Pendahuluan Kata terpenoid mencaku istilah ini digunakan semua senyawa tumb semua terpenoid Bera CH, dan kerangka karbon: atau lebih satuan Cy ini. Ke . beberapa golongan b ’ Terpenoid p scjumlah besar senyawa tumbuhan, dari untuk menunjukkan bahwa secara biosintesis wuhan itu berasal dari senyawa yang’ sai Jadi, al dati olekul isoprena” CH, =C(CH, ) CH= mya dibangun oleh penyambungan dua raudian senyawa itu dipilah-pilah menjadi erdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam Senyawa tersebut; dud (Cio), tiga (Cis), pat (Cyo), enarn (C39), atau delapan (C4.) satuan. Terpe senyawa, mulai dari kom dan seskuiterpena yan; yang Tebih suka men; menguap, yaitu triterpen: tenoid’ (Cjo). -Masing-masing penting, baik pada pertumbu ekologi tumbuhan. : ponen minyak ig mudah menguap (Cyo dan C,;), diterpena guap (C20); id “dans: er beberapa_macam i, yaitu monoterpena sampai ke senyawa yang tidak terol (C39), serta pigmen karo- golongan terpenoid itu {tabel 3:1) than dan m bolisme maupun pada +7 Golongan utama terpenoid tumbuhan Jumbah satuan . Jumbh Rie kerbon Golongan Jenis utama dan sumbernya 1 Cs isoprena dideteksi dalam daun Hamamelis japonica 2 Cio monoterpenoid _monoterpena dalam minyak atsiri tumbuhan (misalnya mento! dari Mentha) monoterpena lakton (misalnya nepetalakton) tropolon (dalam kayu Gymnospermae) 3 Crs setkuiterpenoid _seskuiterpena. dalam minyak atsiri seskuiterpena lakton (terutama dalam Compisitae) absisin (misalnya asam absisat) 4 Gio. diterpenoid asam diterpena dalam damar tumbuhan siberelin (tnisalnya asam giberclat) 6 fom triterpenoid sterol (misalnya sitosterol) A, triterpena (misalnya s-amirin) seponin (misalnya yamogenin) elikosida jantung 8 Gao tetraterpenoid "_karotenoid* (misalnya @-Karotena) n Gr Poliisoprena karct, misalnya dalam Heviea brasiliensis * Karotenoid Cso dikenal dalam beberapa bakteriaSecara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan. Kadang-kadang minyak atsiri ter- kelenjar khusus pada permukaan daun, sedangkan dapat di dalam sel_kele karotenoid terutama berhubungan dengan Kloroplast di dalam’ daun. dan dengan kromoplast di dalam daun bunga (petal). Biasanya ter- penoid diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan memakai eter minyak bumi, eter atau. kloroform, dan dapat dipisahkan secara/ kromatografi pada silika gel atau alumina memakai pelarut di atas. Tetapi, sering kali ada kesukaran sewaktu mendeteksi dalam skala mikro karena semuanya (kecuali karotenoid) ‘tidak berwarna dan tidak ada pereaksi kromogenik semesta yang peka. Sering kali kita harus mengandalkan. cara’ deteksi, yang. nisbi tidak khas-pada pelat KLT, yaitu penyemprotan dengan asam sulfat pekat, diteruskan dengan pemanasan. aceSudah banyak dan bermacam-macam peran terpencid tumbuhan yang diketahui. Sifatnya yang dapat mengatur pertumbuhan sudah terbukti, dua dari golongan utama pengatur tumbuh ialah seskui- terpenoid absisin dan giberelin yang mempunyai kerangka dasar diterpenoid." Kita sudah’ ‘méngetahui pentingnya karotenoid untuk warna tumbuhan dan sudah pasti terpenoid Co ini terlibat pula Sebagai ‘pigmen pembantu pada fotosintesis. Bagaimana pentingnya mono-dan’ seskuiterpena bagi. tumbuhan untuk memberi.bau dan wangi_yang Khas sudah diketahui. Umumnya masih belum banyak yang diketahui mengenai peranan terpeaoid pada antaraksi tumbuh- an dengan hewan, misalnya sebagai alat komunikasi dan pertahanan pada ‘serangga, namuin bidang ini sekarang sudah menjadi lapangan penelitian yang aktif. Akhirnya, patut disebutkan terpenoid 'tertentia yang. tidak menguap telah diimplikasikan sebagai hormon kelamin pada fungus. ae Geraniol Linaloot Mirsena SS Monosiktike OH " ‘ “= &—Terpineol_. Liménena TerpinolenaOw ARS ‘OH < ZA Mentol U~ Menton Karvon 2 0 Bisiklik @—Pinena Tujon 0? —Karena Kamfor Fenkon ‘Sccara kimiia, sepérti monoterpena, seskuiterpena dipilah-pilah