diperoleh terutama B tetapi tercampur dengan A karena
pemasukan yang terus nienerus dari carnpuran. Sedangkan pada
langkah ketiga akan terdiri atas campuran a sal A + B + C. Dalam cara
ini hanya pada langkah pertama akan diperoleh kornponen yang murni.
Pemisahan secara sempurna tidak dapat diperoleh.
3) Analisa perpindahan gerakan

Analisa perpindahan gerakan mungkin dapat dipandang sebagai hibrida
dari analisa elusi dan frontal, seperti dalam metode elusi, sejumlah kecil
dari campuran diletakan di atas kolom, kemudian larutan senyawa yang
lebih kuat diserap daripada setiap komponen dari campuran
ditambahkan terus menerus dari atas kolom. Senyawa ini dikenal
sebagai pengganti (displacer). Campuran kemudian bergerak ke bawah
pada kecepatan yang sama seperti pengganti yang ditambahkan dan
campuran akan terpisah sendiri menjadi pita -pita dari komponen-
komponen yang murni, urutan dari pita-pita merupakan urutan dari
kekuatan penyerapan pada penyerap. Tiap -tiap pita murni bekerja
sebagai pengganti untuk komponen-komponen yang mendahuluinya dan

pita yang paling akhir merupakan pita yang paling kuat diserap akan
didorong oleh pengganti.
c. Kromatografi padat- gas (Gas S o lid Cr omatogra ph y, G S C).

Kromatografi Gas adalah suatu teknik untuk memisahkan campuran zat yang
mudah menguap dengan cara melewatkan aliran gas pada suatu fasa diam
(stationary phase). Dasar kerja dari GSC adalah adsorbsi (serapan). Dengan
alasan ini maka GSC sangat sukar untuk digunakan secara berulang dengan
hasil yang sama. Hal ini disebabkan oleh kenyataan-kenyataan bahwa :
1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara pembuatannya.
2. Juga aktivitas tergantung pada bagaimana ia diperlakukan setelah
pembuatannya.
Keadaan 1 dan 2 sangat sukar untuk distandarisasi. Hal-hal inilah yang
menyebabkan "Reproducibility" yang rendah dari GSC. Yang sering dijumpai
adalah :
1. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak homogen
dari penyerap.
2. Waktu retensi relatif panjang.
3. Waktu retensi sangat tergantung pada jumlah dari cuplikan.
4. Kernungkinan penyerap.dapat berperan sebagai katalisator yang aktif.
Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk senyawa
yang mempunyai titik didih yang rendah maupun tinggi. Meskipun demikian ada
keuntungan dari GSC bila dibandingkan dengan GLC. Fasa diam tidak dapat
diuapkan, karena tekanan uap dari padatan sangat rendah. Hingga dapat
menggunakan detektor-detektor yang sensitif, karena di sini tidak terjadi
"column bleeding".
Dalam tahun akhir-akhir ini GSC menjadi lebih penting yaitu setelah
diketemukannya penyerap-penyerap yang lebih baik. Contoh-contoh penyerap
adalah :

1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen
(dibandingkan dengan diamond) : ini digunaaan terhadap senyawa-senyawa
polar yang titik didihnya tinggi.
2) “molecular sieves" : ini merupakan zeolit buatan (= Na- atau CaAI-silikat),

dengan pori-pori yang sangat kecil/halus di dalamnya. Ukuran dari diameter
pori dinyatakan dalam A°. Sebagai contoh "Linde", mempuyai ukuran dari 3A°
hingga 13A°. Zeolit sangat stabil, pada suhu hingga 600°C. Molecular sieves
hanya menyerap molekul-molekul yang lebih kecil dari pori-porinya. Air sangat
cepat diserap hingga merupakan pengering yang sangat efisien. Molecular
sieves mempunyai sifat katalisator yaitu dapat merupakan zat dehidrator
(dehydrating agents). Sebagai contoh zeofit dapat mengubah alkohol menjadi
hidrokarbon/gasolin : R-OH → R-H. Sebelum digunakan biasanya molecular
sieves diaktifkan dengan memanaskannya selama 12 jam pada suhu 150°C
sambil dialiri gas H2 yang kering.
Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon

menyerap sangat kuat. CO2 dan prosesnya tidak dapat balik sehingga zeolit
tidak digunakan bila CO2 dipakai sebagai gas pengangkut.
Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer-
polimer yang berpori seperti PORAPAK dan POLYPAK (nama
perdagangannya) juga CHROMOSORB.
Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :
1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH dan
glikol-glikol, dan asam-asam lemak rendah.
2. Juga untuk seperti CO2,N2O,O2 juga yang lainnya.
d. Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :
1. Kecepatan :
a. Gas yang merupakan fasa bergerak sangat cepat mengada kan
kesetimbangan antara fasa bergerak dengan fasa diam.
b. Kecepatan gas yang tinggi dapat juga digunakan.Hingg a waktu
pemisahan sangat cepat (diukur dalam menit).

2. Sederhana :
Alat GLC relatif sangat mudah dioperasikan. Interprestasi langsung
dari data yang diperoleh dapat dikerjakan. Harga dari alat GLC relatif
murah.
3. Sensitif :
GLC sangat sensitif. Alat yang paling sederhana dapat mendeteksi
konsentrasi dalam ukuran 0,01% (= 100 ppm). Alat -alat GLC yang
lebih rumit dapat mendeteksi senyawa yang Konsentrasirrya hanya
beberapa alat yang tertentu sekarang dapat dibuat dengan
kemampuan mendeteksi "parts per billion", hingga dalam jangkauan
pikogram = 10 g. Disebabkan sensitivitas yang tinggi dari GLC maka
hanya memerlukan sejumlah kecil dari cuplikan, biasanya dalam
ukuran mikroliter.
4. Pemisahan : (resolution = performance).
Dengan GLC memungkinkan untuk memisahkan moleku -molekul dari suatu
campuran, dimana hal ini tidak mungkin dipisahkan dengan cara-cara yang
lain.
Misalnya pemisahan metil ester-metil ester dari :
1. Asam stearat dengan ttd 232°C pada tekanan 15 mmHg CH3(CH,)t6
COOH.
2. Asam oleat dengan ttd 229°C pada tekanan 15 mm Hg CH3(CH,)7CH =
CH(CHZ)7COOH:
3. Asam linoleat dengan ttd 237°C pada tekanan I5 mm Hg CHj(CHZ)4 CH
= CH = CHCHZCH = CH (CH,)7COOH.
Senyawa-senyawa tersebut tak mungkin dipisahkan dengan cara distilasi
atau dengan ekstraksi, tetapi sangat mudah dipisahkan dengan GLC, yang
hanya membutuhkan waktu sekitar 23 menit.
5. Analisa dapat digunakan sebagai :

1. Analisa kualitatif yaitu dengan membandingkan waktu retensi.
2. Analisa kuantitatif yaitu dengan penghitungan luas puncak.
3. Alat GLC dapat dipakai dalam waktu yang lama dan berulang-ulang.
a. Prinsip Krimatografi Gas-Cair (GC)

Prinsip kerja kromatografi gas adalah sampel (cuplikan/analit) diinjeksikan ke
dalam kolom dan diuapkan lalu dielusi oleh aliran gas inert (sebagai fasa
gerak). Pada kromatografi gas, fasa gerak tidak berinteraksi dengan molekul-
molekul analit. Fungsi fasa gerak, hanya berfungsi sebagai transpor analit atau
cuplikan untuk bergerak di sepanjang kolom. Proses pemisahan terjadi karena
perbedaan interaksi analit dengan fasa diam.
Aliran gas dari gas pengangkut akan membawa cuplikan yang telah teruapkan
masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen dari
cuplikan. Kemudian komponen-komponen dideteksi oleh detektor, dan sinyal
dalam bentuk puncak akan dihasilkan oleh pencatat.
b. Bagian alat kromatografi gas
Injektor Detektor
(FID/TCD)
GC
Kolom

Oven
Gas
Gambar 1. Skema alat GC
Alat GLC atau GC terbentuk atas 7 bagian yang pokok seperti pada
gambar bagian-bagian alat berikut. Tujuh bagian pokok dari kromatografi
gas seperti pada gambar :
1. Silinder tempat gas pembawa/pengangkut
2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan
3. Tempat injeksi cuplikan
4. Kolom
5. Detector
6. pencatat
7. Terminal untuk 3, 4 dan 5

Injektor Oven Detektor Rekorder
Pemasok kolom
Gas
Gas kromatografi terdiri dari :

 Suatu aliran gas,
 Suatu tempat injeksi,
 Suatu kolom pemisah
 Suatu detektor
Bagian-bagian dari kromatografi gas adalah :

(1) Gas pengangkut
Gas pengangkut (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi.
Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat
besar untuk digunakan secara Iansung.
Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. Harus inert, tidak bereaksi dengart cuplikan, cuplikan-pelarut, dan
material dalam kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas.
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon
dioksida dan hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah
terbakar, tetapi sangat mahal. H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati--
hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang digunakan juga C02.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang
digunakan. Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan
keluaran dan pengukur tekanan. sebelum masuk ke kromatograf, (harusnya)
ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem penapis molekuler untuk
memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasrnya kecepatan alir gas
diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse)
pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatograf. Tekanan gas
masuk ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10 s.d 50
psi (di atas tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25 s.d 150
mL/menit pada kolom terpaket dan 1 s.d 25 mL/menit untuk kolom kapiler.

(2). Pengatur aliran dan pengatur tekanan
Ini disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5
atm, dan mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada
tempat masuk dari kolom diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk ke
dalam kolom. Ini disebabkan, kenyataan lubang akhir dari kolom biasanya
mempunyai tekanan atmosfir biasa. Juga oleh kenyataan bahwa suhu kolom
adalah tetap, yang diatur oleh thermostat, maka aliran gas tetap yang masuk
kolom akan tetap juga.
Demikian juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap
yang disebut waktu penahanan (the retention time), tR. Karenakecepatan
gas tetap, maka komponen juga rncmpunyai volume karakteristik terhadap
gas pengangkut = volume penahanan (the retention volume), vr. Kecepatan
gas akan mempengaruhi effisiensi kolom.
Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki
diameter luar.
1/4" O.D : kecepatan gas 75 ml/min
1/8" O.D : kecepatan gas 25 ml/min.
Kita akan meninjau bagaimana cara untuk mendapatkan harga kecepatan
aliran yang optimum untuk suatu pemisahan tertentu.
HETP
HTEP min
Kecepatan aliran optimum

Kecepatan aliran
ml/min
(3). Tempat injeksi (The injection port)

Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fasa uap. Gas
dan uap dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa
organik berbentuk cairan dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa

yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini mem-
butuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat pada
tempat injeksi seperti pada gambar 2. bagan injektor.
Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu
dari tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini
adalah batiwa suhu tempat injeksi sekitar 50°C lebih tinggi dari titik didih
campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila kita
tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka kita harus mencoba-
coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak-
puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan pertama
terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi,
sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau peruraian dari
senyawa yang akan dianalisa.
Tempat injeksi (injektor):
Pengarah jarum
injektor
Septum
Baut Septum
Purge
Gas
pembawa
Split
Glass insert
Adaptor Kolom
Gambar 2. Bagan injektor GC

Kolom GC
Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui

tempat injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang
sering disebut "a gas tight syringe".
Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu

banyak, karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan
pada waktu kita mengandakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk
cairan seperti pada gambar 3.

Tempat injeksi (injektor):
Syringe
(10 L)
Pengarah jarum
Septum
injektor
Baut Septum
Purge
Gas
pembawa
Split
Untuk Untuk
Cairan gas
Glass insert
Adaptor Kolom
Kolom GC
3. Bagan injektor GC
(4). Kolom
Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom dapat
lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya
bentuk dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan bentuk tabung.
Tabung ini dapat terbuat dari :
tembaga (murah dan mudah diperoleh)
plastik (teflon), dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.
baja (stainless steel), (mahal)
alumunium
gelas
Perhatian : meskipun tembaga agak murah, tetapi tidak selalu dapat
digunakan karena kadang-kadang dapat menimbulkan serapan yang tidak
diinginkan atau dapat bereaksi dengan senyawa-senyawa organik seperti
amina, asetilena, terpen dan stereoid.
Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom rnempunyai

berbagai ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari
kolom gelas yaitu antara 0,3 mm hingga 5 min. kebanyakan kolorn yang
digunakan berupa staninles steel dengan diameter luar (OD) dari I/S atau 1/4
inch (0,3 atau 0,6 cm). Pada GSC kolom diisi dengan penyerap (adsorbent),
sedangkan pada GLC kolom diisi dengan "solid support" (padatan pendukung)
yang diikat oleh fasa diam.

