LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

TRANSFORMASI GEN ke DALAM Escherichia coli (E.coli) dan ISOLASI

PLASMID REKOMBINAN

Disusun oleh :

NAMA : EKA SAPUTRA

STAMBUK : F1C1 10 069
KELOMPOK : II (DUA)
ASISTEN : WAODE FITRIA SAKINAH

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALUOLEO
2013
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya
adalah DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu.
Sedangkan DNA nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon
dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki
protein histon.
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan
pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap dari
materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi
kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun tumbuhan.
DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu
sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan
flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman
memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit
dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat
menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi
dsan mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR.
Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA/RNA. Cara pemisahan dengan elektroforesisi ini merupakan alat pendukung
yang sangat pokok dalam teknologi DNA rekombinan, dengan aplikasi yang
begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul DNA.

1.2 Tujuan
1. Dapat melakukan isolasi DNA dari berbagai jenis tanaman
2. Dapat memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi
DNA
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung

informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya

(Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom

meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel

organisme. DNA genom meliputi gen danintergen(Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk.

Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme

eukariotik mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti

sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf 2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis

Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang

dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick

menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai

ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki

susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan

yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir

dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH.

 Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkan

kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220).

B. DNA REKOMBINAN

Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan

fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan

dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector

untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang

digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes

(YAC), Bacterial Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan

Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang

telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli,

diantaranya T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E.

coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase

yang dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi

mensintesis pembentukan ikatan phosphodiester yang menghubungkan

nukleotida yang satu dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua

enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah

ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).
C. SEL KOMPETEN
D.
E.
Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim

ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang telah

dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya

T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah

terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh

E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan

ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan

nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak

pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA

Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

 Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase.

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi menggabungkan fragmen DNA yang

telah dipotong dengan enzim restriksi dengan fragmen DNA vector. DNA insert

(fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian

pemotongan DNA vector, sehingga keduanya dapat saling berkomplemen.

Terdapat dua jenis enzim ligase yang dihasilkan oleh Escherichia coli, diantaranya

T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah

terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh

E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan

ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu dengan

nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak

pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP sedangkan pada E.coli DNA

Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).

 Enzim ligase hanya dapat menggabungkan fragmen DNA yang

mempunyai ujung tidak rata (sticky end) yang saling berkomplemen dan

ujung rata (blunt end). Enzim ligase mengkatalisasi pembentukan ikatan

kovalen antara gula dengan phosphate dari nukleotida yang berdekatan,

yang menghendaki satu nukleotida mempunyai ujung 5’ phosphate bebas

dan nukleotida yang berdekatan mempunyai ujung 3’gugus hidroksil.

Enzim ligase tidak membedakan DNA‐DNA dari organisme yang berbeda.

Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun dapat

digabungkan oleh enzim ini. Kedua fragmen ini kemudian menjadi satu

molekul DNA yang disebut sebagai DNA rekombinan. DNA rekombinan

ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya

di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai transformasi atau cloning

gen (Barnum, 2005).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen.

Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang

kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu

purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan

guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava

dkk.2004:219).
DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut
dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk
hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah:
1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup
(Sadava dkk.2004:220).
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan
molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu
fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).
DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan
pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan
sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan
bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis
(Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai pada organisme prokariotik.
DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid. Plasmid
merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri, tetapi
penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya.
Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu
pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga
mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai
dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi (Pierce2005:203).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya
ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah,
yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk.
2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan
suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).
Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan
DNA. Prosedur ini melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya
≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan gula deoksiribosa dan karena itu
spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan dikonversi ke
w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk
menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan
mengukur intensitas absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan
membandingkan dengan kurva standar konsentrasi DNA diketahui. Mengukur
intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260
dan 280 nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm,
sebuah sampel DNA murni memiliki rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari
kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang terkontaminasi dengan protein
akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.
DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi,
menjalankannya pada gel agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda
yang berbeda dan membandingkan intensitas DNA dengan penanda DNA
konsentrasi dikenal.
Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa
lebih lanjut menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan
diferensiasi diulang dalam urutan genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan
forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan analisis.
Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA
dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel,
pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA
dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya
senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat
menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah,
maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang
berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam
ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane
sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein
dan lemak pada membrane membentuk senyawa “lipid protein-deterjen
kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki
ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat
membentuk suatu ikatan kimia. KIRSMAN83.2010.isolasi DNA
Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel
yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka
[2]
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan
gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan
gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E
adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA
 Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV
Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai
fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah
ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi
sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam
untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan
medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih
besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan
menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