ber- 200°C). Pertama- j2m#, monoterpena dapat dipilah lebih lanjut menjadi tiga golongan, bergantung pada apakah’struktur Kimianya asiklik (misalnya geraniol), monosiklik (misalnya limonena), atau bisiklik (misanya a-dan 6. pincna),—— Asiktik = HOCH, a Farnesol SS ~~ Monosiklik, : “OH ] Cae eH s Asam absisat 7—Bissbolena @—Kadinena B—Selinena Sp" 90 Kariofilena KarototSeskuiterpena lakton © e 2 O .Xantinin Santonin Rumus seskuiterpenoid * Cara yang dianjurkan untuk mono-dan seskuiterpena Kromatografi lapi¢ tipis (KLT) Walau pun ada radas KGC, KLT tetap berguna pada setiap tahap i isis itu. Bila, ki hadapi seskuiter- dan analisis terpena’ itu. Bil ‘a, kiza meng) $e cae renege iriannya rendah, mufigkin KLT imerupakan cara ae .. i eterna ngan ilika gel kan penjerap yang paling banyak digunakan den ee peer aes kloroform, benzena-kloroform (1 : 1), aaa benzena—etil asetat (19 : 1). Untuk analisis terpena yang me- ngandung oksigen (misalnya karvon) lapisan silika gel jangan diaktif- kan dulu sebelum dipakai karena air yang ada membantu pemisahan. Terpena alkohol paling baik dipisahkan inemakai pelat yang dibacem dengan parafin, dengan pengembang metanol 70%. Pelay slike gel Yo § Selah diaktifkan harus dieelupkan dulu ke dalam larutan parafin 5% dalam eter minyak bumi selama satu menit, kemudian dibiarkan Tnssting sebelum dipakai. Pengembangnya, metanol 70%, hare dijenuhkan juga dengan minyak parafin, Modifikasi lain, untuk memisahkan terpena_berdasarkan jumlah ikatan rangkap jialah menggunakan ‘pelat KUT" silika gel yang waktu Penyaputannya menggunakan bubur silika gel yang dibuat dengan larutan 2,5% AgNO; dalam air, sebagai pengganti air. Pengembang yang digunakan untuk pelat silika gel- AgNOs ialah metilena klo- rida—Kloroform—etil asetat—n- ropanol (45 : 45: 4,5: 4,5). Gera umum detcksi ialah menyemprot dengan larutan KMnO, 0,2% dalam air, antimon klorida dalam kloroferm, H, SO, pekat, atau yanilin-H, SO, . Pereaksi terakhir dibuat segar dengan menambahkan 8 ml etanol, sambil didinginkan, ke dalam 0,5 g vanilin dalam 2 ml MSO, pekat. Sctelah disemprot, pelat dipanasken pada 100—105°C sampai pembentukan warna sempurna. Ada Pereaksi yang lebih mempunyai ikatan rangkap (udp brom) dan terpena yang mempungai gugus keton (24-dinitro- fenilhidrazin). Tanggapan beberapa terpena ucvare tethadap pereaksi deteksi terlihat pada tabel 3.3.Tabel 3.3 Deteksi Monoterpena pada pelat kromatograpi lapis tipis. Tanggapan terhadap uji* Terpena uv Brom 2,4-DNP —H, $0, pekat Limonena = + - coklat Q-Pinena = + a coklat Pulegon + + + kuning Geraniol = + - lembayung Karvon + + + merah jambu -Simena + = eo = @-Terpineol - + hijau 1,8-Sineol - - - hijau ; Keterangan : UV: periksa dengan sigar UV pondcky Brom semprot dengan larutan fluoresein {2.08% dalarh alr, pelat diuupi beom, -bercak kyining pads lee belakang merah; 2,4—DNP: peeerot dengan tarytan”2,4-DNP 0,4 ¢ dalam 190 at HCI 2M, bercak kuning pada Jatar Pelakang putin; H,SO, pekat: semprot dengan H, SO," pekat dan panagkan pelat pada 100°C selama to menit, 3.2.3 Percobaan laboratorium (2) Minyak atsiri biji Umbelliferae Banyak buah Umbelliferae berbau khas yang discbabkan oleh ada rasa (misalnya mungsi, Carum carvi) atau dalam obat untuk meng- obati penyakit kronis yang ringan (misalnya adas, Anethum graveo. agak: berbeda; misalnya bau wortel disebabkan cleh 2-nonenal, suatu Gina gurunan hidrokarbon sederhana, Cara KLT sederhene dapat dipakai untuk mengidentifikasi komponen utame dari sejumlah buah Umbelliferac. Buah tersebut mudah diperoleh ai Pasar atau penjual Piji-bijian, schingga percobaan ini menjadi percobaan yang menarik bagi mahasiswa untuk mendapatkan Pengalaman dalam mendeteksi monoterpena pada ‘tumbuhan. Cara sederhana ini dapat digunakan pula*untuk mengidentifikasi cuplikan biji yang tak dikenal karena Jenis tumbuhan yang berbeda menghasilkan