JENS KOLOM (FASA DIAM)
KOLOM KEMAS (PACKED) KOLOM KAPILER (CAPPILARY)
1–5m 15 – 30 m
LAPISAN
ADSORBEN FASA DIAM
(FS DIAM)
Gambar 4. Kolom GC
Pada GC, dikenal dua tipe kolom, yaitu kolom kemas (Packed) dan kolom
kapiler (tabung terbuka/cappilary).
1. Kolom Kemas (Packed)

Kolom kemas terbuat dari bahan gelas atau logam dengan ukuran diameter
dalam (ID, Internal Diameter) 1 s.d 8 mm, dan panjang antara 2 s.d 20 m.
Kolom kemas yang sering dijumpai memiliki nilai perbandingan volume fase
diam per volume fase gerak, VS/VM antara 15 s.d 20 dan terdiri dari 100 s.d
1000 plat teoritis per kaki (foot). Cukup banyak kolom terpaket yang memiliki
jumlah plat teoritis yang lebih tinggi. kolom terpaket yang baik memiliki jumlah
plat teoritis sampai 20.000 plat per kaki (1 foot = 12 inchi = 30,48 cm).
KOLOM KEMAS (PACKED)
 
 
 
 Biasanya 1/8” diameter (3,2 mm O.D, 22 mm I.D),

Panjang 1 – 2 m
 Kecepatan alir maksimum 1 mL/menit atau 8 cm/menit
2. Kolom Kapiler
Kolom kapiler dibagi menjadi 2 tipe dasar yaitu :
a. “Wall Coated Open Tubular – WCOT” : kolom kapiler yang dilapiskan
dengan lapisan tipis fasa diam. Bahan kolom adalah baja nirkarat,
aluminium, tembaga, plastik dan gelas. Kolom WCOT produk tahun

1990 an dibuat dari leburan silika yang disebut juga kolom FSOT – Fused
Silica Open Tubular Column) yang diperkuat dengan lapisan poli-amida di
bagian luarnya, bersifat sangat pleksibel sehingga dapat digulung
dengan diameter beberapa inchi. Kapasitas sampel sangat rendah
(<0,01µL).
b. “Support Coated Open Tubular – SCOT” : Permukaan dalam kapiler
dilapiskan dengan lapisan tipis (~30 µm) fasa pendukung, seperti tanah
diatome, grfit, oksida metal atau silikat. Tipe ini mampu menahan fasa
diam beberapa kali lebih banyak dari tipe WCOT sehingga kapasitas
sampelnya lebih besar. Secara umum efisiensi kolom SCOT lebih kecil
dari kolom WCOT tetapi lebih besar dari kolom terpaket.
KOLOM KAPILER
Fasa Diam Penyangga padat dila Partikel fasa diam
Cair pisi fasa diam cair padat
Dinding kolom
Wall-coated Support-coated Porous-layer

open tubular open tubular open tubular
column column column
(WCOT) (SCOT) (PLOT)
Gambar 5. Jenis kolom kapiler
Kolom kapiler memiliki diameter dalam antara 0,3 – 0,5 mm, di bagian
dalam kolom dilapiskan dengan fasa diam cairan yang sangat tipi (~ 1
µm). Penurunan tekanan di dalam kolom kapiler bisa diabaikan,
sehingga bisa dibuat sangat panjang (lebih dari 100 m). Perbandingan
volume fasa diam VS.volume fasa gerak, VS/ Vm diantara 100-300,
sehingga sangat efisien. kolom kapiler dengan ratusan ribu jumlah pelat
teori juga sudah dibuat. kolom terbuat dari baja nirkarat, gelas, leburan
silika, atau teflon. Supaya bisa dimasukkan ke dalam oven, kolom
digulung dengan diameter gulungan antara 10 – 30 cm.
Isikolom
(a). Padatan pendukung.

Padatan pendukung berfungsi mengikat fasa diam. Kebanyakan zat ini
berupa tanah diatorne yang telah dipanaskan/dikeringkan. Pendukung ini
disebut "diatomite". Diatomite terdiri dari satuan ganggang bersel satu yang
disebut diatom yang pori-porinya sangat kecil. Luas permukaan dari struktur
berpori sekitar 20 m2/g. Luas permukaan yang besar ini d i b u t u h k a n u n t u k
mendistribusikanfasa diam yang bersifat cairan dalam GC.
Persyaratan dari padatan pendukung yang baik :
1. Inert (tidak menyerap cuplikan).
2. Kuat, stabil pada suhu-suhu yang tinggi.
3. Memiliki luas permukaan yang besar : 1 - 20 m2/g.
4. Perrnukaan yang teratur, ukuran yang sama; ukuran pori sekitar l ON
5. Harus mernpunyai tahanan yang rendah terhadap gas pengangkut.
Padatan pendukung yang biasa digunakan adalah kiesel guhr
(forementionned - diatomaceous earth). Nama dalam perdagangan :
 Aluminium
 Diatoport
 Chromosorb.
Padatan pendukung ini terutama terdiri dari Si02 :

91 % - Si02
5 % - Al203
2 % - Fe203
0,5 % - CaO, dan oksida-oksida lainnya
OH OH OH
l l l
struktur : ─ Si ─ O ─ Si ─ O ─ Si ─
polimer silicon-oksigen
Ada beberapa jenis chromosorb :

a. Chromosorb G : luas permukaan yang kecil (0,5 m 2/g), hanya dapat
digunakan untuk mengikat faSa cair dalam jumlah yang sedikit (± So1o),
merupakan materi yang sangat keras; baik untuk pemisahan senyawa-

senyawa yang polar. Ini merupakan padatan pendukung hingga yang
bersifat universal.
b. Chromosorb P : berwarna kemerah-merahan (P = pink), biasanya
digunakan untuk senyawa-senyawa yang apolar, terutama hidrokarbon.
c. Chromosorb W : berwarna putih, agak mudaan digunakan untuk
senyawa-senyawa polar.
Chromosorb-chromosorb yang kotor dapat bereaksi dengan cuplikan; hal ini

akan menyebabkan puncak berekor. Interaksi utama antara padatan
pendukung dengan molekul-molekul cuplikan adalah ikatan hidrogen melalui
gugus-gugus OH dari chromosorb. Untuk mencegah hal ini, chromosorb
harus direaksikan terlebih dahulu hingga ia menjadi kurang aktif.
Pengaruh permukaan penyangga
a. Gusus hidroksil tunggal

- HCl CH3
- Si – OH + (CH3)2 Si Cl2 - Si – O – Si – Cl
Dimetildiklorosilan CH3
(DMCS)
CH3 - HCl CH3
- Si – O - Si - Cl + CH3OH - Si – O – Si – O – CH3
CH3 CH3
b. Gugus hidroksil berdampingan

CH3 CH3
Si
OH OH O O
- Si - O – Si - + (CH3)2 Si Cl2 - Si - O - Si - + 2 HCl
Ukuran dari padatan pendukung yang digunakan adalah :

 Untuk kolom I/8 inch : 100/120 atau 80/I00 mesh
 Untuk kolom 1/4 inch : 60/80 atau 40/60 mesh
100/ 120 mesh - 0,15 - 0,13 mm; 80/ 100 mesh ti 0,18 - 0,15 mm
60/80 mesh ti 0,25 - 0,18 mm; 40/60 mesh - 0,40 - 0,25 mm.
(b). F a s a d i a m

Dalam GC fasa diam berupa cairan. Pada fasa cairan inilah
pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi. Dasar kerja
adalah Partisi antara fasa cairan dan fasa bergerak ( = gas). Seperti
telah dibicarakan di muka bahwa proses GC adalah mirip dengan
proses ekstraksi. Dalam GC fasa diam disebut juga fasa cair atau
mudahnya pelarut/solvent.
Persyaratan untuk fasa cair yang baik adalah sebagai berikut :

1. Cuplikan-cuplikan harus menunjukkan koefisien distribusi yang
berbeda.
2. Cuplikan-cuplikan harus mempunyai kelarutan yang tertentu
dalam pelarut (= fasa cair).
3. Fasa cair harus mempunyai tekanan uap yang sanga t rendah
pada suhu-suhu yang tinggi : 0,01 - 0., 1 mm Hg.
4. Secara kimia ia harus stabil dan inert.
5. Harus mempunyai kekentalan yang rendah, sehingga tidak
mengikat gas.
6. Harus dengan baik tersebar dan mengikat pada padatan pen -
dukung.
7. Harus larut dengan baik pada pelarut organik yang mempunyai
titik didih rendah. Ini penting dalam pembuatan kolom.
Meskipun banyak pcrsyaratan, namun dcmikian cukup banyak pelarut-

pelarut organik yang dapat digunakan. Kenyataan, ketepatan dan
sefektivitas dari GLC/GC tergantung pada pemilihan dari pelarut-
pelarut yang tersedia. Biasanya persentase dari fasa cair pada
padatan pencfukunL adalah I0% dari berat.
1). Senyawa (dari cuplikan) terpisah berdasarkan atas kelarut an
mereka (= afinitas) dalam fasa cair.
2). Padatan pendukung harus memiliki luas permukaan yang besar
untuk mengikat fasa cair.
Sehingga padatan pendukung mengikat fasa cair yang ditempatkan dalam
kolom. Bila hal ini tidak terjadi maka fasa cair akan terlepas oleh tekanan gas.

(5) Detector
Puluhan jenis detektor sudah dikembangkaan dan digunakan untuk GC.
Karakteristik detektor ideal untuk GC adalah :
1. Cukup sensitif
2. Sifat ksetabilan dan sifat pengulangan (reproducibilility) yang baik
3. Tanggap linier terhadap kuantitas analit.
4. Rentang temperatur dari temperatur ruang s.d 400°C.
5. Waktu tanggap yang pendek.
6. Kehandalan yang tinggi.
7. Mudah digunakan.
8. Tidak merusak sampel.
Detektor yang paling banyak digunakan adalah :

a. Detektor ionisasi Nyala (FID, Flame Ionization Detektor)
Prinsip kerja FID adalah sebagai berikut :
1. Effluen dari kolom dicampur dengan gas hidrogen dan udara, kemudian
dinyalakan dengan api listrik.
2. Komponen organik dari sampel yang masuk ke nyala akan mengalami
pirolisis, menghasilkan ion-ion dan elektron yang akan memberikan sifat
hantaran listrik pada nyala.
3. Ratusan volt tegangan listrik dc dipasangkan diantara ujung pembakar
dengan elektroda kolektor yang ditempatkan di atas nyala.
4. Arus listrik yang dihasilkan (dalam pA ~ 1012 Ampere) dimasukkan ke
sebuah penguat operasional berimpedansi tinggi.
FID
Flame Ionization Detector (Detektor Pengionan Nyala)
Penutup tower
Probe sinyal
Silinder pengumpull
+
Ujung nyala
-
Probe penyulut
Gas H 2 + udara
(300-400 mL/menit)
Gambar 8. Bagan FID Gas pembawa

b. Detektor konduktivitas Thermal (TCD, Thermal Conductivity Detector)
TCD disebut juga Katharometer. TCD adalah detektor yang bekerjanya
berdasarkan perubahan sifat hantaran panas eluen dalam keadaan murni
dan dalam keadaan tercampur spesi lain seperti analit. Elemen pengindera
TCD adalah kawat halus yang dibuat dari Pt, Au, W atau termistor semi
konduktor yang dipanaskan secara listrik. Perubahan sifat hantaran panas
gas akan menyebabkan perubahan efektivitas pemindahan energi panas
dari kawat halus ke gas sehingga temperatur kawat halus menjadi berubah.
Perubahan temperatur kawat halus akan mengubah nilai resistansi kawat
halus.
TCD
Thermal Conductivity Detector (Daya hantar panas)
Sambungan ke sumber
Tenaga listrik dan rangkaian
Aliran gas
Aliran gas
Filamen
Gambar 7a. Bagan TCD
c. Detektor Penangkap Elektron (ECD, Electron Capture Detector)

ECD bekerja seperti penghitung proporsional pada pengukuran
radiasi sinar-x. Eluen dari kolom dilewatkan melalui pemancar sinar-β
(seperti nikel-63 atau tritium yang diabsorb ke permukaan platina atau
titanium). ECD memiliki respons selektif dan sangat peka terhadap
gugus fungsional yang bersifat elektronegatif seperti halogen,
peroksida, kuinon, dan gugus nitro. ECD tidak sensitif terhadap gugus
amina, alkohol dan hidrokarbon. ECD digunakan untuk analisis
insektisida yang mengandung klor dan ECD tidak merusak sampel.
Keuntungan ECD :
 Mempunyai limit deteksi cukup rendah = 10-15 g/s untuk berbagai
senyawa terhalogenasi (PCB, DDT dll.)

