1.

Presipitasi

Presipitasi adalah proses pemisahan partikel non enzim yang bercampur

dengan enzim dengan cara pengendapan.

 Cara kerja Presipitasi

Presipitasi dapat dilakukan dengan penambahan senyawa penggumpal seperti

ammonium fosfat, asam korbat, garam-garam kalsium, sistein, dan serat selulose.

 Kelebihan dan kekurangan presipitasi

- Kelebihan

Sensitivitas dan presisi yang tinggi ,Mudah dikerjakan, Pekerjaannya lebih

cepat dan tidak memerlukan sampel yang besar.

- Kekurangan

Reagen kurang stabil, Memerlukan proteksi terhadap bahan radioaktif

(radioactive hazardous). Contoh pemriksaan : HBsAg,anti HBs,macam-macam
hormone,macam-macam pertanda ganas,dan IgE spesifik

2. Koagulasi dan Flokulasi

Teknik ini baik digunakan sebelum senrtifugasi atau filtrasi. Pada ciran yang
sangat encer, flokulasi terjadi dengan penambahan suatu reagen. Koagulasi
merupakan adhesi spontan antarpartikel bila muatan partikel yang satu dapat
dinetralkan oleh muatan partikel lain. Teknik ini dapat diterapkan untuk pengendapan
sel utuh, pecahan sel, atau larutan protein.

 Cara kerja Koagulasi dan Flokulasi

- Koagulasi dan flokulasi merupakan proses yang terjadi secara berurutan untuk
mentidakstabilkan partikel tersuspensi, menyebabkan tumbukan partikel dan
tumbuh menjadi flok
 - Pertama koagulasi dengan melibatkan netralisasi dari muatan partikel dengan
penambahan elektrolit (koagulan)
- Agregat yang terbentuk akan saling menempel dan menyebabkan
terbentuknya partikel yang lebih besar yang dinamakan mikroflok,
- Pengadukan cepat untuk mendispersikan koagulan dalam larutan dan
mendorong terjadinya tumbukan partikel sangat diperlukan untuk
memperoleh proses koagulasi yang bagus
- Biasanya proses koagulasi ini membutuhkan waktu sekitar 1-3 menit
- Tahap selanjutnya, Flokulasi, disebabkan oleh adanya penambahan sejumlah
kecil bahan kimia yang disebut sebagai flokulan (Rath & Singh, 1997)
- Mikroflok yang terbentuk pada saat proses koagulasi sebagai akibat
penetralan muatan, akan saling bertumbukan dengan adanya pengadukan
lambat dan menghasilkan flok yang lebih besar
- Pertumbuhan ukuran flok akan terus berlanjut dengan penambahan flokulan
atau polimer dengan bobot molekul tinggi
- Polimer tersebut menyebabkan terbentuknya jembatan, mengikat flok,
memperkuat ikatannya serta menambah berat flok sehingga meningkatkan
rate pengendapan flok
- Waktu yang dibutuhkan untuk proses flokulasi berkisar antara 15-20 menit
hingga 1 jam
- Proses koagulasi-flokulasi terjadi pada unit pengaduk cepat dan pengaduk
lambat
- Faktor utama yang mempengaruhi koagulasi dan flokulasi air adalah
kekeruhan, padatan tersuspensi, temperatur, pH, komposisi dan konsentrasi
kation dan anion, durasi dan tingkat agitasi selama koagulasi dan flokulasi,
dosis koagulan, dan jika diperlukan, koagulan-pembantu
- Pemilihan koagulan dan kadarnya membutuhkan studi laboratorium atau pilot
plant (menggunakan jar test apparatus) untuk mendapatkan kondisi optimum.