pula KLT yang berbeda; hal ink sangat penting pada farmakognosi (Berts, 1964),(b) ‘Langkah kerja 1 2 Geruslah beberapa biji menjadi serbuk ‘halus memakai_pasir, lumpang, dan alu. Rendanilah serbuk dengan eter sckurang. kurangnya setengah jam. . Pekatkan eckstrak cter dan totolkan pada pelat silika ge} (rangkap dua). Kembangkan pelat memakai benzena, benzena—kloroform (1 : 1), atau heksana—kloroform (3 : 2) (40-60 menit). Periksalah. pelat yang sudah kering dengan sinar UV, apakah ada bercak gelap, dan bila ada, tandailsh. Semprot satu pelat dengan Pereaksi vanilin—H, SO, dan panaskan Pada 100°C selama-10 menit agar timbul- warna. Seniprotlah pelat kedua dengan pereaksi 2,4-DNP dan perhatikan apakah ada bercak jingga pada latar belakang kuning pucat.Contoh hasil pemeriksaan delapan jenis Umbelliferae diberikan pada tabel 8.5 dan gambar 3.6. Perhatikan bahwa dalam semua cuplikan terdapat minyak lemak yang menghasilkan garis.lengkung pada kira- kira Ry 0,60, tetapi ini tidak mengganggu deteksi terpena. Di samping kandungan utama seperti yang ditunjukkan pada tabel 3.5, kebanyak. an buah mengandung senyawa lain yang R,--nya lebih tinggi atau lebih vendah dari &, kandungan utama: Senyawa yang Rj, -nya lebih tinggi adalah monoterpena hidrokarbon seperti limonena (R,, 0,80), @-felandrena, dan a-pinena. Karena keatsiriannya, kita hanya dapat mendetcksi sesepora saja dari senyawa tersebut.. Senyawa yang Rp - nya ‘Icbih rendah terutama scskuiterpena. Percobaan di atas dapat diperluas dengan mengembangkan pelat ketiga dan mengujinya dengan fluoresein dan brom (tabel 3.3). Suatu hal yang bermanfaat Juga bila disediakan cuplikan biji yang ‘tak dikenal’ untuk mahaciswa dan mercka diminta menentukan kandungannya. Beberapa larutan senyawa pembanding terpena murni dalam eter harus dikromatografi duga, berdampingan dengan cuplikan biji. Akhirnya, harus ditekankan bahwa kadang-kadang terdapat keragaman antar-varietas dalam hal kandungan minyak atsiri dan mungkin saja diperolch hasil yang berbeda, bergantung pada sumber biji. Suatu cara yang berguna untuk KLT minyak’atsiri, diikuti dengan uji kimia pemastian sederhana pada skala mikro telah diikhtisarkan olch Ikan (1969). Ia juga merinci bagaimana memisahkan kandungan minyak cengkeh dan rhinyak jeruk, Citrus, dengan kromatograti kolom pada silika gel. Tabel 3.5 Buah Umbelliferae dan komponen minyak atsirinya® xXx 100) Nama umum Nama latin Kin-kira Komponen Cara deteksi Adas manis Pimpinella anisum — 71 anetol } Jingga, DNP 39 anisaldehida Mungsi Carum carvi 43 karvon jingga, DNP Ketumbar —Coriaridrum sativum 26 inalool merah senduduk, 5 vanilin Jintan Cuminum cyminum 58 kuminaldehida Jingga, DNP Adasanct — Anethum graveolens 42 karvon Jingya, ONP Adas + Foeniculum wuilgare 72 anetol nN Jingga, DNP 38 anisaldehida J Adassowa — Anethum sowa 57 dilapiol coklat, vanilin 41 karvon Jingya, DNP Peterseli Petroselinum crispum.64 apiol coklat, vanilin miristisin coklat, vanilin‘*Pengembang CHCl, —benzena (1 : 1) pada silika gel. Garis awal Cote — Garis depan peels eee Adas manis|—>) (ED) fo Aneto! Mungsi @Q eT Karvon Ketumbar~) O Linalool Adssonet?) §~BOC_? Karvon ins) adwsonal > @ CQO Karvea ~~ ~Bilapiol tee 2 OO Minyak lemak pnaen Penyemprot vanilin.=HaSO, Keterangan warns = Cokin Ox Kelaby yak atsiri dalam biji Umbelli- Gambar 3.6 Pemisahan kromatografi lapis tipis ferae Diterpenoid Di sini akam dibahas tiga kelas diterpenioid: diterpena damar, diterpena racun, dan giberelin. Diterpena damar meliputi senyawa seperti asam abictat dan asam - agatat yang.terdapat dalam damar tumbuhan mutakhir dan tumbuh- an fosil (Thomas, 1970), Di alam senyawa damar ini berfungsi sebagai dalam ‘damar gimnospermae, terutama dalam Pinus. Berbagai damar ‘kopal’ pada tumbuhan kacang-kacangan méngandung sederetan diterpena yang berlainan (Ponsinet dkk., 1968), salah satu contoh ialah