 Rentang dinamiknya 104
Kelemahan ECD :
 Menggunakan sumber radioaktif Ni-63
 Mudah terkontaminasi oleh O2, H2O, overload sampel
 Perlu pemeliaharaan tinggi
 Mempunyai variabilitas tinggi respon terhadap zat terhalogenasi
.
 Dapat menyebabkan sakit kepala bila digunakan untuk
mendeteksi CH2Cl2 dengan adanya CCl4.
ECD
Flame Ionization Detector (Detektor Pengionan Neale)
+
-
Arah keluar
Sumber
Radioaktif Ni-63
Gas pembawa
Gambar 9. Bagan ECD
d. Detektor Thermionik (TID, Thermionic Detector)

TID bersifat selektif untuk senyawa organik yang mengandung fosfor
dan nitrogen. respon terhadap P, 10 kali respon terhadap N, 10.000
s.d 1.000.000 kali respons terhadap atom C, dan 500 kali respons P
oleh FID. TID digunakan untuk pestisida yang mengandung P.
e. Detektor Emisi Atomik, (AED, Atomic Emission Detector)

AED adalah detektor GC mutakhir yang ada di pasar komersial.
Detektor ini bekerja berdasarkan emisi atomik. Eluen dimasukkan ke
dalam plasma He yang mendapatkan energinya dari gelombang mikro
yang digabungkan dengan sebuah spektrometer emisi optik “diode
array”.
(6) Rekorder atau Sistem Data

Sinyal analitik yang dihasilkan detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik
agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem data. Sebuah rekorder bekerja
dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. di atas kertas
tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor
sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran
penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah sebuah kromatogram
berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi sampel dan jenis
detektor yang digunakan.
Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang

dihubungkan dengan sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung
jumlah muatan atau jumlah energi listrik yang dihasilkan oleh detektor.
Elektrometer akan melengkapi pik-pik kromatogram dengan data luas pik
atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.
Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan
elektrometer dengan melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke
sebuah unit pengolah pusat (CPU, Central Procesing Unit).
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC) adalah suatu metode kromatografi

mampu memisahkan campuran makromolekul, senyawa ionik, produk alam yang
senyawa polimerik dan kelompok polifungsional yang memiliki berat molekul tinggi de
cara penyarian berfraksi, penyerapan atau penukaran ion.
Ditinjau dari sistem peralatannya KCKT termasuk kromatografi kolom karena fasa
diamnya diisikan atau terpacking dalam kolom. Dan bila ditinjau dari proses
pemisahannya KCKT digolongkan dalam kromatografi adsorpsi atau kromatografi
partisi. KCKT/HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini
menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang
sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.
Pemisahan secara kromatografi dalam KCKT adalah hasil interaksi spesifik anatara
molekul sampel dengan fasa diam atau fasa gerak.
KTKC juga merupakan teknik kromatofrafi yang paling banyak digunakan, dengan
keunggulan-keunggulan:

1. Sensitif dan mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif,
2. Cocok untuk pemisahan spesi yang mudah menguap dan spesi yang mudah
rusak oleh panas,
3. Bisa dugunakan untuk indrsti, bebagai bidang sains dan keperluan publik seperti
untuk analisis asam-asam amino, protein, asam-asam nukleat, hidrokarbon,
karbohidrat, obat-obatan, terpenoid, pestisida, antibiotik, steroid, spesi metal
organik, dan berbagai senyawaan norganik.
KCKT menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa cairan atau padatan,
dan bisa dilbagi menjadi menggunakan fasa gerak cairan, fasa diam bisa berupa
cairan atau padatan, dan bisa dilbagi menjadi 4 (empat) tipe utama yaitu:
1. Kromatografi Partisi (Luntuk solut senyawa polar tetapi bukan ionik berukuran
kecil)
2. Kromatografi Adsorpsi atau Kromatografi Padar-cairan (untuk pemisahan spesi
non-polar, isomer struktur,dan klasifikasi senyawa seperti pemisahan hidrokarbon
alifatik dari alkohol alifatik)
3. Kromatografi Ion (untuk spesi ionik ber-Mr rendah)
4. Kromatografi Eklusi-ukuran atau Kromatofrafi Gel (untuk solut dengan Mr > 1000)
yang bisa dipisahkan lagi menjadi filtrasi gel dan permiasi gel.
Teknik pemisahan dalam KCKT berdasarkan fasa diam dan fasa geraknya :
1. Kromatografi Partisi
Komponen sampel (linarut) dibagi antara fasa gerak cair dengan cairan yang tidak
bercampur yang dilapiskan pada suatu partikel padat sebagai fasa diam. Fasa diam
dapat berupa cairan yang disalutkan pada partikel penyangga. Komponen sampel
yang terikat lebih banyak di fasa diam akan tertahan lama dalam kolom. Bila fasa
diam lebih polar daripada fasa gerak maka disebut fasa normal (Normal phase). Dan
bila fasa gerak lebih polar daripada fasa diam maka disebut fasa terbalik (Reverse
phase).
2. Kromatografi Adsorpsi
Fasa diam yang digunakan pada umumnya adalah bahan alam polar seperti partikel
silika atau alumina hidrat. Fasa gerak dan komponen sampel (linarut) berkompetisi

terhadap lokasi aktif adsorpsi pada partikel fasa diam. Komponen yang terikat lebih
kuat akan bertahan lebih lama dalam kolom. Waktu retensi bergantung pada
kepolaran sampel. Retensi ini dapat diatur dengan mengatur kepolaran fasa gerak
(eluen).
3. Kromatografi Penukar Ion

Prinsip kerja berdasarkan partisi ion antara fasa gerak dan fasa diam pada lokasi
penukaran. Lokasi ion ini biasanya dimobilisasi pada butiran kecil suatu resin yang
dibentuk melalui polimer silang. Kation diipisahkan dalam resin penukar kation yang
mengandung gugus fungsi yang bermuatan negatif seperti -SO3- dan –COO-,
sedangkan anion dipisahkan dalam resin penukar anion yang bermuatan positif
seperti –CH2N+(CH3)3, suatu ion amonium kuartener. Pemisahan terjadi akibat
partisi ion dalam derajat yang berbeda-beda.
a. Pelaksanaan HPLC
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi
kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung
melalui tekanan tinggi sampai dengan 400m. Ini membuatnya lebih ceHPLC
memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material
terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih
besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini
memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam
campuran. Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom
mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode
ini sangat otomatis dan sangat peka.
b. Beberapa efek utama pada KCKT

Efek Ukuran Partikel Paket. Koefisien trasfer massa, CM merupakan fungsi dari
kuadrat diameter partikel yang membentuk paket. Karena itu, efisiensi kolom
meningkat sangat nyata jika ukutan pertikel diperkecil.
Pelebaran zona Ekstra Kolom. Pada kromatografi cair, pelebaran zona yang
signifikan sering terjadi diluar paket kolom. Pelebaran zona ini disebut pelebaran
zona ekstra kolom, dan terjadi ketika fasa gerak membawa sampel pada daerah yang

tidak ada fasa diam seperti pada sistem injeksi, daerah detektor, dan sistem
sambungan perpipaan. Akibatnya bagian tengan pita solute bergerak lebih cepat dari
daerah pinggiran. Padakromatografi gas, pelebaranzona ekstra kolom menjadi
kurang significan karena tertutupi oleh pelebaran zona karena difusi. Pada
kromatografi cairan, pelebaran zona kerena difusi relatilf lebih lambat sehingga bisa
diabaikan.
Efek Jumlah Sampel pada tinggi Plat. HETP (dalam mm) akan naik jika ug sample/g
paking meningkat. Peningkatan semakin nyata jika faktor kapasitas solut meningkat.
Peningkatan HETP pada kromatografi partisi relatif lebih besar dari kromatografi fasa
terbalik. Perhatikan bahwa peningkatan HETP berarti penurunan jumlah plat atau
plenurunan efisiensi kolom.
c. Instrumentasi HPLC/KCKT
Instrumentasi KCKT, secara umum, dapat disimak pada skema/diagram alir
KCKT/HPLC. Perhatikan bahwa instrumentasi itu terdiri dari :
 Penampung Fasa Gerak dan Sistem Penangan Solven,
 Setem Pemompaan,
 Sistem Injeksi Sample,
 Kolom,
 Detektor
Bahan dasar peralatan kromatografi umumnya terbuat dari bahan stainless steel
yang tahan terhadap korosi asam, basa dan pelarut organik. Bahan lain yang sering
digunakan adalah polytetrafluoroethylene (PTFE), gelas dan beberapa jenis plastik.
Skema/diagram alir HPLC :

a. Skema peralatan HPLC

b. Diagram alir HPLC
d. Penampung fasa Gerak dan Sistem Penanganan Solven

Penampung fasa gerak terbuat dari gelas atau baja nirkarat dengan volume 500ml
atau lebih. Penampung fasa gerak dilengkapi dengan alat pembuang gas (terutama
udara) terlarut. Sistem pembuangan gas bisa menggunakan teknik vakum, distilasi,
pemanasan dan plengadukan,l atau pengusiran gas terlarut menggunakan aliran

gas lain ylang memiliki kelarutan sangat rendah. Silstem ini juga dilengkapi dengan
sistem filter untuk menyaring debu dan partikulat lain dari dalam solven. Teknik
praktis untuk membuang ga dan partikulat adalah dengan cara menyarilng solven
melalluail sarinagn milipore dan tekni vakum.
Pemisahan yang dilakukan dengan satu jenis solven dengan campuran yang tetap
disebut elusi isokratik. Seringkali efisiensi pemisahan bisa ditingkatkan dengan
penggunaan 2 atau lebih solven dengan plerbedaan sifat kepolaran yuang signifikan
secara bertahap. Teknik ini desebut elusi gradien. Percampuran dua solven atau
lebih pada teknik gradien bisa dilakukan dengan perubahan linier atau secara
eksponensial terhadap waktu.
e. Sistem Pemompaan
Pompa berfungsi untuk mendorong fasa gerak dan sampel masuk ke dalam kolom.
Tekanan pompa yang diperlukan untuk memompa fasa gerak harus cukup tinggi
karena ukuran fasa diam di dalam kolom sangat kecil.
Syarat pompa :
 Dapat memompakan fasa gerak secara konstan
 Dapat memberikan tekanan cukup tinggi
 Memberikan fluktiasi tekanan seminimal mungkin
 Memberikan noise yang rendah
 Cara kerja sederhana
 Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yang digunakan
Sistem pemompaan solven pada KCKT memerlukan syarat-syarat sebagai

berikut :
 Tekanan harus bisa mencapai 6000 psi
 Keluaran harus bebas pulsa
 Keceplatan alir antara 0,1 s.d. 10ml per menit
 Pengulangan pengaturan kecepatan alliran tidak berbeda lebih dari0,5%
 Terbuat dari bahan tahan korosi

Ada tiga tipe pompa KCKT; pompa balas (reciprocating pumps), pompa pemindah
(displacement pumps), dan pompa pneumatic pumps).
1. Pompa balas (reciprocating pumps) adalah pompa KCKT yang paling banyak
digunkan. Pompa lini memiliki ruangan kecil erisi soven yang dipompakan
dengan gerakan maju-mundur sebuah piston yang digerakkan oleh motor listrik.
Aliran diatur oleh dua buah katup bola yang bergantian membuka dan menutup.
Piston bisa kontak langsung dengan solben atau melaluli sebuah diafragma yang
menerukan tekanan piston ke solven.
Kelemahan pompa balas ini adalah aliran yang dihasikan masih berpulsa,
sehingga harus diredam menggunakan teknik pengoperasian dua buah pompa
secara paralel (tetapi berbeda fasa, maksudnya ketika pompa yang satu
memompa pompa yang lain berpindah ke posisi siap memompa) dengan
pengaturan kecepatan tertentu.
Keunggulan teknik ini adalah volume internal pompa yang relatif rendah (35 –
400 uL), tekanan kelua yang tinggi (sampai 10.000 psi), mudah diadaptasi untuk
elusi gradien, dan kecepatan aliran yang tetap (tidak dipengaruhi oleh tekanan
balik dan kekentalan solven).
2. Pompa pemindah (displacement Pumpls) biasanya terdiri dari sebuah ruanan

berukuran relatif besar dengan bentuk seperti syringe dan berisi solven. Sebuah
selinder plencelup (plunger) yang diaktifkan oleh mekanime pemutar skrup yang
digerakkan oleh motor langkah (Lstepper motor), dimasukkan ke dalam ruang
solven. Akibatnya akan ada bagian solven yang didorong (dipompa) keluar.
Pompa ini juga menghasilkan aliran llyang tidak dipengaruhi oleh viskosits dan
tekanan balik, namun keluarnya bebas pulsa.
Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas solven (~250 mL) yang
ditentukan oleh ukuran selinder plencellupl dan penggantian solven yang relatif
sulit ( karena solven lama harus dikosongkan dan dibersihkan dari dalam
poompa dan solven baru dilmasukkan ke dalam pompa.