- Reaksi kimia untuk menghasilkan flok adalah

 Kelebihan dan Kekurangan Koagulasi dan Flokulasi

- Kelebihan
 1. Lebih cepat, efektif dan efisien menghilangkan bahan-bahan limbah dalam
bentuk koloid, dengan menambahkan koagulan. Dengan koagulasi,
partikel-partikel koloid akan saling menarik dan menggumpal membentuk
flok (Suryadiputra, 1995).
2. Memudahkan partikel-partikel tersuspensi yang sangat lembut dan bahan-
bahan koloidal di dalam air menjadi agregat/jonjot (proses sebelum
penggumpalan) dan membentuk flok, sehingga dapat dipisahkan dengan
proses pengendapan
3. Menghilangkan beberapa jenis organisme dalam air
- Kekurangan
1. Alatnya mahal
4. Centrifuge

Metode sentrifugasi merupakan cara pemisahan enzim dari partikel-partikel

lain yang tidak dikehendaki. Semakin kecil partikel, kecepatan sentrifugasi yang
diperlukan semakin besar. Pemisahan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan dan gaya
berat tertentu sehingga sel-sel mikroorganisme mengendap dan supernatant
merupakan cairan yang berisi enzim. Dasar pemisahan secara sentrifuge yaitu:

- Perbedaan antara fasa cair dan padat

- Ukuran partikel,
- Berat jenis partikel,
- Berat jenis bahan cair/larutan,
- Jari-jari sentrifus.

 Cara kerja sentrifugasi

1. Persiapkan larutan yang akan dimurnikan atau dipisahkan
2. Sambungkan centrifuge pada aliran arus listrik
3. Nyalakan centrifuge
4. Buka penutup centrifuge dengan tekan tombol open.
5. Masukan larutan ke dalam gelas tabung centrifuge. Larutan yang
dimasukkan pada setiap tabung haruslah sama ukurannya.
6. Masukkan tiap tabung ke dalam lubang centrifuge. Untuk meletakkan
gelas tabung berisi larutan yang akan dimurnikan, tabung harus diletakkan
secara bersilang berlawanan. Namun hal ini tidak perlu dilakukan jika semua
 lubang pada centrifuge terisi penuh oleh tabung larutan yang akan
dimurnikan.
7. Tutup kembali penutup centrifuge
8. Set atau atur waktu yang diperlukan dan tentukan pula kecepatan
rotasi putaran (Rpm) yang diinginkan.
9. Tekan tombol on untuk memulai memurnikan larutan
10. Setelah pemurnian selesai, tekan tombol open dan ambil semua larutan
dalam tabung yang telah dimurnikan dengan cara mengambilnya secara
berseling berlawanan pula.
 Kelebihan dan kekurangan
- Kelebihan
1. Merupakan metode awal yang digunakan pada bioseparasi setelah filtrasi.
2. Metode sentrifugasi lebih efisien dibandingkan dengan filtrasi.
3. Jenis sentrifugasi dapat disesuaikan dengan produk yang ingin dihasilkan.
- Kekurangan
1. Instalasi peralatan lebih mahal dibandingkan dengan filtrasi.
2. Hanya bisa digunakan dalam skala kecil.

5. Filtrasi

Filtrasi merupakan pemisahan padatan dari sejumlah larutan melalui sebuah

penyaring sehingga paertikel padat akan tertahan di penyaring tadi. Kecepatan aliran
cairan yang melewati penyaring bergatnung pada perbedaan tekanan, hambatan oleh
materi, kekentalan cairan, dan hambatan oleh lapisan yang sudah terbentuk. Hal ini
menyebabkan keefektifan penyaringan yang mula-mula tinggi menurun drastis
dengan semakin banyaknya materi yang tersaring. Biasanya digunakan tanah
diatomae yang membantu menahan partikel-partikel halus untuk mengatasi masalah
tadi.

Penyaring yang biasa dipakai merupakan filter press dan rotary drum filter.
Filter terdiri dari kain saring yang terletak di antara dua piringan berombak. Piringan
tersebut akan menahan cairan di dalam kain saring dan keluar melalui pori-pori kain
saring. Rotary drum filter juga menggunakan tekanan dan perputaran tong akan
membantu mengurangi akumulasi endapan pada penyaring. Dasar pemisahan adalah
ukuran partikel. Efisiensinya dibatasi oleh:

- Bentuk partikel
- Kemampuan partikel menahan tekanan
- Kekentalan fasa cair
 Cara kerja Filtrasi
- Cairan yang akan difltrasi dialirkan ke dalam wadah RVF
- Rotary drum filter diputar dengan kecepatan rendah ± 0,1 s/d 2 rad/mm untuk
mengaduk lumpur
- Cairan yang ada di wadah RVF dihisap oleh rotary drum melalui filter yang
ada di permukan drum
- Cairan akan melewati pipa-pipa internal yang ada di dalam filter drum dan
dikumpulkan di pipa pengumpul
- Padatan akan tetap berada di permukaan drum yang akan dibersihkan oleh
pisau horizontal
 Kelebihan dan Kekurangan Filtrasi
- Kelebihan :
1. Dapat digunakan untuk memfiltrasi padatan yang sulit difilter.
2. Banyak dilengkapi sarana otomatis
3. Desainnya sangat bervariasi
4. Hasil pencucian cake lebih efektif
- Kekurangan :
1. Waktu pengeringan cake cukup lama.
2. Pemisahan filtrat relatif lebih
6. Kromatografi

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran yang ada di dalam sampel
di antara dua fase, yakni fase diam (padat atau cair) dan fase gerak.
Pemisahan enzim dari protein lain dapat dilakukan secara kroma-tografi kolom
dengan prinsip kerja pemisahan protein berdasarkan sifat fisik dan kimiawi.
Berdasarkan mekanisme kerja tersebut, Stanburry dan Whitaker (1984) membagi
teknik kromatografi kolom dalam beberapa kelompok, yaitu: kromatografi penukar
ion, interaksi hidrofobik dan kroma-tografi filtrasi gel seperti uraian berikut.

a. Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion merupakan metode pemisahan berdasar-kan

muatan molekul di bawah kondisi pH dan kekuatan ion tertentu. interaksi
elektrostatik dari berbagai jenis ligan bermuatan pada matriks dengan gugus yang
dapat berionisasi pada protein akan menimbulkan mekanisme pemisahan. Penukar
anion yang bermuatan positif dipilih untuk mengikat molekul asam, sedangkan
penukar kation yang bermuatan negatif memberikan mekanisme pemisahan untuk
molekul bersifat basa. Karena enzim memiliki aktivitas, maka sebelum dilakukan
pemisahan dengan metode tersebut terlebih dahulu diketahui pH optimum enzim,
sehingga aktivitas enzim tetap dapat dipertahankan (Standburry dan Whitaker,
1984; Roe, 1989).

Protein memiliki muatan positif dan negatif terutama disebabkan oleh

rantai samping dari asam amino penyusunnya. Muatan positif di-sumbangkan
oleh asam amino histidin, lisin, arginin dan gugus amino dari N-terminal,
sedangkan muatan negatif disumbangkan oleh aspartat, glutamat dan gugus
karboksil pada C-terminal. Muatan bersih protein bergantung pada jumlah relatif
gugus bermuatan positif dan negatif yang bervariasi berdasarkan pH lingkungan.
Tingkat keasaman protein atau enzim dengan jumlah muatan positif dan negatif
sama dikenal sebagai “pH isoelektrik atau titik isoelektrik (pl)”. Pada umumnya
protein memiliki nilai pH sekitar 5,0-9,0. Protein yang memiliki pH di atas nilai
pl akan bermuatan negatif, sedangkan pH di bawah nilai pl akan bermuatan positif
(Standburry dan Whitaker, 1984; Roe, 1989).
 Gambar. Prinsip kerja kromatografi penukar ion (Anonim, 2005).

Prinsip kromatografi penukar ion adalah penggunaan matriks penukar ion

yang mengikat secara kovalen gugus fungsi bermuatan negatif pada penukar
kation, atau gugus fungsi yang bermuatan positif pada penukar anion seperti
terlihat pada gambar 8. Matriks berupa polimer elastis dan mengandung senyawa
resin sintetik yang terbuat dari bahan dekstran: selulosa atau sefadeks. Matriks
penukar kation yaitu karboksimetil selulosa (CMC), dan matriks penukar kation
yaitu dietil aminoetil (DEAE)-selulosa dan DEAE-sefadeks (Standburry dan
Whitaker, 1984; Scopes, 1987).