asam hardwikat. Sckclompok diterpena racun ialah grayanatoksin, contohnya graya- natoksin-1 (lihat gambar 3.7) yang terdapat dalam den kebanyakan Jenis Rhododendron dan Kalmia. Daun tersebut beracun oleh adanya scnyawa terscbut, . Kelas diterpenoid yang ketiga ialah yang ‘merangsang pertumbuhan secara umum ‘dan diketahui sangat giberelin yang paling dikenal, tetapi sebenarnya lebih dari 66 senyawa * dalam deret ini yang sckarang telah dikenal.) = :02H Fitol ‘Asam sbietat a COzH ie Asam dgatat ~ Asam hardwikat Za IH Me CO2H ote Grayanatoksin. fy Asam giberelat Gambar 3.7 Struktur beberapa diterpenoid3.4 Triterpenoid dan steroid 3.4.1 Kimia dan penyebaran : ‘Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari cnam satuan isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidro- karbon C3 asiklik, yaitu skualena. Senyawa ini berstruktur siklik yang nisbi rumit, kebanyakan berupa alkohol, aldehida, atau asam karboksilat. Mercka berupa senyawa tanwarna, berbentuk kristal, scring kali bertitik lelch tinggi dan aktif optik, yang umumnya sukar dicirikan katena tak’ ada kereaktifan kimianya. Uji yang banyak digunakan ialah reaksi Licberman-Burchard (anhidrida asetat-H3 SO, pekat) yang dengan keb: Kah triterpena dan sterol membcrikan warna hijau-biru. : : Triterpenoid dapat dipilah ménjadi sckurang-kurangnya_ empat golongan scnyawa: triterpena scbenarnya, sicroid, saponin, dan gliko- sida_jantung. Kedua g6léngan yang terakhir sebenarnya’ triterpena afau steroid yang terutama terdapat sebagai glikosida. .” Triterpena tertentu terkenal karena rasanya, Contohnya limonin, suatu senyawa pahit yang larut dalam lemak dan terdapat dalam buah jeruk, Citrus. Senyawa jtu termasuk dalam deret triterpena pentasiklik yang rasanya pahit serta dikenal sebagai limo- noid dan Kuasinoid. Mercka tcrutama terdapat dalam Rutaceac, Melia- terutama kepahitannya. ceae, dan Simaroubaceae, dan dari segi taksonomi kimia sangat mena- tik perhatian (Waterman dan Grundon, 1983). Kelompok triterpena pahit lainnya ialah kukurbitasin; yang terdapat terbatas hanya dalam biji’ berbagai Cucurbitaceae, meski pun dapat juga dideteksi pada suku lain termasuk Cruciferae (Curtis dan Meade, 1971).Sterol adalah triterpena yang kerangka dasarnya sistem cincin siklo- pentana perhidrofenantrena. Dahulu sterol terutama dianggap sebagai senyawa satwa (sebagai hormon kelamin, asam empedu, dan lain-lain), tetapi pada tahun-tahun terakhir ini makin banyak senyawa tersebut yang ditemukan dalam jaringan tumbuhan. Memang, tiga senyawa yang biasa disebut ‘fitosterol’ mungkin terdapat pada setiap tumbuh- an tinggi: sitosterol (dahulu dikenal sebagai B-sitosterol), stigmasterol, dan kampesterol. Sterol umum ini terdapat dalam bentuk bebas dan sebagai glukosida sederhana. Sterol tumbuhan yang kurang umum ialah @-spinasterol, yaitu isomer stigmasterol yang terdapat dalam bayam, Amaranthus alfalfa, Medicago sativa, dan akar Polygala senega. Sterol tertentu hanya terdapat dalar imbuhan rendah, contohnya ergosterol yang terdapat dalam khamir dan sejumlah fungus. Sterol Jain terutama terdapat dalam tumbuhan rendah, tetapi kadang- kadang terdapat juga dalam tumbuhan tinggi, misalnya fukosterol, yaitu steroid utama pada alga coktat dan juga terdeteksi pada kelapa.&—Amirin (R= Me) ‘Asam ursolat (R = CO2H) 1 bt a : ; oo) es Ce ; Ho: cee Kolesterot ° Hg oH i ™ 4 ] Ho, aes Ho Estron oO) Ekdieteronrte HO" ‘Oleandrin Diosgenin Saponin adalah glikosida.‘triterpena dan sterol dan telah terdetcksi ‘dalam lebih dari 90 suku tumbuhan (Tschesche dan Wulff., 1973). Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat_ seperti sabun, serta dapat dideteksi berdasarken kemampuannya membentuk ‘busa dan menghemolisis sel darah. Pencarian’ saponin dalam tumbuh- an telah’ dirangsang oleh kebutuhan akan sumber sapogenin yang mudah diperolch dan dapat diubah dilaboratorium menjadi sterol hewan yang berkhasiat penting (misalnya kortison, estrogen kontra- septif, dan lain-lain). Senyawa yang telah digunakan termasuk heko- genin dari Agave, diosgenin, serta yamogenin dari jenis Dioscorea. Dari segi ekonomi saponin penting juga karena kadang-kadang menimbulkan keracunan pada ternak (misalnya saponin alfalfa, Medicago sativa) atau karena rasanya yang manis (misalnya glisirizin dari akar manis, Glycyrrhiza glabra). Pola glikosida saponin kadang- kadang rumit, banyak Saponin yang mempunyai satuan gula‘sampai lima dan komponen yang umum ialah asam glukuronat. Golongan triterpena terakhir yang akan dibahas ialah glikosida Jantung atau kardenolida. Dari golongan ini pun cukup banyak Senyawa yang telah dikenal, berupa campuran rumit, terdapat ber. samarsama dalam satu tumbuban yang sama. Contoh glikosida penting ialah oleandrin, racun daun Ner‘um oleander, Apocynaceac. Sate siri struktur oleandrin yang luar biasa (lihat gambar 3.8), demikian juga struktur kardenolida laia, ialah adanya penyulih gula khas, yaitu gula yang betul-betul tak terdapat dalam tumbuhan mana pun. Kebanyakan glikosida jantung adalah racun dan banyak yang berkha. siat farmakologi, terutama tethadap jantung, seperti tercermin pada namanya. - Sumber yang kaya akan glikosida jantung ialah anggota suku Scro- phulariaceae, Digitalis, Apocynaceae, Nerium, Moraeeac dan Asclep- iadaceae, “Asclepias. Glikosida jantu sebagai perlindungan “terhadap pe Garrulus glandarius (Rothschild, 1972). Kupu-kupu tidak terganggu oleh ‘racun ini, sebaliknya, bagi burung Pemangsa senyawa ini merupakan penyebab muntah yang hebat. = mangsanya, burung ‘blue Jay’,3.4.2 Cara yang dianjurkan (2), Umum : Semua jenis triterpenoid dipisahkan dengan cara yang serupa, ter- utama didasarkan kepada KLT dan KGC. Identitas dipastikari dengan menentukan titik leleh, putaran opcik,. KGC-SM, spektrum infra. merah, dan RMI. KKt hempir tidak pernah digunakan walau pun dulu_ KKt sangat penting untuk pemisahan steroid (Bush, 1961). Pemisahan dengan KKt kadang-kadang berguna intuk membedakan triterpena glikosida. : :KLT praktis selalu dilakukan pada lapisan silika gel. KLT silika gel- AgNO; (bubur silika gel untuk membuat pelat -disiapkan dengan mengguinakan. larutan AgNO;) digunekan untuk memisahkan triter- penoid takjenuh berdasarkan jumlah ikatan rangkap: terisolasi yang ada dalam, molekul. Lebih dari 50 pcreaksi pendeteksi telah didaftar oleh Lisboa (1969) dan Neher (1969) dalam tinjauan baru mengenai KLT steroid. Dari 50 pereaksi texsebut, yang mungkin paling populer ialah ‘pereaksi eer yaitu larutan antimon Klorida 20% dalam ‘oroform. Pada pemanasan, seiama 10 menit pada 100°C, pelat yang telah disemprot menghasilkan berbagai warna yang. terlihat ngan sinar biasa dan sinar UV. , / : Pereaksi Lieberman-Burchard tclah.disesuaikan untuk KLT dan juga populer. Relat” disemprot dengan campuran H,SO,. pekat 1 ml, anhidrida asetat 20 ml, dan CHCl, 50 ml, lalu dipanaskan pada 85 —95°C selama 15 menit. Di sini pun terjadi berbagai warna yang disebabkan olch triterpena yang berlainan dan kepekaannya sangat baik (2—5 pg). : Uji deteksi Jain yang digunakan ialah uji yang dapat dipakai untuk triterpena -secara umum, misalnya H,SQ,_saja_ atau diencerkan dengan air dan alkohol, yang telah disbutkan detain bagian awal bab ini. Akhirnya, pelarur-yang paling sederhana, yaitu air, dapat dipakai sebagai penyemprot .untuk mendeteksi steroid pada pelat KLT (Gritter. dan Albers, 1962). s : (wy erierpena Pada pemeriksaan triterpena dalam. tumbuhan, pertama-tama jaringan ke harus dihilangkan lemaknya dengan eter, lalu diekstraksi dengan mi Sclanjutnya ckstrak~métanol yang telah dipckatkan dapat ‘diperiksa langsung. Di samping itu harus dilakukan hidrolisis untuk membebaskan zglikon bila ada glikosida, dan hidro- Hisainya juga diperiksa. KLT dilakukan pada silika ‘gel mcmakai pengembang seperti heksana—eiil asétat (I fan Kloroform— metanol (10 : 1), dengan pendeteksi antimon klorida dalam CHCl, . pa campuran titerpena tidak mudah dipisahkan dengan cara ian, misalnya c- amirin dun f-amirin hanya dapat dipisahkan dengan baik bila dikromatografi memaxai n-butanolNH,OH 2M (1: 1), Begitu juga asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat, memerlukan pengembang khusus seperti eter minyak bumi(t d 100 — 130°C)--dikloroctilena—asam asctat (50 : 50 : 0,7) (Rp berturut- turut 75, 50, dan 20), atau eter minyak bumi—etil format—asam format (93 : 7 : 0,7) (Ry 87, 70, dan 20). Saponin dan sapogenin “ ° > * Pembentukan busa yang mantap sewaktu mengekstraksi tumbuhan atau waktu memekatkan ekstrak tumbuhan merupakan bukti teper- ceya akan adanya saponin. Memang betul, bila dalam. tumbuhan terdapat banyak saponin, sukar untuk memekatkan ekstrak alkohol: gic dengan baik, walau pun digunakan penguap putar. Karena itu,.4ji ‘Saponin’ yang sederhana ialah mengocok ekstrak alkohol-air dari “tinibithan dalam tabung reaksi dan diperhatikan apakah ada terbentuk biisa tahan lama pada permukaan cairan. Saponin dapat juga diperiksa dalam ¢kstrak kasar berdasarkan kemampuannya menghemolisis sel darah. Tetapi, biasanya lebih baik bila uji scderhana itu dipastikan dengan cara KLT dan pengukuran spektrum Untuk “aji sapogenin,\jaringan kering harus dihidrolisis dengan HCl 1 M sélama 2—6 jam, lalu dinetralkan, dan sételah bahan padat itu dikeringkan, diekstraksi dengan eter minyak bumi. Ekstrak diuapkan sampai kering dan sisanya dilarutkan dalam Kloroform. Setclah itu ditentukan spektrum inframerahnya (Brain dkk., 1968). Larutan tersebut dipekatkan, lalu dikromatografi lapis tivis pada smemakai pengembang seperti ascton—heksana (4 +1), kloroform— Karbon tetraklorida—aseton (2 : 2 : 1), atau salah satu pengembang yang terdapat pada tabel 3.7. Selanjutnya sapogenin dideteksi berupa bercak merah jambu sampai lembayung setelah pelat disemprot dengan antimon klorida dalam HCI pekat dan dipanaskan pada 110°C selama sepuluh menit. Sapogenin yang berlainan tidak mudah dipisahkan dengan KLT (tabel 3.7). Misalnya, untuk memisahkan diosgenin dari. yamogenin .diperlukan pengembangan sinambung memakai metilena diklorida—eter (4: 1) selama delapan jam (Bennett dan Heftmann, 1966). Saponin jauh lebih polar daripada sapogenin karenz ikatan glikosida- nya, dan lebih mudah dipisahkan dengan KKt atau dengan KLT pada sclulosa. Tetapi,“KLT pada silika gel berhasil juga dengan memakai Pengembang seperti butanol yang dijenuhkan dengan air atau kloro- ° form—metanol—air (18 : 7 : 2;lapisan bawah) (Kawasaki dan Miya- hara, 1963). Tabel 3.7 Angka Ap Sapogenin oo Rr(x100) dalam pengembang Senyawa 1 4 3 en Diosgenin, 55 55 34 Tigogenin 56 55, 29 Smilagenin 62 Cl = -Yamogenin 35 55 - Hekogenin 41 32 19 Gitogenin 16 21 1 ee or Ketcrangan pengembang: 1 CHC1, —Me,CO (4 : 1): CHA, EtAc (1: 1); 3 heksana —Me, CO ( Pemisahan diosgenin dan yamogenin lihat nas,Gukosida jantung Cara yang dipakai bergantung-pada _keruraitan struktur glikosida yang terdapat dalam suatu sumber turnbuhan, Jadi, glikosida jantung Jenis Strophanthus dapat dipisahkan dengan KLT satu arah pada silika gel dengan pengembanglapisan atas til ase tat—piridina—air (5: ). Sebaliknya, pemisahan sekitar 23 kardenolida dalam Digitalis purpu- rea memerlukan KLT dua arah memakai etl asetat—mcetanol— air (16: 1:1) dan kloroform—piridina (6 : 1) (Sjcholm, 1962}. Campur- an yanS lebih sederhana (sampai 15 komponen) dalath Nerium oleander dan Scilla maritima dapat diftaksinasi dengan..KLT partisi memakai metil etil keton—toluena— air—metanol—asanf*dsetat (40 : 5 : 8 : 2,5 : 1). Untuk memisahkan glikosida jantung jenis Asclepias dan glikosida kupu-kupu (kupu-kupu ini memakan glikosida Asclepias ketika masih. berbentuk tempayak), dianjurkan pengembangan