3. Pompa pneuematik (pneumatic pump) palling sederhana, fasa gerak
dimasukkan ke dalam wadah elastik dan dimasukkan lagi ke dalam wadah
yang bisa ditekan menggunakan gas. Tekanan gas akan menekan wadah
elastik dan sehingga solven yang ada didalamnya akan dipompa keluar. Pompa
jenis ini menghasilakann aliran bebas pulsa dan berharga murah.
Kelemahannya adalah keterbatasan kapasitas dan tekanan keluaran dan
ketergantungan plada viskositas dan tekanan balik yang dihasilkan kolom.
Umumnya sistem pompa pada KCKT dilengkapi dengan pengaturan aliran dan
sistem pemrograman terkomputerisasi. Beberapa instrumen memiliki fungsi
pencampuran solven secara berkesinambungan atau secara bertingkat sehingga bisa
memvariasikan. Pada gambar ini pencampuran eluen dilakukan oleh katup pengatur.
Pada sistem yang lain tiap solven dialirkan menggunakan satu sistem pompa. Sistem
elusi seperti ini disebut dengan sistem gradien.
f. Injeksi sampel
Sampel yang diinjeksikan ke kolom KCKT hanya dianta 0,x – 500 uL, dsan harus
diinjeksikan tanpa menurunkan tekanan kolom. Kondisi ini menyulitkan penginjeksian
dalam jumlah tetap, jika dilakukan secara manual. Cara menginjeksikan sampel yang
paling banyak digunakan adalah menggunakan sistem simpul (sampling loops).
 Perhatikan bahwa sampel diinjeksikan pada tekanan normal dalam jumlah

berlebih. Sebagian sampel akan keluar melalui ‘vent’ dan sebagian lagi tersisa di
awal simpul.
 Ketika simpul disambungkan ke sistem aliran fasa gerak, tekanan sampel
langsung berubah dan jumlah sampel yang masuk ke dalam sistem adalah
volume simpul ylang tersambung ke sistem aliran.
 Sistem simpul yang umum dijumpai memungkilnkan injeksi dalam jumlah 5 – 500
uL, tekanan mencapai 700 psi, dengan kesalahan relatif dalam permil. Sistem
simpul injeksi sampel mikro memungkilnkan injeksi samplel sebanyak 0,5 – 5 uL.
 Ingat bahwa pernyataan ini berdasarkan buku ajar tahun 1992. Dalam 10 tahun
terakhir peningkatan teknologi sudah memungkilnkan sintem ilnjeksi yang jauh

lebih baik.
g. Kolom dan pelarut

Kolom KCKT umumnya dibuat dari pipa baja nirkarat namun ada juga yg terbuat
dari pipa kaca berdinding tebal. Kolom kaca memiliki kemampuan tekanan
maksimum 600 psi. Panjang kolom umumnya antara 10 – 30 cm dan berbentuk
lurus. Jika diperlukan kolom yang lebih panjang, beberapa kolom bisa disambung
secara serial. Diameter dalam kolom umumnlya antara 4 – 10 mm, dengan ukuran
partikel 3,5 dan 10 um. Kolom KCKT yang paling banyak digunakan adalah panjang
25 cm, diameter 4,6 mm, dengan ukuran partikel 5 um. Kolom ini memiliki 40.000
s.d. 60.000 plat per meter.
 Sudah diproduksi kolom kinerja tinggi dan kecepatan tinggi dengan ukuran lebih
kecil. Kolom jenis ini bisa memiliki samplai 100.000 plat per meter dan
menggunakan eluen dalam jumlah jauh lebih sedikit. Sebellum kolom analitik, sering
dipasangkan kolom penjaga (quard colomn) berukuran kecil yang berflungsil
sebagai pemisah partikulat dan kontaminan dari solven. Kolom lpenjaga juga
berflungsi sebagai penjenuh fasa gerak dengan fasa diam. K omposisi fasa diam di
dalam kolom penjaga harus sama dengan komposisi fasa diam di dalam kolom
analitik.
 Partikel berpori dengan diameter sangat homogen ( ukuran plartikel di antara 3 –

10 um). Partikel berpori ini kerapkali dilapiskan dengan lapisan tipis senyawan
organik yang terikat (secara fisik atau kimik) ke permukaan butiran.
Ada dua perbedaan fase dalam KCKT, yang mana tergantung pada polaritas relatif
dari pelarut dan fase diam.
1. Fase normal KCKT. Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda
baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut
sebagai fase normal, hal ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari KCKT.
Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar
misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm

(dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
 Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom diperlukan. Namun

kromatogram yang berkualitas lebih baik seringkali memerlukan pengaturan
templertur. Karena itu ada KCKT yang dilengkapi dengan oven thermostat dengan
templeratur yang bisa mencapi 1500C. Pemanasan di bawah temperatur didih air
bisa dilakkukan dengan mengglulnakan mantel air yuang dialirkan dari plamanas
thermostat.
 Pengepakan kolom KCKT dapat dibagi menjadi dua tipe yaitu pellicular dan
partikel berpori.
 Tipe Pellicular berupa resin penukar ion, silika atau alumina yang diendapkan
membentuk lapisan berpori di atas butiran-butiran polimer atau gelas yang tidak
berpori yang berbentuk sferis. Fase diam berikutnya (cairan) bisa diikatkan pada
lapisan pertama.
 Tipe partikel berplori terdiri dari silika, alumina atau resin berbentuk akan melekat
lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
2. Fase balik KCKT. Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi
menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai
contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol.
Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak
akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika
(fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-
molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak
bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan
cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya
dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut
dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana

halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau
metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan
waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa
molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase
balikKCKT adalah bentuk yang biasa digunakan dalam KCKT.
h. Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum
dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang
berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan
bergantung pada :
 Tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
 Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada
ukuran partikel)
 Komposisi yang tepat dari pelarut
 Temperatur pada kolom
i. Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan
ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa
panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar
melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan
mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang
melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang
digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnyaTetapi berbeda,
senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda
dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah
205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran
metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang
lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Berbeda dengan GC, KCKT tidak memiliki detektor yang bersifat umum dengan
kehandalan tinggi seperti FID dan TCD. Karakteristik detektor ideal untuk KCKT sama
dengan karakteristik untuk detektor ideal GC, kecuali rentang temperatur tidak perlu
terlalu lebar, tetaplli detektor KCKT harus memiliki volume internal yang rendah (untuk
mengurangi pelebaran zona).
Detektor KCKT dapat dikelompokkan ke dalam dua tipe yaitu:

1. Detektor yang berdasarkan sifat curah fasa gerak seperti fasa gerak, indeks refraksi,
konstanta dielektrik dan kerapatan,
2. Detektor yang berdasarkan sifat solute seperti serapan ultraviolet, pendaran, atau
arus diffusi, yang tidak dimiliki oleh fasa gerak.
j. Jenis-jenis Detektor pada KCKT

1. Detektor serapan
Detektor serapan yang banyak digunakan adalah sel dilalui aliran (flow through)
berbentuk Z untuk mengukur serapan eluen yang keluar dari kolom.Untuk menekan
pelebaran zona, volume sel dibatasi hanya antara 1 – 10 uL dengan panjang jalur
serapan 2 s.d 10 mm. Sel seperti memiliki batas tahan tekanan sebesar 600 psi.
Cukup banyak yang berkas ganda, baik yang dilengkapi dengan pencacah
(chopper) atau dengan filter. Instrumen berkas tunggal biasanya memiliki sistem
pengingat terkomputerisasi.
Detektor serapan paling sederhana adalah detektor serapan UV dengan filter.

Sumber UV berasal dari sebuah lampu Hg dengan intensitas sinar terbanyak pada
254 nm yang diisolasi menggunakan filter. Garis spektra pada 250, 313, 334 dan

365 nm, juga sering digunakan dengan cara mengganti filter.
Kebanyakan KCKT menggunakan detektor serapan UV yang dilengkapi

moonokromator dengan kemampuan pemindaian (scanning). Bahkan banyak yang
dilengkapi dengan cahaya tampak. Deketror jenis ini bisa diatur dengan beberapa
model seperti keseluruhan kromatografi dibuat berdasarkan panjang gelombang
tertentu, atau tiap kemunculan suatu pik panjang gelombang yang digunkan
disesuaikan dengan sifat pik bersangkutan. Lamdha yang sesuai dapat dicari
dengan cara pemindaian pik bersangkutan pada suatu analisis pendahuluan. Untuk
keperluan ini peralatan bisa diprogram melalui perangkat lunak komputer.
Detektor sinar yang paling kuat untuk KCKT adalah diode array yaitu sekumpulan
(bisa mencapai 1024 buah) fotodiode yang disusun membentuk barisan yang
menangkap spektrum sekaligus untuk semua panjang gelombang.
Detektor serapan infra merah juga banyak yang dibuat secara komersial. Teknik
yang diterapkan, mulai dari penggunaan filter, sampai ke sistem transformasi
fourier.
2. Detektor pendar
Pada deketor pendar, sinar pendaran diukur menggunakan detektor fotoelektrik
yang ditempakan pada posisi 900 terhadap sinar pengeksitasi. Detektor pendar
paling sederhana menggunakan sumber sinar pengeksitasi dari lampu Hg yang
dilengkpi filter. Instrumen yang lebih baik menggunakan sumber lampu xeon dan
monokromator kisi difraksi. Detektor pendar modern menggunkan sinar pengeksitasi
dari sumber laser yang bisa diatur.
3. Detektor indeks refraksi

Detektor indek refraksi dapat digunakan hampir untuk semua solute, sehingga
menjadi detektor universal seperti halnya FID pada GC. Detekor ini tidak
dipengaruhi oleh kecepatan alir sehingga hasil ukuran dapat dipercaya. Sayangnya
detektor ini tidak sensitif seperti detektor lainnya, tetapi peka terhadap perubahan
temperatur sehingga harus distabilkan pada tingkat ketelitian sampai beberapa
perseribu (0,00x) 0C.

4. Detektor
Pada detektor ini, efluen dari kolom dimasukkan ke dalam nebuliser dan diubah
menjadi kabut halus oleh aliran gas nitrogen atau uadara. Kabut halus dialirkan ke
tabung yang bertemperatur terkontrol untuk menguapkan fasa gerak sehingga
dihasilkan uap analit. Partikel uap analit kemudian dialirkan melalui jalur sinar laser.
Radiasi hamburan diukur plada sudut tegak lurus menggunakan fotodiode. Detektor
ini baru dikembangkan dan diharapkan bisa menjadi detektor umum untuk KCKT
(seperti FID pada DC).
5. Detektor elektrokimia
Kelompok detekor ini berdasarkan empat metode elektroanalitik yaitu amperometri,
voltametri, kulometri dan konduktometri. Detektor berdasarkan potosiometri kurang
praktis untuk keperluan KCKT karena elektrode potensiometer memerlukan waktu
adaptasi yang relatif lama.
6. Detektor spektrometrik massa

Efluen dari KCKT tidak dimasukkan langsung ke dalam spektrometer massa karena
volume fasa gerak relatif sangat besar jika dibanddingkan dengan analit, melainkan
melalui suatu antarmuka. Pada salah satru antar muka, aliran eluen dari kolom
dipecah, dan hanya sebagian kecil saja yang diinjeksikan ke dalam spektrometer
massa. Pada antar muka yang lain, efluen dari kolom dibawa ke ruang penguapan
menggunakan sitem ban berjalan. Setelah solven diupkan, analit dimasukkan ke
dalam ruang pengion dan diionkan dengan teknik desorpsi medan.
7. Detektor spektrometerik massa

Detektor spektrometerik massa secara mutlak memerlukan sistem terkomputerisasi
untuk menyimpan dan mengolah data serta untuk mengontrol sistem kerja
antarmuka dan sepektrometer massa.
k. Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing
puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap

sinar UV. Sepanjang mengontrol kondisi kolom, dapat menggunakan waktu retensi
untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya sudah
mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang
sama. Mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan dapat menggunakan
puncak.
Contoh :
 Senyawa tertentu, X, jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung
senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak
hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga
dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa
yang dihasilkan.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui
detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.
Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat
sederhana).
 Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun
waktu retensi akan sama. Misalnya gambar yang dihasilkan :
Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan

untuk mengetahui berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam
jumlah kecil. Meskipun demikian, harus berhati-hati.
 Jika anda mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan
Y), dapatkah anda mengatakan jumlah relatifnya? Anda tidak dapat mengatakannya
jika anda menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area
dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari
X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang
gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar
Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan
puncak yang kecil.
2. LEMBAR KERJA
3. EVALUASI
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan waktu retensi. dan bagaimanan
cara pengukurannya terhadap sampel yang dianalisis dengan KCKT!
2. Jelaskan perbedaan dua fase dalam KCKT, sehingga tergantung pada
polaritas relatif dari pelarut dan fase diam!
3. Jelaskan fungsi dan syara-syarat pompa pada KCKT!
4. Apa yang dimaksud dengan Pompa balas (reciprocating pumps) dan
jelaskan kelemahan dan keunggulannya!
5. Sebutkan 5 jenis ditektor KCKT
D. KEGIATAN PEMBELAJARAN 4. MELAKSANAKAN PENGUKURAN