1.3 Metode Kerja

Isolasi DNA Tanaman
Alat :
 mikrovivet berbagai ukuran
 tabung 1,5 ml
 tips mikropipet berbagai ukuran
 saringan
 gelas kimia
 sendok
 penangas
 vorteks
 mini sentrifuga
 blender / lumping
Bahan :
 buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl,
CTAB 2%)
 Potasium asetat 5 M
 SDS 20%
 Kloroform : Isoamil alcohol (24:1)
 Alkohol 100% (pa)
 TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8)
 Buah strowberi
 CTAB 2%
Elektoforesis DNA
Range pemisahan molekul DNA dengan agarose gel
Agarose % Seaparsi optimal dari
molekul DNA (Kb)
0,3 5,0-60
0,6 1,0-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7,0
1,2 0,4-6,0
1,5 0,2-4,0
2,0 0,1-3,0

Bahan kimia :
 Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 )
 Eidium bromida
 Loading buffer
 DNA Marker
 Agarose
Alat dan bahan :
 Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray)
 Power suply
 Mikropipet digital
 Transilluminator UV
 BAB II
HASIL PENGAMATAN

Tabel 1. Hasil Pengamatan Isolasi DNA

Foto Hasil Pengamatan Keterangan

Setelah sentrifuge kedua

dengan kecepatan 14000rpm selama
10 menit.

Warna merah muda

Sampel di homogenkan
dengan cara dibolak-balik
sebanyak 50x

Setelah di sentrifuge
dengan kecepatan 14.000 rpm
selama 10 menit

Larutan Bening

DNA
Tabel 2. Pengamatan Hasil Elektroforensis DNA
Foto Hasil Pengamatan Keterangan

Tambahkan loading
dye kedalam sampel dengan
perbandingan 5 bagian sampel
DNA dan 2 bagian Loading
dye.

Sampel dimasukkan ke dalam

sumur yang terdapat dalam gel, alat
siap dipasang dan disambungkan ke
sumber listrik( elektroforesis pada
daya 100 volt selama 30 menit )
 Fragmen DNA yg
sempurna, karena tidak terurai

Kontrol fragmen-fragmen
DNA

Fragmen DNA yang banyak

terurai dan kurang sempurna

PERTANYAAN DAN JAWABAN

Isolasi DNA
1. Hitung jumlah senyawa yang dimasukka pada tahapan kerja nomer 5, 14
dan 18!
Buffer ekstraksi sebanyak 4 kali volume total sampel = 4 x
Kloroform Isoamil Alkohol sebanyak ½ x volume total sampel = ½ x
Alkohol sebanyak 2 x volume total sampel = 2 x
2. Jelaskan apa fungsi senyawa-senyawa yang digunakan dalam isolasi DNA !
Buffer ekstraksi berperan dalam proses destruksi jaringan tanaman sehingga
terjadi degradasi pada DNA.
SDS berfungsi sebagai detergen yang dapat melisis dinding sel dan
mendenaturasi protein.
 Kloroform Isoamil Alkohol membantu proses denaturasi protein yang masih
menempel pada kromosom.
Alkohol digunakan untuk mempresipitasi asam nukleat.
Elektroforesis DNA
1. Coba sebutkan manakah yang disebut DNA pada hasil elektroforesis
anda !
2. Mengapa DNA hanya dapat diamati dengan bantuan sinar UV ? Jelaskan !
DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena itu untuk
memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium bromida.
Etidium bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan
baru akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.
3. Apakah Etidium Bromide ? Bagaimana cara kerja Etidium bromida dalam
proses pewarnaan DNA ?
Etidium bromida seperti telah disebutkan di atas adalah pewarna yang
digunakan untuk mempermudah pengamatan DNA dalam gel. Etidium
bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru akan
tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.