ber- ulang pada pelat silika gel dengan Pengembang etil asctat--metanol (97 : 3) dua kali atau derigan pengembang Kloroform—metanol — formamida (90.: 60 : 1) empat kali (Brower ‘dkk., 1982), « Percobaan laboratoriium ws. Hekogenin dari Agave. : Sapogenin ini dapat diisolasi dengan ekstraksi Jangsung dari daun Segar Agave, lalu disabunkan (Ikan, 1969). Senyawa ini penting sebagai sumiber steroid (diperoleh melalui Pengubahan kimi) yang penting pada pengobatan, dan isolasinya secara niaga dilakukan di Mceksiko. Satu kg cuplikan Agave dickstraksi dengan etanol 11,95%. dicuci lagi dengan air, ialu_diuapkan, Sisa dihidrolisis lagi dengan merefluks dalam larutan KOH 10% dalam etanol selama 30 menit._ Setelah didinginkan hekogenin diekstraksi dengan eter yang kemudian diuapkan sampai kering. Hasil dapat dimurnikan dengan aseton (norit) dan harus meleleh pada 256—260°C. Terbentuk senyawa 2,4-fenil- hidrazon’ (jarum jingga), titik leleh 281 282°C. = { Karotenoid : ! Kimia dan penyebaran Karotenoid, yaitu tetraterpenoid C49, merupakan golongan pigmen yang larut-lipid dan tersebar iuas, terdapat dalam semua jenis tumbuh- an, imulai dari bakteria sederhana sampai ke Compositae yang berbunga kuning. Pada hewan, suatu karotenoid khusus, yaitu B-karotena, merupakan makanan yang diperlukan karena ia merupakan sumber vitamin A, yaitu suatu isoprenoid alkohol Cy9. Vitamin A ini diperoleh setclah -karotena tedi mengalami hidrasi dan molekulnya terpecah dua. Rte 1) e—Karotena Likopens a ee. Y—Karotene € —Karotena pyre e Zeaxantin HO" i. Rubixantin: : Lutein, oe os A> 0H S Ie ca | g Se eo HO’ Ho” SS ss Violaxantin 2.3°—Dinidroksiizorenieratena ple ke copskosre GhORIKO, CSA ey Krosin Gambar 3.9 Struktur beberapa katotenoid umumBila kita mengisolasi karotenoid dari sumber tumbuhan tinggi baru, kemurigkinan besar karotenoid *tersebut ialah B-karotena karena Senyawa ini biasanya yang paling umum. Tetapi, dari segi kuantitatif #-karotena tidak sepenting xantofil ‘tertentu. Pembentukan karote- noid dalam tumbuhan diperkicakan 108 ton setiap tahun dan ini ‘erutama mengenai sintesis fukoxantin (terscbar luas dalam alga laut),lutein, violaxantin, dan ncoxantin. Ketiga senyawa terakhir ini dan B-karotena terdapat umum dalam daun tumbuhan tinggi. Sesepora a-karotena, kriptoxantin, atau zeaxantin mungkin juga terdapat dalam fraksi ekstrak daun yang larut dalam lipid. Campuran karote- noid dalam bunga juga merupakan hal yang lazim. Pigmen terscbut sering kali sangat tinggi teroksidasi, yang umum ialah bentuk epoksida, sedangkan karotena hanya terdapat sesepora. saja; tetapi, derajat oksidasi cukup. beragam, bergantung pada jenis tumbuhan. Dalam daun bunga Narcissus tertentu. warna merah hampir_ seluruhnya disebabkan oleh 6 -karotena yang konsentrasinya tinggi (sampai 15% bobot -kering). Akhirnya, dila kita’ mengkaji pigmen. buah, harus diingat bahwa karotenoid asiklik daiam beberapa tumbuhan cenderung menumpuk (misalnya likopena dalam tomat) dan senyawa yang agak khas mungkin ‘disintesis oleh sekelompok tumbuhan khusus (rnisal- ~nya rubixantin oleh jenis Rosa, kapsantin oleh jenis Capsicum, dan sebagainya). z <, Kromatografi Selain kromatografi kelom (Jihat keterangan di atas), yang digunakan untuk mengisolasi karotenoid pada skala besar, cara lain yang dipakai sebagai -gantinya ialah KLT dan KKt. Tetapi, tak ada.satu. Bun penyangga dan pengembang yang dapat dipakai secara waum untuk semua karotenoid. Sebagian besar pilihanbergantung pada kepolaran nisbi senyawa yang akan dipisahkan, dan inilah alasannya mengapa pemisahan fase merupakan pendahuluan yang cocok sebelum KLT. Enam pengembang yang dapat dipakai untuk memisahkan karotena gan xantofil-umum terdapat- pada “tabel 3,8. Mengenai perincian ‘sistem lihat Davies (1976), dan Bolliger dan Koning (1969). Mengenai deteksi pada KLT tak ada masalah karena karotenoid berwarna, tetapi harus diingat bahwa warhanya memudar dengan berjalannya waktu, tcrutama bila’ penjerapnya silika gel. Bila kita nienduga ada prazat karotenoid tanwarna seperti fitofluena, pelat harus diperiksa dengan sinar UV, karena dengan demikian senyawa tersebut dapat dideteksi-berdasarkan fluoresensinya, Eter merupakan pelarut yang cocok untuk mengelusi pigmen dari pelat KLT, tetapi “untuk menghindari cemaran yang larut dalam eter, penjerap KLT harus: dicuci dulu dengan eter sebelum dipakai sebagai bubur untuk melapisi pelat.