ANALISIS
1. LEMBAR INFORMASI
a. Analisa Kualitatif pada GLC

Tujuan dari analisa kualitatif pada GLC adalah i d e n t i f i k a s i dari suatu
komponen atau lebih dari suatu cuplikan. Hal ini terutama dilakukan dengan
membandingkan dengan senyawa-senyawa referensi standard. Pada
dasarnya kita dapat menyatakan satu hal secara absolut dalam analisa
kualitatif dalam GLC.
Dua senyawa tidak sama jika mereka mempunyai karakteristik GLC berbeda.
Jika suatu senyawa yang tak/belum diketahui adalah kemungkinan senyawa A,
dan kemudian meninjeksikan senyawa murni A sebagai senyawa referensi,
makam akan mendapatkan dua kemungkinan :
1. Data GLC, kebanyakan menggunakan retensi, adalah tidak sama, maka

kesimpulannya : senyawa-senyawa tersebut tidak sama.
2. Data GLC adalah sama : kedua senyawa mungkin mirip/sama, tetapi
dapat berbeda sungguh-suugguh. Sehingga keduanya tidak sama.
Jika kita ingin menguji dengan GLC bahwa dua senyawa adalah sama, maka
kita memerlukan :
a. Melakukan analisa dua kali pada dua kolom yang berbeda.

b. Dua analisa yang lain pada dua suhu yang bcrbeda.
Juga perlu untuk suatu teknik yang disebut " S p i k i n g " di mana Jika kemudian
ternyata bahwa waktu retensinya sama, maka kita dapat mengatakan bahwa
dua senyawa adalah sama. Pada dasarnya pekerjaan ini kita menambahkan
cuplikan standard. Pada dasarnya kita dapat membandingkan waktu retensi.
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan untuk mengelusikan senyawa
setelah diinjeksikan. Waktu retensi dari suatu senyawa dapat diulang dengan
hasil yang sama. Tetapi tidak terkoreksi jarang digunakan, karena tergantung
pada :
1) Panjang dan diameter kolom

2) fasa cair (jenis clan jumlah)
3) suhu kolom
4) kecepatan aliran
5) jenis dari gas pengangkut
6) "dead volume" dari peralatan.

Waktu retensi yang diatur hanya untuk pengaturan "the instrument's dead
volume". Hal inipun juga jarang digunakan untuk identifikasi.
Cara yang paling baik adalah menggunakan waktu retensi relatif. Waktu
retensi ini relatif terhadap suatu senyawa standar. Yang lebih baik digunakan
adalah waktu retensi relatif yang terkoreksi (diukur dari puncak udara) :
t’
A
tA
t’X
tX
injeks
A= X=
Senyawa standar
tX Tak diketahui
hingga waktu retensi relative = 
t’X
waktu relative terkoreksi (adjusted) = 
Waktu retensi relatif (adjusted) hanya tergantung pada :
1) suhu kolom ,
2) jenis dari fasa diam.
b. Analisa Kuantitatif dalam GLC

Analisa kuantitatif dalam GLC berarti menentukan jumlah (%) dari
komponen-komponen yang terpisah dari suatu cuplikan. Hal ini didasarkan
pada suatu kenyataan bahwa pencatat menghasilkan sinyal atau puncak
yang sebanding dengan suatu sifat dari molekul-molekul cuplikan. Pada
katharometer yaitu tahanan panas, dalam detektor ionisasi nyala yaitu

ionisasi, dan dalam EC yaitu penangkapan elektron-elektron oleh molekul-
molekul cuplikan.
Respon/jawaban detektor, dibuat nyata oleh pencatat, dapat diubah

menjadi konsentrasi atau berat dari suatu komponen dari cuplikan. GLC
merupakan bagian yang paling besar digunakan dalam penentuan
konsentrasi atau berat dari senyawa-senyawa.
1. Batasan-batasan dalam Analisa Kuantitatif pada GLC

Kisaran konsentrasi adalah sangat terbatas bandingkan sebagai contoh,
pengukuran-pengukuran konsentrasi pada U.V. (hukum Lambert-Beer 0,5
<E <1.0).
Demikian juga dalam detektor GC berada dalam jangkauan linier, hanya

dalam kisaran konsentrasi iertentu. Ini berarti, misalnya jika kita
mendapatkan puncak dengan luas 20 mm 2 dari senyawa 10 pg, maka kita
harus mernperoleh luasan puncak sebesar 40 mm 2 untuk 20 pg, jika kita
berada dalam kisaran linier, meskipun demikian tidak berarti bahwa 10 mg
akan menghasilkan luasan puncak 20.000 mm 2. Mengapa ? Kita harus
mengetahui kisaran linier suatu detektor.
Kisaran linier detektor adalah perbandingan dari konsentrasi yang terbesar

dengan yang terkecil.
Detektor Kisaran linier Sensitivitas
- T.C.D. 104 6.10I°g/det

- F.I.D. 107 10'1 g/det
- E.C.D. 102 10-14 g/det
2. Respon Jawaban detektor

Jenis detektor yang berbeda akan memberikan reaksi yang berbeda
terhadap komponen-komponen dari cuplikan. Ini berarti bahwa respon dari
TCD terhadap 20 mg hexan akan berbeda bila kita menggunakan FID.
Juga untuk hexan sebanyak 20mg.
Tetapi ternyata juga satu jenis detektor akan memberikan respon yang
bcrbcda terhadap senyawa-senyawa yang berbeda. Sehingga TCD (atau
FID atau ECD) dapat memberikan luasan puncak yang berbeda terhadap

20 mg hexan dan 20 mg etanol. Itulah sebabnya kita harus
menstandarisasi, seperti yang akan dibicarakan kemudian. Tetapi
sebelumnya kita perlu mengetahui bagaimana cara mengukur puncak-
puncak pada suatu kromatogram.
3. Pengukuran Puncak (pik)
a. Ketinggian puncak
Ini merupakan cara yang paling mudah dan cepat. Kita dengan mudah
mengukur..ketinggian dari atas suatu puncak sampai ke garis dasar. Untuk
memperoleh garis dasar kita harus menarik garis yang paling baik antara
permulaan dan akhir dari puncak.
1. Pengukuran ketinggian
Ketinggian selalu dinyatakan dalam mm. Cara ini dapat dipertanggung

jawabkan untuk cuplikan sebanyak < 10 Pg.
2. Luas puncak
Cara ini merupakan cara yang paling banyak digunakan baik dengan
tangan atau dengan mesin/secara otomatik, yang dikenal juga dengan
nama integrator.
a. Tinggi x lebar pada setengah tinggi

Puncak-puncak pada kromatogram mirip seperti segi tiga. Cara ini
mendekatkan puncak (bentuk bel) sebagai segi tiga :

w = lebar pada ½ H
Luas = H x W (dalam mm2 atau cm2 )
Dasar puncak normal tidak diberikan karena dapat terjadi deviasi yang besar
pada puncak-puncak yang tidak simetris.
b. Penimbangan
Integrator, lntegrator-integrator menghitung secara otomatis luas permukaan
dari puncak-puncak. Ada dua macam integrator yaitu :
1. Integrator piringan yang bekerja secara mekanik.
2. Integrator digital/angka elektronik merupakan integrator yang paling
baik, tetapi agak mahal. Alat ini mulai dan berhenti mengintegrasi secara
otomatik, memberikan harga-harga untuk luasan dan kadang-kadang
mencatat juga waktu retensi.
4. Faktor-fak(or Koreksi
Faktor-faktor koreksi harus ditentukan karena senyawa-senyawa yang
berbeda mempunyai respon terhadap detektor berbeda pula. Faktor- relatif,
misal : terhadap benzena atau terhadap kornponen lain dari cuplikan. Faktor
yang terakhir ini merupakan bilangan sembarang terhadap 1.0.
benzan Komponen cuplikan

pelarut
yang diukur

Cara :
1. Timbang secara teliti campuran benzena + cuplikan (W).
2. Masukkan/injeksikan dan ukur luasan puncak (A).
3. Hitung A/W untuk puncak cuplikan dan untuk puncak bezana
4. Faktor koreksi untuk puncak cuplikan, relative untuk bezana
Sejauh kertas pencatat mempunyai homogenitas yang tinggi sehingga berat

dari suatu puncak sesuai dengan berat dari komponen cuplikan. Kita dengan
mudah menggunting puncak-puncak
A/W (cuplikan)
= 
A/W (benzena)
Untuk cuplikan dan detektor yang spesifik faktor-faktor koreksi berikut ini
selalu dapat digunakan.
Contoh :
untuk FID senyawa faktor koreksi
benzena 1.00
anilin 0.46
asam asetat 0.24
etanol 0.75
5. Standardisasi
Disebabkan respon-respon yang berbeda dari detektor tertentu terhadap
senyawa-senyawa organik, maka harus menggunakan senyawa standar.
Dengan standar dapat menghitung faktor-faktor koreksi. Persyaratan
terhadap standar adalah :
1. sangat murni
2. inert
3. bercampur dengan cuplikan
4. tidak mudah menguap
5. stabil.
Dua cara standardisasi yang biasanya digunakan :

a. Standardisasi eksternal
b. Internal,
a. Standardisasi eksternal
Standarisasi eksternal jumlah yang pasti dari cuplikan murni diinjeksikan.

Harga-harga dari luasan puncak kemudian digambarkan lawan berat-berat
senyawa yang diketahui dan diinjeksikan.
Luas
puncak
Berat cuplikan
Dalam praktek kita mengerjakan sebagai berikut :

1. Buat larutan 10 % dari cuplikan A
2. Buat dari larutan ini : larutan-larutan 5 : 1 : 0,5 : 0,1%.
3. Injeksikan larutan tersebut , hitung luasan-luasan puncak
4. Buat kurva kalibrasi
catatan : Perhatikan kelinieran dari sistem GLC untuk larutan-larutan tersebut.

lni berarti bahwa :
area/luas
 = konstan (c); untuk semua larutan
Konsentrasi
Konsentrasi dari cuplikan A yang tidak diketahui, sekarang dapat ditentukan

dari kurva kalibrasi, atau dari perumusan

Ketidak keuntungan dari cara ini adalah
1. Jumlah yang tepat dari cuplikan harus diinjeksikan
2. Penginjeksian yang dapat hasil-ulang (reproducible)
3. Kalibrasi adalah waktu yang diperlukan.
4. Sensitifitas detector harus tetap konstan
b. Standardisasi internal
Cara ini mempunyai keuntungan utama yaitu tidak memerlukan volume
yang diketahui untuk diinjeksikan. Sehingga tidak membutuhkan
penginjeksian yang dapat diulang
Cara standardisasi internal memberikan persentase berat yang sangat tepat
terhadap komponen-kornponen cuplikan. Caranya adalah sebagai berikut :
Cara ini tidak sensitif relatif terhadap perubahan-perubahan dalam sistem
kromatografi (aliran, kolom, detektor). Standar internal yang dipilih harus
mempunyai syarat :
a. kira-kira sifat kimia yang sama seperti cuplikan,
b. kira-kira waktu retensi yang sama seperti senyawa cuplikan, waktu
retensi tidak tepat sama (tidak bersamaan dengan suatu komponen dari
cuplikan).
c. Waktu retensi tidak sama (tidak bersamaan dengandengan suatu
komponen dari cuplikan)
Cara standarisasi internal memberikan prosentase berat yang sangat tepat

terhadap komponen-komponen cuplikan. Caranya adalah :
1. Tambahkan pada cuplikan dengan berat yang tepat sejumlah standar
internal, juga berat yang tepat dengan konsentrasi kira sama (biasanya
10%).
2. Tentukan faktor-faktor koreksi dalam suatu analisa yang terpisah, untuk
semua komponen cuplikan yang diukur.
3. Persen berat dari setiap komponen cuplikan dapat dihitung dengan :
luas senyawa x berat standar int. x 100

% berat = 
faktor koreksi x luas standar int. x Berat cuplikan

6. Kesalahan-kesalahan dalam Analisa Kuantitatif
Kemungkinan kesalahan-kesalahan pada analisa GLC dapat timbul dari :
I. Cara penyiapan cuplikan
a. Penginjeksian yang baik adalah merupakan "seni" yang harus
dipelajari.
b. Cuplikan dapat berubah dalam GLC : hilangnya komponen yang
dihasilkan dalam analisa kuantitatif yang jelek.
2. Penampilan detektor
Detektor-dctektor menjadi kotor atau pengaturannya yang tidak baik
3. Penampilan : Pencatat harus berada dalam kisaran linier (zero-set)
4. Cara kuantitatif
5. Penghitungan
Dari 1 - 4 telah banyak kita bicarakan, sekarang kita akan meninjau
kesalahan-kesalahan yang disebabkan oleh penghitungan. Didalam
penghitungan GLC kita sering bekerja dengan :
pengukuran-pengukuran yang ditambahkan
Harga rata-rata (X) : 
jumlah total pengukuran
Deviasi standar : σ =
Deviasi standar menunjukkan pengukuran-pengukuran yang lebih baik

daripada penghitungan rata-rata.
Deviasi standar relatif didefinisikan sebagai :
σ
σ rel =  x 100%
X
7. Analisis Berdasarkan Tinggi Pik

Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis
dasar (base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan
mengukur jarak garis ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan

dengan tingkat presisi yang cukup tinggi. Perlu diperha tikan bahwa
tinggi pik dipengaruhi oleh pelebaran zona, yaitu tinggi pik berbanding
terbalik dengan lebar pik. Pengukuran berdasarkan tinggi pik hanya
bisa dilakukan jika lebar pik standar dengan lebar pik sampel relatif
sama. Untu memperoleh kondisi ini yang perlu diatur adalah temperatur
kolom, kecepatan alir fasa gerak dan rentang injeksi sampel. Jumlah
sampel yang diinjeksikan tidak melampaui batas maksimal (tidak
overload).
2. LEMBAR KERJA
Peserta dibagi menjadi 3 kelompok, setiap kelompok mendiskusikan tugas

dibawah ini :
1. Diskusikan dengan teman Anda apa yang akan terjadi jika dalam
analisis dengan GLC jumlah sampel yang diinjeksikan melampaui
batas maksimal (tidak overload).
2. Tinggi pik kromatografi dapat diperoleh dengan menghubungkan garis
dasar (base line) di kedua sisi pik dengan satu garis lurus dan
mengukur jarak garis ini ke puncak pik, pengukuran ini bisa dilakukan
dengan tingkat presisi yang cukup tinggi. Gambarkan dengan
kromatogram, sehingga luas pik dapat dihitung dengan cara
menghitung luas segitiga yang terbentuk dari alas pik dan puncak pik.
3. Kromatografi gas telah digunakan secara berhasil terhadap sejumlah besar
senyawa-senyawa dalam berbagai bidang. Dan digunakan baik terhadap
senyawa-senyawa organik dan anorganik. Jelaskan beberapa contoh
kegunaan kromatografi gas pada bidang-bidang yang besar ruang
lingkupnya.
4. Diskusi kelompok diberi waktu 20 menit, dan setiap kelompok
mempresentasikan hasilnya selama 10 menit.
3. EVALUASI
1. Jelaskan tujuan dari analisa kualitatif pada GLC!
2. Kemungkinan-kemungkinan apa saja yang dapat menimbul
kankesalahan pada analisa dengan GLC!

3. Jelaskan cara standardisasi internal dapat memberikan persentase berat
yang sangat tepat terhadap komponen-kornponen cuplikan!
4. Jelaskan syarat-syarat standarisasi internal yang dipilih dalam sistem
kromatografi (aliran, kolom, detektor)!
E. KEGIATAN PEMBELAJARAN 5. MELAKSANAKAN PERHITUNGAN

ANALISIS

1. LEMBAR INFORMASI
a. Dasar kerja Kolom GLC

Meskipun teori GLC agak sukar namun demikian dasar kerjanya sangat
mudah. Pemisahan komponen-komponen dari cuplikan terjadi di antara gas
pengangkut dan fasa cair. Berikut adalah apa yang terjadi yang dinyatakan
dalam skala waktu.
Cuplikan yang dimasukkan mengandung komponen A+B+C
A
Waktu nol B
C
B A
2 menit C A terpisah dari
B dan C
4 menit C B A Sekarang A,B

dan C terpisah
Bagaimana pemisahan ini dapat terjadi ?

Kenyataan proses GLC adalah mirip dengan ekstraksi. Proses pemisahan
dapat dipandang sebagai serangkaian dari partisi di mana cuplikan masuk
ke dalam larutan dari fasa dan selang beberapa waktu akan teruapkan lagi.
Molekul
cuplikan
● *▪
● ▪
Fasa bergerak
Fasa cair
Molekul-molekul yang teruapkan Padatan
pendukung
Molekul cuplikan dalam fasa
cair
Jadi fasa cair menahan molekul-molekul cuplikan. Gerakan dilakukan oleh

fasa bergerak. Afinitas cuplikan terhadap fasa cair menentukan berapa lama
cuplikan dItahan. Senyawa-senyawa yang mempunyai afinitas rendah (tidak
suka) terhadap fasa diam akan keluar dari kolom pertama. Sedangkan
senyawa-senyawa dengan afinitas besar (larut dengan baik) terhadap fasa
diam akan keluar dari kolom berikutnya.
Afinitas ini didasarkan pada kelarutan dari cuplikan terhadap fasa diam:
2. Fasa diam melarutkan cuplikan.
3. Semua molekul cuplikan bergerak dengan kecepatan absolut yang sama
melalui kolom, yaitu sesuai dengan kecepatan gas pengangkut.
4. Kecepatan relatif dari molekul-molekul cuplikan adalah berbeda,
disebabkan afinitas yang berbeda.
Jika kita masukkan senyawa tunggal ke dalam GLC, maka senyawa tersebut
akan teruapkan dan terlarut (tercampur) dalam gas pengangkut. Jika
senyawa ini masuk ke dalam kolom, ia akan ditarik oleh fasa cair (stasioner).
Kemudian, akan dipartisikan sesuai dengan hukum NERNST.
Hukum NERNST menyatakan :
konsentrasi senyawa dalam fasa diam
K=
konsentrasi senyawa dalam fasa bergerak
Harga K tergantung pada :

1. Volatilitas kemudahan menguap dari senyawa.
2. Afinitas dari cuplikan terhadap fasa diam.
Keterangan :
1. Volatilitas terutama tergantung pada titik didih dari senyawa.
2. Afinitas didasarkan pada interaksi antara cupCkan senyawa dengan fasa
diam.

Interaksi-interaksi tersebut merupakan gaya molekular. Gaya yang kita
kenal adalah :
a. Gaya van der Waals = gaya dispersi (non polar).
b. Ikatan hidrogen = gaya Keesom (merupakan interaksi antara dua dipol
yang permanen).
c. Interaksi dipol terinduksi (gaya Debye), merupakan hasil interaksi antara
dipol permanen dengan dipole terinduksi.
d. Gaya interaksi spesifik, seperti ikatan kimia atau pembentukan komplek
Ikatan hidrogen (b) merupakan gaya yang penting dalam GLC, sedangkan
(d) hampir tidak terdapat pada GLC, tetapi penting terutama dalam
kromatografi penukar ion.
Jika harga k tetap pada kisaran konsentrasi yang besar, maka kita akan
mendapatkan : LINEAR GLC.
Kondisi untuk GLC linier yang ideal diperoleh jika :
1. Kesetirnbangan dicapai sangat cepat pada setiap saat.
2. Molekul-molekul cuplikan hanya bergerak oleh gaya dari gas
3. Pengangkut; sehingga tidak ada difusi.
4. Pengisian dari kolom harus sama/uniform (setiap bagian mengandung
jumlah sama fasa diam clan fasa bergerak).
Dalam hal cuplikan mengandung lebih dari satu senyawa, maka setiap
senyawa akan mempunyai harga k sendiri-sendiri. Sebagai contoh,
bayangkan suatu cuplikan mengandung molekul-molekul A, B, C, dan D,
maka kita akan memperoleh 4 harga K, : kA, kB, kC, dan kD.
Kecepatan di mana molekul-molekul tersebut bergerak melalui kolom sama
dengan hasil kali kecepatan gas clan bagian dari waktu dalam mana
komponen-komponen tersebut dalam fasa gas. Bayangkan kromatogram
berikut :

Senyawa dalam fasa cair
Senyawa bergerak dalam masa
ini
Senyawa bergerak Senyawa tetap
Udara (N2) mempunyai titik didih yang sangat rendah, tidak ditahan oleh fasa
cair.
tR = waktu aatam mana senyawa tetap tinggal.
tR - f' R = waktu dalam mana senyawa bergerak.
Di dalam GLC kita akan banyak bee-bicara tentang dalam mana cuplikan
ditahan oleh kolom; ini disebut pe,7ahanan (the retention time) = tR.
Kromatogram gas dari GLC linier yang ideal untuk hasil analisa empat
senyawa A, B, C, dan D akan memberikan gambaran seperti berikut :
hingga ia
A C
B
waktu
D
waktu
Kita selalu mempunyai G1.C linier yang tidak ideal, karena kolom yang ideal
tidak terdapat. Kalau kita lihat pada kromatogram gas normal, tidak ada
puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva, yang disebut kurva-
kurva Gauss, (pelebaran puncak), atau bila keadaannya lebih jelek akan
menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di muka.
Hal ini disebabkan adanya :
1. Difusi eddy (olakan) : difusi ini disebabkan oleh kenyataan bahwa
kecepatan gas pengangkut tidak sama di dalam seluruh kolom. Ini
disebabkan oleh kenyataan bahwa bagian-bagian dari pori yang dilalui
tidak sama panjang :"MULTIPATH -EFFECT" (pengaruh jalan berganda).

2. Difusi molekuler : terutama dalam fasa gas, molekul-molekul cuplikan
dapat bergerak dalam arah yang salah yang disebabkan oleh difusi.
3. Kesetimbangan yang lambat : beberapa molekul tetap tinggal lama,
lainnya sebentar dalam fasa diam (hal ini dapat disebabkan oleh
perbedaan-perbedaan suhu yang kecil).
4. Harga k tidak tetap : ini disebabkan perbedaan rasio distribusi dalam
kolom.
Keempat faktor ini menyebabkan perbedaan puncak. Faktor- Faktor 1,2,3

menyebabkan faktor puncak yang simetris. Faktor 4 menyebabkan pelebaran
puncak yang tidak simetris.
Pelebaran-pelebaran puncak terjadi dalam berbagai cara/metoda analisa
(misal dalam spektroskopi). Dalam keadaan yang paling buruk dapat
menyebabkan puncak-puncak saling tindih.
Kita mendifinisikan pemisahan R (resolution), sebagai pemisahan

nyata antara dua puncak berdekatan :
R= 2d dalam hal dua puncak dengan luas sama.

WI+W2
Jika R = 1 pemisahan adalah 98%.
Untuk pemisahan yang baik R harus : R > 1,5, ini berarti pemisahan >
99,7%a.
Pemisahan dari puncak-puncak dalam Kromatografi erat hubungannya

dengan dua faktor:

1. Ejfisiensi kolom : pelebaran puncak merupakan hasil dari bentuk
kolom dan kondisi operasi.
2. Effisiensi pelarut : hasil dari interaksi antara cuplikan dengan fasa
diam, effisiensi pelarut menentukan kedudukan relatif dari jalur-
jalur solute pada sebuah kromatogram
a. Effisiensi Kolom
Effisiensi kolom diukur sebagai jumlah pelat teoritis : N. Kita berbicara
tentang "The height equivalent to a theoretical plate, the HETP"
(ketinggian ekuivalen terhadap pelat teoritis) dan didefinisikan
sebagai :
L
HETP =
N
N = jum(ah pelat teoritis dari suatu kolom

L = panjang (cm) dari kolom tersebu.
Effisiensi kolom tergantung pada :
 pelarut = fasa diam
 solute/zat yang dilarutkan = cuplikan
 suhu
 kecepatan aliran (dari gas pengangkut)
 ukuran dari cuplikan.
Banyak faktor yang mempengaruhi N (atau HETP). Tetapi secara kuantitatif

teori yang menyatakan efek-efek tersebut adalah sangat sukar. Kita akan
membicarakan dua teori :
A. Teori pelat
B. Teori kelajuan/kecepatan.
.
b. Teori Pelat

Konsep tentang pelat adalah imaginasi : suatu kolom GLC tidak
memiliki pelat-pelat, tetapi merupakan penggambaran dari partikel--
partikel (bentuk bulatan) yang tertarik/terikat fasa cair seperti halnya
dalam GLC. Dasar teori pelat adalah dari distribusi.
Pelat, atau lebih baik HETP, adalah tinggi (atau panjang) dari kolom
yang cukup untuk tercapainya kesetimbangan antara solute dalam
fasa gas bergerak dan fasa cair yang tetap. Lebih banyak pelat yang
dimiliki oleh kolom, akan memberikan puncak yang lebih kecil, atau
efisiensi kolom lebih baik.
Contoh : Pelat teoritis N.