b. Kromatografi Interaksi Hidrofobik

Kromatografi interaksi hidrofobik merupakan metode pemisahan

berdasarkan perbedaan hidrofobisitas pada permukaan protein. Hal ini bergantung
pada interaksi hidrofobik antara permukaan protein dengan gugus hidrofobik yang
terikat secara kovalen pada matriks (Standburry dan Whitaker, 1984). Pada
kondisi kekuatan ion yang tinggi, protein atau enzim akan terikat kuat pada
matriks melalui interaksi hidrofobik, hal seperti ini dapat terlihat pada gambar
Matriks yang umum digunakan bersifat nonpolar, turunan jenis sefarosa yakni
fenil sefarosa atau butil sefarosa (Roe, 1989; Suhartono, 1989).
 Gambar. Prinsip kerja Kromatografi interaksi hidrofobik (Koelman dan Roehm,
2005)

Suatu campuran protein dimasukkan ke dalam kolom interaksi hidrofobik

dalam kondisi ionik yang tinggi. Pada kekuatan ion yang tinggi protein terikat
kuat pada matriks melalui interaksi hidrofobik. Semakin hidrofobik suatu protein,
maka semakin kuat ikatannya. Protein yang terikat pada matriks dapat terlepas
jika dielusi dengan eluen yang kekuatan ionnya semakin menurun yaitu dengan
konsentrasi garam dari tinggi ke yang lebih rendah (Roe, 1989).

c. Kromatografi Filtrasi Gel

Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro

molekul biologi lain berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu
penyaring molekul seperti terlihat pada gambar 10. Proses pemisahan ini
menggunakan gel yaitu dekstran (polimer gula yang larut dalam air) dan
mengalami reaksi ikatan silang (cross linkage) sehingga dekstran menjadi tidak
larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul air dalam molekulnya
(Scopes, 1987).

Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi di
dalamnya. Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks, misalnya
sefadeks G-50. Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks tersebut dapat
dikembangkan (Swelling) dengan air atau larutan penyangga dengan besar
pengembangnya 50 kali (Scopes, 1987). Gel atau matriks ini berpori yang
 dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair mobil. Molekul yang lebih
kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih lambat, sedangkan
molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak tertahan di dalam
pori matriks. Dengan demikian kromatogram molekul-molekul yang lebih besar
akan muncul sebagai komponen awal seperti terlihat pada gambar

Gambar. Prinsip kerja kromatografi filtrasi gel

 Cara Kerja Untuk Kromatografi Kolom

 Pengemasan Kolom

Pengemasan kolom adalah salah satu faktor penting untuk untuk

mempeoleh hasil pemisahan yang baik. Ada 2 cara pengemasan kolom (packing)
dalam kromatografi kolom gravitasi, yaitu:

 Metode basah

Adsorben dicampur dengan pelarut, kemudian campuran dimasukkan

ke dalam kolom. Keuntungan dari metode ini adalah gelembung udara dapat
dihilangkan dari kolom. Contoh: kolom diisi dengan pelarut non polar seperti
 hekasana kira-kira setengah dai tinggi kolom gels. Ditimbang sebnyak 8 gram
alumina dalam gelas piala sementara erlenmeyer 125 diisi 15 ml heksana.
Dengan perlahan serbuk alumina ditambahkan sedikit demi sedikit sambil
diaduk. Gunakan pipet pasteu untuk membut bubur, kemudian dengan cepat
bubur tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalm kolom. Tempatkan erlenmeyer
di bawh kolom kemudian buka screw clamp dan biarkan pelarut mengalir.
Teruskan penambahan bubur alumina sampai habis, jangan lupa penambahan
pelarut heksana terus dilakukan dan pelarut heksan yang keluar dapat
ditampung dan digunakan kembali untuk packing/menambah lagi alumina ke
dalam kolom. Jika packing sudah selesai, screw clamp ditutup, tinggi cairan
minimal sma dengan tinggi alumina. Kadang-kadang pasir juga ditmbahkan
pda puncak kolom untuk mencegah dari gangguan saat pelaut baru
ditambahkan.

 Metode kering

Metode ini lebih mudah tapi dapat menimbulkan adanya gelembung

udara dalam kolom. Gelembung udara ini harus dihindari, karena akan
mengurangi resolusi dari pemisahan. Contoh: Bagian dasar dari kolom diisi
dengan glass woll secukupnya. Pinch clamp ditutup dan kolom diisi dengan
pelrut. Masukkan 8 gram alumina ke dalam kolom gelas yang berisi pelarut
dan biarkan pelarut mengalir. Pinch clamp ditutup jika packing sudah selesai
dan tinggi pelarut minimal sama dengn tinggi alumina. Demikian juga hindai
agar kolom tidak kering.