BAB III
PEMBAHASAN
Isolasi DNA
Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman
strawberry. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama
yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan
mengambil beberapa bagian dagiang buah strawberry yang dihancurkan didalam
tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan
larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi.
Untuk mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman
tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu
dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam
tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan
di atas yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka
akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine
tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam,
seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut
juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga
mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya.
Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang
terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang
berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada
saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA
dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer
ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan
SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding
sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa
inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel
tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan
warna larutan berubah menjadi merah.
Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi
larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan
dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan
debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-
potassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada
kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit.
Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan
ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang
berwarna merah. Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap
selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan
untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya.
Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol
(24:1) yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada
kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol
100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-
pengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan
DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap
tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan
untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi
menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan
DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang
endapan DNA pada dasar tabung.
Pembahasan Elektroforesis
\Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena
dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana,
mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai
kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb
(pasangan basa) sampai 800.000pb.
Selainitu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana
lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan
Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi
dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance
dibawah lampu UV.
Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-
pita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan
kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai
dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan
DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.
 BAB IV
KESIMPULAN

DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan.
Pada praktikum isolasi DNA dari tanaman digunakan jaringan tanaman yang
mengandung sedikit kontaminan, yaitu menggunakan daging buah. Prinsip-prinsip
dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi
DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel
dilisiskan, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
 Dari hasil pengamatan dapat dilihat hasil dari tahap-tahap yang telah
dilakukan. Isolasi DNA telah berhasil dilakukan. Hal tersebut dilihat dengan
adanya benang-benang DNA yang terbentuk. Terbentuknya benang-benang
tersebuut juga merupakan hasil dari proses tahapan-tahapan yang dilakukan
dengan menggunakan larutan senyawa-senya tertentu.

DAFTAR PUSTAKA

Achmmad, Wendy., 2010. Isolasi DNA.

Jusuf., 2010. Laporan Praktikum Rekayasa Genetika DNA Rekombinan,

Labortorium Bioteknologi. ITB.

Wulan Sri, M., 2006. Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman

Untuk Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia. Laboratorium
 Biologi Reproduksi, Jurusan Biologi, FMIPA – UNAIR

http://www.macnature.com/2013/02/isolasi-dna-referensi-terpercaya.html

http://kirsman83.weeb..com/2/post/2013/01/isolasi-dna

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada tanggal 10 Mei 2013)

Lampiran Gambar
Proses Penuangan larutan ke dalam sampel dengan menggunakan
mikropipet

Sentrifuge
 Pipet Ukur

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut

transformasi apabila vector yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut

transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan

plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan

ekspresi gen maka dibawa oleh plasmid tersebut.

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel

telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat
rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transfoman

dan sel non transforman. Sel transforman adalah sel yang tidak membawa DNA

plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang

disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang member

karakterisitik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan

transforman.

Penelitian ini bermaksud untuk mentransformasi gen ke dalam sel inang

Escherichia coli (E.coli) dan plasmid rekombinan, serta dianalisis dengan

elektroforesis.

C. SEL KOMPETEN

Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel

kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari

luar. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel tersebut

kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel

tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman (Lodish et al.). Hasil

yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni E. coli dalam cawan.
 Koloni E. coli tumbuh dalam cawan dengan membentuk koloni

berwarna putih. Sel transforman dikultur pada media dengan ampisilin. Hal ini

sesuai dengan teori yang ada. Sel tersebut mampu tumbuh pada media dengan

ampisilin karena di dalam selnya terdapat plasmid (Lodish et al.). Keberadaan

plasmid di dalam sel E. coli membuat sel tersebut resisten terhadap antibiotik

ampisilin (http:// transformasi-dengan-sel-kompeten.html).

D. TRANSFORMASI GEN ke DALAM SEL INANG

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel

telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat

rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman

dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA

plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA

plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang

disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi

karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan

transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam

medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan

sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang

dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri

transforman saja (http:// pembuatan-sel-kompeten-dan-transformasi.html).

F. ELEKTROFORESIS
 Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang

biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan

pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang

basa (pb).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA

dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui

ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar

ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromide

(http://elektroforesis)

BAB III
METODELOGI PRAKTIKUM

A. Waktu Dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 4-28 maret 2013 dan

bertempat di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Kimia FMIPA

Universitas Haluoleo Kendari.

B. Alat Dan Bahan

1. Alat
 Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung

eppendorf, shaker, water bath, vortex, sentrifuga, gelas kimia, batang

pengaduk, es, Erlenmeyer, pipet mikro, tabung biru, tabung kuning,

aluminium foil, cawan petri, sarung tangan, neraca analitik,

elektroforesis, kawat ose, Bunsen, hot plate, oven, autoklaf dan korek

api.

2. Bahan
Bahan yang digunakan adalah media LB, campuran ligase (Vektor

+ DNA Ligase + gen sisipan), biakan bakteri E. coli ampisilin,

aquabides, es batu, etanol dingin, etanol 70%, larutan lisis I, II, dan III,

alcohol, buffer TAE, I x etidium bromide, CaCl2 75 mM, kloroform,

agarosa, loading dye.