Efisiensi kolom naik jika jumlah pe lat teoritis lebih.
Dari tabel berikut kita dapat melihat harga dari kromatografi gas sebagai alat
analisa :
Ettsiensi Panjang Jumlah
umumnya pelat
Vigreux 2,5/ft 2 ft 5
Spinning band 75 /ft 2 ft 150
Kolom GLC 500 /ft 6 ft 3.000
Kapiler gelas GLC 200 /ft 150 ft 30.000
Pelat teoritis berhubungan dengan pelebaran puncak pada

kromatogram. Sehingga mudah menghitung jumlah pelat, N dari
kromatogram.
di mana :
x = jarak dari injeksi ke puncak maksimum.

y = panjang dari garis dasar yang terpotong oleh tangen-tangen dari
kurva pada titik-titik pertemuan (biasanya 2/3 dari tinggi).
perumusan yang disederhanakan ini berasal dari hasil teori pelat :

xN = x2 , dimana σ = deviasi standar dari
a
a= (x-
x) n-
1
hingga N = x , = x2 (n-1)
(x-x) 2 (x-x) 2
n-1
dimana x = harga rata-rata perhitungan dari x

n = jumlah yang terhitung
W = 2.30 q dimana W = lebar puncak pada I/2 H
Bila W = 2,36 disubstitusikan dalam N= X2

O2
memberikan
2,36 X
N=()2 = 5,57 ()2
W W
Perumusan ini lebih teliti untuk menghitung N daripada perumusan :

X X
N = 16 ()2; ini berasal : N=()2
y W

dimana y = 4 σ
Dari kromatogram kita kemudip.n dapat menghitung HETP dengan rumus :

L σ2
HETP =  =  L
N X2
(L selalu spesifik untuk suatu kolom).Jumlah pelat teoritis tiap meter dari panjang
kolom disebut :" Performance" dari kolom.
c. Teori kelajuan dan percepatan

Teori kelajuan telah dikembangkan oleh seorang Belanda Van Deemter,
persamaan yang diturunkannya disebut : Persamaan Van Deemter.
Bentuk persamaan tersebut adalah :
HEPT=A+B/µ + C.µ
Persamaan ini memberikan jawaban bagaimana untuk meningkatkan

peranan kolom Kromatografi.
µ adalah kecepatan linier gas (atau kelajuan ali ran) melalui kolom;
µ diukur dengan :
panjang kolom (dalam cm)
µ= 
waktu penahanan udara (dalam detik)
Besaran-besaran A, B. dan C penyebab utama terjadinya pelebaran puncak :

(A). Difusi olakan (the eddy diffusion) = (efek jalan ganda)
Penggambaran perbedaan panjang jalan dalam suatu kotom.
(B). Difusi molekuler; pendefusian solute dalam gas pengangkut.

gas
pengangkut Fasa cair
kolom
Defuse molekul solute
(C). Penahanan terhadap perpindahan massa

Ini adalah ukuran dari jumlah atau kekentalan dari fasa diam (cair) di dalam
kolom GLC.
Jika harga-harga A, B, dan C tertentu, maka kita dapat melihat persamaan
dasar van Deemter harus terdapat kecepatan kelajuan gas pengangkut
optimum, di mana kita akan bekerja pada keadaan tersebut.
Katakanlah dengan HETP minimum :
HETP = A + B/µ + C.µ
HETP Min = A+ 2B.C
Besaran-besaran yang tepat A, B, dan C dapat ditentukan dari penurunan

persamaan van Deemter. Namun hanya akan meringkas secara praktis agar
supaya meningkatkan efisiensi kolom.
1. Padatan pendukung harus terbuat dari partikel-partikel yang kecil,
ukurannya sama; biasanya dari tanah diatomea yang mempunyai ukuran
100 - 120 mesh.
2. Kecepatan alir gas pengangkut adalah optimum pada HETP minimum.
3. Gas pengangkut dengan berat molekul besar, biasanya N2, untuk analisa
yang cepat dapat digunakan He atau H2
4. Fasa diam yang digiznakan harus mempunyai kekentalan rendah.
5. Banyaknya/jumlah fasa diam yang dipakai biasanya 1 -10% dari berat
padatan pendukung.
6. Perbandingan antara gas pengangkut yang masuk dan yang keluar harus
rendah; tekanan yang masuk 1,5 - 2,5 atm.
7. Pemisahan akan lebih baik pada suhu kolom yang rendah tetapi dengan
demikian waktu analisa menjadi lama.
8. Diameter kolom yang kecil memberikan pemisahan lebih baik (I/8" atau
1/16 inch).
Delapan aturan tersebut akan menaikkan efisiensi kolom, sehingga puncak-
puncak yang terjadi akan sekecil mungkin. Tetapi masih mempunyai dasar
lain untuk menaikkan pemisahan dalam GLC.
d. Efisiensi Pelarut
Suatu hal yang penting dari GLC, bahwa GLC dapat memisahkan senyawa -
senyawa dengan tekanan uap yang sama, yaitu yang mempunyai titik didih
yang sama. Pekerjaan tersebut tak mungkin dilakukan dengan distilasi.
Hal ini dirnungkinkan oleh kenyataan bahwa GLC memiliki fasa cair, yaitu
pelarut (fasa diam). Seperti telah kita ketahui, pelarut mempunyai interaksi yang
spesifik dengan cuplikan. Gaya-gaya ini rnenentukan kelarutan hingga dengan
demikian pemisahan dapat terjadi. Pemisahan tergantung pada harga-harga
koefisien partisi K.
Efisien pelarut didefinisikan sebagai : perbandingan dari koefisien-koefisien
partisi, atau waktu-waktu retensi yang teratur.
x, , x = waktu retensi (volume) dari puncak 1, 2.

x,, x, = waktu retensi terkorelasi atau diatur dari puncak 1, 2.
x2 k2
Efisiensi pelarut, a =  = 
x 1’ k1

x2
Kita juga mendefinisikan : Faktor Pemisahan, SF= 
x2
Koefisien distribusi (= partisi), k, tergantung pada suhu. Harga k turun dengan

kenaikan suhu, karena molekul-molekul akan lebih lama berada dalam fasa
gas pada suhu yang lebih tinggi.
k2
Karena efisiensi pelarut, α = , α tetap pada kisaran suhu tertentu.
k1
Meskipun demikian, pada suhu-suhu yang relatif tinggi, harga k menjadi

sangat kecil, hingga pemisahan akan menurun, karena pemisahan hanya
terjadi dalam fasa cair. Dan pada harga-harga k kecil, kebanyakan molekul-
molekul solute berada dalam fasa gas. Sehingga untuk mencapai pemisahan-
pemisahan GLC yang lebih baik suhu-suhu yang lebih rendah harus
digunakan.
Waktu minimum yang dihabiskan dalam fasa cair rata-rata 50% dari waktu
retensi. Ini berarti bahwa tR adalah lebih dari dua kali harga dari waktu retensi
udara. Hingga kromatogram yang baik mempunyai bentuk seperti ini :
injeksi Puncak
Daerah kromotogram untuk
Udara pemisahan puncak yang baik
Disini tidak ada
Sekarang kita mendefinisikan faktor kapasitas untuk suatu pemisahan :

waktu retensi terkoreksi x2
K2’= 
waktu retensi udara

X2 ’
x
injeksi
Puncak
Dari perumusan berikut kita akan dapat menghitung pelat teoritis yang
dibutuhkan, jadi panjang yang dibutuhkan untuk pemisahan yang baik, adalah
menghitung jumlah suatu kolom, yang baik :
α K2’ + 1
N yang dibutuhkan = 16 R2 ( )2 =(  )2
α-n K2’
R = pemisahan (resolution)
α = efisiensi pelarut.
e. Suhu Kolom
Suhu kolom merupakan hal yang penting dalam pemisahan-pemisahan GLC.
Tetapi suhu kolom tidak dapat dipilih. Koefisien partisi, k, sangat tergantung
pada suhu. Sebagai aturan umum dapat dinyatakan sebagai berikut : Kenaikan
sebesar 30o C dalam suhu kolom akan menurunkan setengah harga k, jadi
menurunkan juga setengah dari waktu retensi, hingga suhu-suhu kolom yang
lebih tinggi akan menurunkan waktu analisa. Tetapi, biasanya pemisahan
dapat ditingkatkan dengan penurunan suhu kolom. Ini berarti harus ada suhu
kolom optimum dalarn analisa GLC.
Pada umumnya ada aturan yaitu : Suhu kolom yang paling baik adalah harga
rata-rata dari titik didih dari cuplikan. Tentu saja hal inipun masih tergantung
pada persentase dari fasa cair pada padatan pendukung. Jumlah yang tinggi
dari fasa cair akan memerlukan suhu kolom yang lebih tinggi.
Dalam menentukan suhu kolom harus memperhatikan suhu maksimum yang
diperbolehkan dari fasa cair yang digunakan, terjadi"colum bleeding" (=
penguapan dari fasa diam). Meskipun demikian setiap suhu yang digunakan
harus di atas titik lebur dari senyawa atau cuplikan.

GLC berkembang sangat cepat, saat sekarang telah ada beberapa ratus fasa
diam. Karena banyaknya jenis fasa diam sering kesukaran dalam memilih
fasa cair yang dipersyaratkan untuk pemisahan.
f. Pemilihan yang tepat fasa diam untuk GLC

Pendugaan secara kuantitatif terhadap waktu retensi tetap merupakan
persoalan yang sangat sukar dalam teori GLC. Di dalam praktek tidak
membutuhkan pendugaan tersebut, karena dalam kebanyakan analisa GLC
bekerja dengan senyawa-senyawa yang tidak diketahui.
Untuk pemisahan dengan GLC terhadap senyawa-senyawa organik bekerja
dengan kaidah/aturan yang agak sederhana : "like dissolves like" (Latin
Similia similibus solventur). Keadaan ini sesuai dengan aturan dalam pemilihan
pelarut untuk sejenis senyawa organik yang tertentu.
Dalam GLC hal ini terutama didasarkan pada cuplikan larutan dalam fasa cair.
Dimana polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk
memperoleh pemisahan GLC yang baik. Sehingga senyawa polar akan
terpisah dengan baik pada fasa cair yang polar dan senyawa-senyawa yang
non-polar akan terpisah dengan baik pada fasa cair non-polar.
Berikut kita bagi fasa diam menjadi tiga kelompok :
1. Non polar
2. Semi polar (antara I dan 3)
3. Polar.
1. Fasa cair non polar

a. Fasa cair non polar yang terkenal adalah : APIEZON. Apiezon merupakan
suatu campuran dari alkana-alkana dengan titik didih yang sangat tinggi;
CnH2n+2, di mana n sangat besar.
b. Juga sangat dikenal : Squalane. Ini adalah hidrokarbon : hexametil
tetrakosaan, C3pH62,
c. Juga banyak digunakan karet silikon yang disebut : SE - 30; yang
merupakan polimer.
Pada umumnya fasa -fasa cair non polar memisahkan kumponen -
komponen cuplikan sesuai dengan titik didihnya.

2. Fasa cair semi polar
Fasa cair semi polar terdiri dari rantai non polar yang terikat pada gugus-
gugus polar atau dapat menjadi polar, yang sering digunakan adalah
ester-ester dari asam ftalat dan alkulrol-alkohol tinggi; misal dionilftalat.
O Kerangka non polar yang

‫װ‬
-
C O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2 -
CH3
C-O-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
‫װ‬
O
Gugus yang dapat terpolarisasi
Fasa cair yang dikenal dengan nama dagang ; SAE -52, merupakan
polimer dengan silikon dengan struktur :
CH3 CH 3 Dinamakan Juga :

Ι Ι
Si -0- Si -O
Ι Ι
CH3 CH 3 n
Fasa semi polar ini ternyata mempunyai kemiripan dengan fasa -fasa
non polar, yang memisahkan senyawa-senyawa polar dan non polar
sesuai dengan berat molekul, jadi sesuai juga dengan titik didihnya.
Campuran dari senyawa-senyawa polar dan non polar juga terpisahkan

sesuai dengan berat molekulnya. Hingga jika titik didih senyawa
tersebut sama, maka senyawa yang polar akan mempunyai waktu
retensi yang paling rendah/pendek. Ini disebabkan dengan ti tik didih
yang sama, senyawa yang polar akan mempunyai berat molekul yang
paling rendah.
2. Fasa Cair Polar

Fasa-fasa cair polar mengandung gugus-gugus polar. Fasa cair polar
yang terkenal adalah polieter. Carbowax termasuk dalam golongan ini.
Carbowax mempunyai struktur sebagai berikut :

R R
Ι Ι
H O - CH - CH 2 -(0- CH - CH 2 ) n -
OH
Jenis Carbowax tergantung pada harga dari n (= derajad polimerisasi)

dan gugus R, misal : Carbowax 20 M. Poliester juga termasuk dalam
golongan fasa-fasa cair polar. Sering digunakan ester -ester dari asam-
asam di karboksilat alifatik atau aromatik.dan etilen glikol.
Fasa-fasa cair polar dapat mempunyai sifat baik sebagai penerima