Pebandingan antara volume total kolom (cair+padat) dengan diameter

kolom yang optimal agar dipeoleh pemisahan yang baik, sulit dinyatakan
secara tepat dan ini dilakukan secara coba-coba secara sistematis. Secara
umum, hanya dapat dinyatakan bahwa kemasan kolom yang panjang akan
memberikan tingkat pemishan yang tinggi dan kolom yang lebar adalah baik
 untuk memisahkan komponen-komponen dalam jumlah besar. Jenis fase diam
yang digunakan adalah silika gel dan alumina.

 Aplikasi sampel dan Proses Elusi

Sebelum sampel dimasukkan ke dalam kolom, pelarut dikeluarkan

sedemikian rupa hingga cairan di atas fase diam hmpir kering. Smpel dimasukkan
pada bagian atas dari fase diam dengan bantuan pipet tetes. Sejumlah kecil
pengelusi (fase gerak) digunakan untuk mencuci sissa sampel dalam wdah sampel
dan selnjutnya dimsukkan ke dalam kolom.

Setelah sampel dimasukkan, biasanya ditambah lagi eluen sedemikian

rupa hingga ketinggian fase gerak di atas fase diam 5-10 cm. Selanjutnya,
hubungkan dengan wadah fase gerak (proses elusi dilakukan) dan alirkan
pengelusi sedemikin rupa sehingg ketinggian cairan di atas fse diam
dipertahankan. Proses elusi dilakukan sampai komponen yang diinginkan keluar
dari kolom.

 Pengumpulan Fraksi

Pengumpulan fraksi dapat dilakukan secara manual dengan menggunakan

tabung reaksi yang sebekumnya diberi tanda sesuai dengan volume yang
diinginkan atau pada waktu tertentu yang ditetapkan sebelumnya. Pengumpulan
ini dapat juga dilakukan secara otomatis dengan bantuan kolektor fraksi. Jika
tidak ada prosedur tentang jumlah tiap fraksi yang harus dikumpulakn maka
biasanya diambil pendekatan yakni 2-5% dari volume total (cair+padat).

 Deteksi Komponen

Deteksi komponen dapat dilakukan dengan teknik analisis seperti cara-

cara spektoskopi, KLT, dsb.
 Kelebihan dan Kekurangan Kromatografi Kolom
 Kelebihan:
- Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
- Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
- Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
 Kekurangan:
- Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
- Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)

5. Distorsi.
 Cara kerja enzim dari distorsi mekanik dan non mekanik yaitu:
- Pencernaan Mekanik
Pencernaan mekanik yaitu proses mengubah makanan dari ukuran
besar menjadi lebih kecil dengan bantuan alat-alat pencernaan. Alat yang
membantu pencernaan mekanik seperti gigi, lambung, usus. Gerakan gigi seri
memotong makanan, gigi taring merobek makanan, gigi geraham mengunyah
makanan serta lambung dan usus melakukan gerakan meremas makanan
merupakan pencernaan mekanik.
Pada pencernaan mekanik umumnya tidak mengubah susunan molekul
bahan makanan yang dicerna. Pencernaan mekanik menjadi lebih mudah
karena adanya saliva (air ludah) dan getah lambung. Pencernaan mekanik
dibantu oleh gerakan saluran pencernaan seperti gerakan peristaltik, gerak
segmentasi dan gerak ayun (pendular). Gerakan-gerakan ini memungkinkan
makanan di dorong, kemudian diremas dan dicampur dengan enzim
pencernaan (pengadukan).
- Pencernaan Non mekanik
Pencernaan makanan secara kimiawi terjadi dengan bantuan zat kimia
tertentu. Enzim pencernaan merupakan zat kimia yang berfungsi memecahkan
molekul bahan makanan yang kompleks dan besar menjadi molekul yang
lebih sederhana dan kecil. Molekul yang sederhana ini memungkinkan darah
dan cairan getah bening (limfe) mengangkut ke seluruh sel yang
membutuhkan.
 Secara umum enzim memiliki sifat: bekerja pada substrat tertentu,
memerlukan suhu tertentu dan keasaman (pH) tertentu pula. Suatu enzim tidak
dapat bekerja pada substrat lain. Molekul enzim juga akan rusak oleh suhu
yang terlalu rendah atau terlalu tinggi. Demikian pula enzim yang bekerja
pada keadaan asam tidak akan bekerja pada suasana basa dan sebaliknya.

