RINGKASAN

1. PRINSIP ISOLASI DNA

a. Pelisisan, merupakan proses perusakan pada dinding sel yang akan diisolasi. Pelisisan
menggunakan buffer.
b. Presipitasi, merupakan proses pemisahan DNA dari debris (sisa sel), protein
mengganggu, RNA. Proses ini menggunakan: proteinase K, RNAse.
c. Pencucian, merupakan proses menghilangkan sisa debris dari tahap presipitasi.
Pencucian menggunakan buffer pencuci dan ethanol absolut.
d. Resuspensi, merupakan proses pelarutan pada pellet DNA dengan menggunakan buffer.
Buffer yang biasa digunakan buffer TE.

2. PRINSIP PCR

a. Denaturasi
 merupakan langkah melepaskan untai ganda DNA menjadi untai tanggal.
 Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda
DNA.
 Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC
 Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi
dari DNA template.
b. Annealing,
 merupakan tahap penempelan suatu primer terhadap DNA target
 annealing tergantung pada panjang untai DNA, banyaknya konten GC, dan
konsentrasi primer itu sendiri.
 Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template.
 Tm = (G+C)x4 + (A+T)x2.
 Temperatur annealing biasanya ± 5ºC Tm
 Tm dipengaruhi oleh komponen buffer, konsentrasi primer dan DNA template.
c. Extension (Elongasi)
 merupakan proses pemanjangan untai baru DNA
 dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA
target
 Akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA.
 Proses pemanjangan DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa
nukleotida yang ditargetkan.
 Pada setiap satu kilobase pair (1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan
waktu 1 menit.
 Sedang bila kurang dari 500bp hanya 30 detik
 pada kisaran 500 - 1kb perlu waktu 45 detik
 namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap
siklusnya
  Adapun temperatur extension (elongasi) berkisar antara 70-72°C.

3. PRINSIP ELEKTROFORESIS

 Elektroforesis adalah teknik untuk memisahkan dan memurnikan suatu asam

nukleat berdasarkan perbedaan ukuran dengan prinsip kerja muatan listrik.
 partikel-partikel bermuatan negatif (DNA) bergerak menuju kutub positif,
apabila dialuri arus listrik pada suatu medium.
 Perpindahan partikel DNA dipengaruhi: ukuran partikel (panjang base pair),
komposisi dan konsentrasi gel agarose, densitas muatan, dan kuat medan listrik.
 Visualisasi DNA pada elektroforesis umumnya dilakukan dengan menggunakan
EtBr (Ethidium Bromida).
 EtBr akan menyisip pada untaian DNA dan merusak double helix sehingga
DNA tidak dapat memanjang lagi dan disisipi partikel lain.

4. PROSEDUR

a. PCR
 DNA hasil Isolasi dihomogenkan (vortex/up and down)
 Disiapkan mix PCR (DNA template/target, DNA polimerase, Primer dan
aquabides/aquades) *konsentrasi DNA template/target menentukan volume masing2
bahan.
 Disiapkan alat thermal cycler
1) Nyalakan tombol power ON
2) Tunggu hingga ready
3) Pilih menu “Programming” “File” “New”
 Directory: Untuk membuat file.
 Program:
- Nama file (contoh: 16S
rRNA)
- Step: masukkan temperatur
dan waktu masing-masing
dari step (tahapan) PCR.
Berikut contohnya:
No Tahapan Temperature Time Cycl
1 Initial denaturasi 95°C 1 menit 1
2 Denaturasi 95°C 15 detik 25-35
3 Annealing 55-59,7°C 10 detik (30)
4 Extension 72°C 10 detik

- Kemudian Save
 Running/menjalankan PCR:
 Pilih menu “programming” “Run” “Start” pilih file
yang akan diamplifikasi “Start Now”
 b. PEMBUATAN GEL AGAROSE
 Timbang agarose dan larutkan dalam TBE/TAE, tambahkan gel red ke dalam larutan.
Kemudian lakukan pemanasan dalam oven agar mempercepat proses pelarutan.
Setelah larut, tunggu hingga agak dingin kemudian cetak gel agarose.
 Konsentrasi agarose tergantung dari Konsentrasi DNA (panjang base pair / ukuran
DNA)
Contoh: DNA ukuran pendek menggunakan kons. Agarose Tinggi.
 DNA ukuran pendek = DNA hasil PCR, DNA ukuran Panjang = DNA hasil isolasi.

c. RUNNING ELEKTROFORESIS
 Masukkan gel agarose pada chamber elfor. Masukkan buffer TBE/TAE hingga
menutupi gel agarose
 Masukkan DNA 5µl + loading dye dan DNA ladder 2µl (penambahan loading dye
tergantung DNA ladder yang digunakan, kadang ada DNA ladder yg sudah memiliki
pewarna)
 Tutup chamber dan sambungkan dengan arus listrik. Pastikan sudah sesuai (kabel
hitam = negatif, kabel merah = positif)
 Tekan tombol ON
 Atur waktu dan voltase (waktu biasanya 30-45 menit, voltase biasanya 120 V). Lama
waktu dan tingginya voltase bergantung dengan konsentrasi gel agarose yang
digunakan dan kons. DNA (DNA hasil PCR > DNA hasil isolasi dalam voltase dan
lama waktunya)

5. TROUBLESHOOTING AND OTHERS

 dna ukuran pendek pake agarose yg konsentrasi gel yg tinggi biar gak loss (lewat dr
gel), begitu pula sebaliknya
 pewarnaan gel bisa pake Etbr, dia masuk menyisip ke dna lalu nanti divisualisasi
dengan fluoresensi, tapi etbr karsinogenik jadi diganti gel red
 PEMAKAIAN TBE UNTUK CHAMBER AGAROSE: BISA 4-5 KALI,
BAGUSNYA SETELAH 3 KALI PEMAKAIAN GANTI BARU
 SEDANGKAN TAE UNTUK CHAMBER AGAROSE: BISA 3 KALI. BAIKNYA
SETELAH 2 KALI PEMAKAIAN GANTI BARU
 Loading dye untuk pemberat sama pewarna (sbg indikator pergerakan dna) biar
kelihatan pergerakan dna di agarose
 Fungsi dNTP: sebagai bahan baku nukleotida dlm proses untai DNA saat
diamplifikasi. Ada 4 macam dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
 Konsentrasi DNA: (absorban 260/absorban 280) x 50 ug
 Konsentrasi RNA: (absorban 260/absorban 280) x 40 ug
 Konsentrasi primer dan vol. Buffer TE yg dibutuhkan (untuk pengenceran primer)
V1.M1 = V2.M2
 Untuk mengetahui Ta optimal: dilakukan gradien suhu. Nilai tengahnya: (Suhu di
jurnal + suhu di formulir reagen)/2. Gradiennya: jarak nilai tengah ke suhu jurnal atau
suhu form