(acceptors) maupun pemberi (donor) ikat an hidrogen. Sehingga fasa
cair tersebut dapat memisahkan campuran senyawa -senyawa polar dan
non polar dalam suatu cuplikan yaitu dengan menahan komponen -
komponen polar.
Pembagian fasa cair Berdasarkan Ikatan Hidrogen
Pengertian ikatan hidrogen : Misal R - O - H, dapat memberi, tetapi juga dapat

menerima ikatan hidrogen.
Penerima pemberi
Atom-atom penerima biasanya :O, N, F.
Atom-atom pemberi adalah H aktif
Senyawa-senyawa yang paling polar dapat menerima dan memberi

ikatan-ikatan hidrogen. Sedangkan senyawa organik yang kurang polar
(= non polar) tidak dapat menerima maupun memberi ikatan hidrotren.
Dengan cara ini kita akan membagi/mengklasifikasikan solute sebagai berikut :
Klas 1 (sangat polar) Klas 2 (Polar)

Scnyawa-senyawa yang Solute mengandung baik atom
sangat polar, dapat penerima dan atom H aktif

membentuk ikatan hydrogen
- air -alkohol-alkohol
- glikol, gliserol, dsb -asam-asam lemak
- amino alkohol -fenol-fenol
- asam-asam hidroksi -amino primer dan sekunder
-poli penol -oksim
-Asam-asam di basa -senyawa-senyawa nitro dengan atom-
atom H – a
-nitrit-nitrit dengan atom-atom H-a
-NH3, HF NZH4, HCN
Klas 3 (Polaritas medium) Klas 4 (Polaritas rendah)
Seyawa-senyawa ini hat?ya Senyawa-senyawa ini hanya mengan-
mengandung atom-atom dung atom H aktif, tidak memiliki atom
penerima tetapi atom H aktif. penerima.
- eter - CHCL3, CH2, CL2
- keton - CH3 CHCL2, CH2CI CH2CI
- aldehida - CH2CI CH2CI2, dsb.
- amina tersier - hidrokarbon aromatik
-senyawa-senyawa nitro yang lain.
- hidrokarbon olefin
- nitrit-nitrit yang lain
Klas 5 (non Polar)
Senyawa-senyawa ini tidak dapat
membentuk ikatan hidrogen
- hidrokarbon-hidrokarbon jenuh
- CS2
- merkaptan
-senyawa-senyawa
halokarbonyang lain (CCl4)
Fasa-fasa cair juga dikelompokkan/dibagi menjadi beberapa klas, dalam hai

ini menjadi 4 klas, jika didasarkan atas polaritas; akan membentuk ikatan -
ikatan hidrogen. Pada umumnya urutan berikut untuk menyatakan ikatan H
yang diterima menurun :
O R
R-O-R R-C RC C=O R-CN R-NO 2
OR R
Klas A (Untuk klas 1) Klas B (Untuk klas 2)

 FFAP  Tetrasianoetil penta hidtrol
 20M-TPA  Zonyl E-7
 Veons  Ethofat
 Versamid 900  β.β oksidipropiontil
 Hall comid  XE - 60
 Quadrol  XF - 1150
 Theed  Sianoetil sukrosa
 Mannitol  Amine 220
 Castorwax  Epon 1001
 Digliseroi  Sioneotil sukrosa
Klas C (Untuk klas 3) Klas D (Untuk klas 4, 5)
 semua polyester  SE - 30
 Dimetil sulfolan  SF - 96
 Dibutil tetra kloroftolat  DC - 200
 SAIB  DOQ - 11
 Trieresil fosfat  Squalane
 STAP  Hexadecane
 Densil sianida  Apikson
 H exan  V-1
 Propiler Karbonat
 Q F-1
 Poligenil eter
 OV-17
Berikut adalah tabel "campuran" klas yang perlu diketahui. tabel inipun
didasarkan pada "like dissolves like" :
Interaksi fasa cair-solute Pengaruh pada retensi
3 -- C Sistem ideal : solut terpisah

4-D sesuai dengan titik didih
5–C
4-C Solute ditahan dengan baik oleh
dasa cair.Fasa fasa Cair
spesifik
1,2,3- A,B (dalam semua Biasanya solute ditahan oleh
gabungan) fasa cair
2-D 4,5-A Solute tidak ditahan oleh fasa cair :
Kelarutannya sangat kecil
Ada tiga contoh yang akan dikemukakan di sini :
1). Kompleksperaknitrat

Ion-ion perak membentuk hasil addisi yang dapat balik dengan olefin - olefin.
Hingga dengan demikian senyawa-senyawa olefin dalam cuplikan dapat ditahan
secara selektif.
2). Padatan pendukung dari kolom GLC dapat ditambah den -Ran KOH.
Dengan cara ini penyerapan dapat terjadi. Misal, pemisahan terhadap O,
M dan p toluidin.
CH3 I
3). Fasa diam yang sedang dikembangkan adalah : Durapak.
Di sini padatan pendukung terikat secara kimia pada fasa cair. Struktur
dari Durapak adalah sebagai berikut :
Biasanya solute ditahan oleh fasa cair.
Solute tidak ditahan oleh fasa cair : Kelarutannya sangat kecil
padatan pendukung
Dalam hal ini "Colum-bleeding" tidak mungkin terjadi.
b. Suhu Tempat Injeksi

Ada tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam
kromatografi gas/GLC/GC, yaitu :
a). Suhu Tempat Injeksi
Yang disimpulkan sebagai berikut :
1. Harus cukup tinggi untuk menguapkan cuplikan.

2. iasanya = 50°C lebih tinggi daripada titik didih dari komponen dari cuplikan.
Harus dicoba hingga diperoleh bentuk puncak yang paling baik.
3. Tidak terlalu tinggi, sebab kalau terlalu tinggi akibatnya kemungkinan
terjadinya perubahan oleh panas atau peruraian dari molekul-molekul.
b). Suhu kolom
1. Dalam semua hal di atas titik lebur dari fasa cair, tetapi di bawah suhu
maksimum yang diperbolehkan dari fasa cair.
2. Dalam praktek suhu kolom berdasarkan atas kompromi, Suhu-suhu yang

rendah memberikan pemisahan lebih baik, ictapi waktu retcnsi Iebih
panjang. Kompromi : kira-kira sama dengan rata-rata dari titik didih dari
cuplikan.
3. Waktu retensi mcnjadi lipat dua untuk sctiap 30°C penurunan suhu kolom.
c). Suhu detektor
Cukup tinggi untuk mencegah kondensasi dari cuplikan. Keadaan ini dapat
dilihat pada kromatogram dengan adanya pelebaran puncak atau hilangnya
puncak.
- Dengan TCD, suhu detektor harus tetap dijaga, tetap : ± 0,1 °C.
- Untuk FID pengontrolan suhu tidak begitu penting.
Suhu yang diprogram
Suhu kolom dalam GLC dapat dibuat tetap atau dapat divariasi/diprogram.
Yang terakhir disebut kromatografi gas dengan suhu yang diprogram
(Programmed Temperature Gas Chromatography = PTGC).
Pada pemisahan-pemisahan dengan GLC dengan suhu yang tetap

(isothermal), hanya dapat memisahkan komponen-komponen dari cuplikan
dengan perbedaan titik didih maksimum kira-kira 100°C. Akibatnya waktu-
waktu retensi sangat tinggi untuk komponen-komponen yang memiliki titik didih
yang paling tinggi. Lebih lanjut bentuk puncak yang diperoleh menjadi jelek.

Pada kromatografi gas dengan suhu yang diprogram kita dapat bekerja mula-
mula dengan suhu kolom rendah dan kemudian secara otomatis suhu
dinaikkan. Bila digambarkan mempunyai bentuk seperti :
Catatan :
Suatu campuran dengan titik didih tinggi akan membeku dalam kolom pada
suhu permulaan yang rendah, sehingga tidak boleh
memasukkan/menginjeksikan cuplikan. Alternatif rnengubah senyawa
tersebut menjadi turunannya yang mempunyai titik didih yang rendah.
2. LEMBAR KERJA
3. EVALUASI
1. Jelaskan hal-hal apa saja yang dapat menyebabkan pada kromatogram gas
normal, tidak ada puncak-puncak kecil, tetapi berupa bentuk-bentuk kurva,
yang disebut kurva-kurva Gauss, (pelebaran puncak), atau bila keadaannya
lebih jelek akan menghasilkan puncak-puncak berekor atau pemanjangan di
muka!
2. Jelaskan apa yang dimaksud dengan "like, dissolves like" pada GLC!
3. Jelaskan 4 kondisi untuk GLC linier yang ideal!
4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan effisiensi kolom yang diukur
sebagai jumlah pelat teoritis : N. atau "The height equivalent to a
theoretical plate, the HETP" (ketinggian ekuivalen terhadap pelat
teoritis)!

5. Polaritas dari komponen cuplikan dan fasa diam harus sama untuk
memperoleh pemisahan GLC yang baik, jelaskan pembagian fasa diam
tersebut berdasarkan tingkat kepolaran!
6. Sebutkan 3 jenis fasa cair non polar yang anda ketahui!
7. jelaskan pembagian fasa cair berdasarkan Ikatan Hidrogen!
8. Sebutkan tiga macam suhu yang penting untuk pemisahan yang baik dalam
kromatografi gas/GLC/GC!

DAFTAR PUSTAKA
1. McNair & E.J.Bonelli, 1988, Dasar Kromatografi Gas, Penerbit ITB Bandung
2. Skoog, Doughlas, A and James J Leary, 1992, Principles of Instrumental
Analysis, Saunders College Publishing, New York.
3. Mulya Suryadarma, dkk. 2004, Pengembangan Metode Analisis, Airlangga
Press, Surabaya.

Modul Kromatografi

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Modul Kromatografi

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

BAB I

Perkembangan tentang kromatografi digunakan suatu teknik dalam bentuk

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1. Kromatografi merupakan metoda pemisahan yang cepat, mudah dan

2. Kromatografi hanya membutuhkan campuran cuplikan . yang sangat

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Nama Diklat : Pengingkatan Kompetensi Guru Bidang Produktif

KOMPETENSI MATERI KEGIATAN

1. Menjelaskan  Prinsip dasar  Menjelaskan  Jenis-jenis  Tes tulis 2  Job Sheet

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

A. KEGIATAN PEMBELAJARAN 1. MENJELASKAN DASAR-DASAR ANALISIS

1.1. DASAR-DASAR KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

B. Kromatografi Gas A. Kromatografi Cair

Kertas Lapis Tipis Terbuka Tertutup

Prinsip pemisahan kromatografi yaitu adanya distribusi komponen-komponen

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1. Kromatografi kolom : fasa diam ditahan dalam sebuah kolom

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada senyawa -

Kecepatan bergerak dari suatu komponen dari campuran tidak

Kromatografi kertas merupakan partisi yang spesial, d imana lembaran kertas

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1.2. Kromatografi Serapan/Kolom

1a. Pemisahan suatu campuran dengan kolom kromatografi. 1b.

Kecepatan bergerak dari suatu komponen tergantung pada berapa

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1.3. Kromatografi Kertas

Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan Kromatografi kertas

Mula-mula telah dilakukan pemisahan asam -asam amino dan peptida-

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Meskipun kromatografi kertas sangat mudah pengerjaannya, tetapi sangat sulit

 Struktur dasar kertas

Sangat menarik untuk mencoba untuk menjelaskan kromatografi kertas dalam

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1.3. Kromatografi Lapisan Tipis (Thin Layer Chromatography, TlC )

Teknik TLC/KLT fasa diam (terutama silika, alumina, dan selulosa)

1) Metoda Kromatografi Lapisan Tipis

Perkembangan lebih lanjut STHAL telah mernbuat cara-cara pembuatan

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Tabel 1. Jenis Penyerap untuk Kromatografi Lapisan Tipis

zat padat Digunakan untuk memisahkan

- Silika  Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Kromatografi gas (Gas chromatography, disingkat GC) termasuk alat-alat

1. Analisa Kualitatif, yaitu penentuan sifat-sifat dari suatu komponen atau

2. Analisa Kuantitati, yaitu penentuan jumlah dari suatu komponen atau

Kromatograf i ga s dija jarkan seba gai cara analisa yang dapat

1. Kromatograf i padat - gas (Gas So lid Cromatograph y, GSC).

a). Kromatografi padat -gas (Gas Sol i d Cr oma tography, GSC).

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

1. Aktivitas dari penyerap (adsorbent) tergantung pada cara

a. Puncak-puncak berekor disebabkan permukaan aktif yang tidak

Itulah sebabnya pengguanaan dari GSC sangat terbatas, baik untuk

1) "grafite-coal" : dikenal sebagai "spheron", strukturnya sangat homogen

ANALIS KIMIA SMKN 1 BONTANG

Kegunaan molecular pemisahan gas-gas seperti hidrokarbon-hidrokarbon

Perkembangan dalam GSC pada saat sekarang yaitu digunakannya polimer-

Penyerap-penyerap ini sangat cocok untuk pemisahan :

1. Senyawa-senyawa yang sangat polar seperti H20, NH3, R-NH2, R-OH

b) Kromatografi gas-cair (GLC) atau Kromatografi Gas (GC)

Keuntungan-keuntungan yang ditunjukkan oleh GLC :