Macam-macam enzim pencernaan yaitu :

1. Enzim ptialin
Enzim ptialin terdapat di dalam air ludah, dihasilkan oleh kelenjar ludah.
Fungsi enzim ptialin untuk mengubah amilum (zat tepung) menjadi glukosa.
2. Enzim amilase
Enzim amilase dihasilkan oleh kelenjar ludah (parotis) di mulut dan kelenjar
pankreas. Amilum sering dikenal dengan sebutan zat tepung atau pati.
Amilum merupakan karbohidrat atau sakarida yang memiliki molekul
kompleks. Enzim amilase memecah molekul amilum ini menjadi sakarida
dengan molekul yang lebih sederhana yaitu maltosa.
3. Enzim maltase
Enzim maltase terdapat di usus dua belas jari, berfungsi memecah molekul
maltosa menjadi molekul glukosa.
4. Enzim pepsin
Enzim pepsin dihasilkan oleh kelenjar di lambung berupa pepsinogen.
Selanjutnya pepsinogen bereaksi dengan asam lambung menjadi pepsin.
Enzim pepsin memecah molekul protein yang kompleks menjadi molekul
yang lebih sederhana yaitu pepton.
5. Enzim tripsin
Enzim tripsin dihasilkan oleh kelenjar pancreas dan dialirkan ke dalam usus
dua belas jari (duodenum). Asam amino memiliki molekul yang lebih
sederhana jika dibanding molekul pepton.
6. Enzim renin
 Enzim renin dihasilkan oleh kelenjar di dinding lambung. Fungsi enzim renin
untuk mengendapkan kasein dari air susu.
7. Asam khlorida (HCl)
Asam khlorida (HCl) sering dikenal dengan sebutan asam lambung,
dihasilkan oleh kelenjar didalam dinding lambung. Asam khlorida berfungsi
untuk membunuh mikroorganisme tertentu yang masuk bersama-sama
makanan.
8. Cairan empedu
Cairan empedu dihasilkan oleh hati dan ditampung dalam kantong empedu.
Empedu mengandung zat warna bilirubin dan biliverdin yang menyebabkan
kotoran sisa pencernaan berwarna kekuningan. Empedu berasal dari rombakan
sel darah merah (erithrosit) yang tua atau telah rusak dan tidak digunakan
untuk membentuk sel darah merah yang baru. Fungsi empedu yaitu memecah
molekul lemak menjadi butiran-butiran yang lebih halus sehingga membentuk
suatu emulsi. Lemak yang sudah berwujud emulsi ini selanjutnya akan dicerna
menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana lagi.
9. Enzim lipase
Enzim lipase dihasilkan oleh kelenjar pankreas dan kemudian dialirkan ke
dalam usus dua belas jari (duodenum). Molekul lipid tidak dapat diangkut
oleh cairan getah bening, sehingga perlu dipecah lebih dahulu menjadi
molekul yang lebih kecil. Enzim lipase memecah molekul lipid menjadi asam
lemak dan gliserol yang memiliki molekul lebih sederhana dan lebih kecil.

Mekanisme cara kerja enzim dapat dijelaskan melalui alur berikut:

1. Menciptakan lingkungan yang transisinya terstabilisasi untuk menurunkan

energi aktivasi, misalnya dengan cara mengubah substrat.
2. Meminimalkan energi transisi dengan membuat lingkungan reaksi
terdistribusi muatan berlawanan dan tanpa mengubah bentuk substrat sedikit
pun.

3. Melalui pembentukan lintasan reaksi alternatif.

4. Menggiring substrat ke orientasi yang tepat untuk bereaksi dengan

menurunkan entropi reaksi.