-Agar senyawa pada pelat dapat diperoleh. kembali semaksimum mungkin ketika karotenoid dielusi setelah KET, maka daerah yang, berwarna harus dikerok dari pelat sebelum pelat me- ngering berul.Tabel 3.8 Kromatedrati lapis tipis karotenoid dan xantofil RpAX100) dalam sistem Pignien 1 2 3 Hidrokerbon @—Karotena 66 80 88 B—Karotera 49 ak 84 7—Karotena un an 45 €—Karotena 70 84 = Likopena o1 13 15 Rp (*100)-dalam sistem 4 5 6 Xantofil : Lutein 10 35. 56 Zeaxantin 05 24 55 Violaxantin os ar 84 Kriptoxantin 54 75 07 Kapsantin 06 16 = Neoxantin = 95 Keterangan sister: 1 MgO yang diaktifkan, eter minyak bumi (id 90-110'C)—C,H, (1? 1}; 2 MgO yang diaktitean, eter minyak bumi (td 50~110°C)—C,H, (1: 9); 3 Siika gel Ca(OHD, (1 = 6), eter ininyak bumi—C,H, (49: 1):4 Magne. slum fostat sek. “ater min/ak ‘bumi (td 40~60°C)—CAM, © © 2): & Shika ‘gel, CH, Ci, ~EOAC (4 : 1); 6 Kinclgur 6 ibacem dengan tartan trigliserida 8%, aseton-MeOH—H 0 GO:Rf karotenoid yang diukur pada pclat KLT beragam. pada sctiap kali pengembangan, tetapi R- pada kromatografi kertas lebih tepercaya' dan dapat terulangkan dalam jangka + 0,01 satuen (Jensen dan Jensen, 1959; Jensen, 1960). Inilah alasannya mengapa KI dapat dipakai pada perincian pigmen alam ini, Kromatografi lingkar dilakukan pada kertas sariryg yang dibacem dengan’ silika, kiselgur, ata alumina, Campuran karotenoid ditotolkan berupa busur dekat titik pusat lingkaran kertas yang bergaris tengah 16 cm, lalu di- kembangkan memakai n-heksana atau n-heksana—aseton selama 20-30 ‘menit. Misalnya, Valadon dan Mummery (1972) mengguna- kan kertas Whatman Chromedia AH81 (kadar Al;03 7,5%) dan SG81 (kadar SiO, 22%) untuk memisahkan a-, B-, dan y-karotena serta likopena (R,- 45, 35, 20, dan 10 pada SG81 memakai n-heksana) dan juga violaxantin, rodoxantin, lutein, zeaxantin, dan neoxantin (Rp 32, 62, 60, 54, dan 0 pada AH81 memakai n-heksana—aseton, 4:1). s wi} Sifat spektrum identifikasi karotena yang meyakinkan didasarkan pada ko-kroma- tografi_ dengan pembanding auientik paling sedikit memakai dua Jenis pengembang, dan pada pembandingan spcktrum tampak paling sedikit dalam dua pelarut. Spektrum karotenoid sangat klias antara 400 dan 500 nm, dua puncak utama di sckitar 450 nm dan bi ada dua puncak tambahan pada kedua, sisi puncak utama (spektrum tampak 6-karotena terlihat pada gambar 3.10), Letak ketiga maksima yang tepat, beragam, bergantungpada pigmennya , dan cukup berbeda isehingga merupakan cara untuk identifikasi, Juga terjadi pergeseran seluruh spektrum, bergantung pada pelarut ~ yang -digunakan, dan inilah alasannyd mengapa dianjurkan mengukur dalam lebih dari dua pelarut. Maksima spektrum dari. kebanyakan karotenoid diberikan pada tabel 3.9, direkam dalam pelarut eter minyak bumi dan kloro- form.. Uji spektrum” yang Berguna untuk 5,6-epoksida, seperti violaxantin, ialah-penambahan HCl 0,1 M ke. dalam larutan etanol. Setelah: tiga menit akan terlihat pergescran spektrum ke panjang jasanya (lihat ‘Isler, 1971)..SM_ terutan memerlukan 0,1 mg cuplikan das Petunjuk yang jelas mengenai struktur.14] 124 10) x10" a tiie = ~ ee ey 300340 380420460500 Bao Panjang geiombang (am) Gambar 3.10 Spektrum sinar tampak dari 8-karotena Tabel 3.9 Spektrum tampak teberapa karotenoid” imum spektrum (nm) dalam * eter minyak bumi Pigmen atau n-heksana Kloroform ee eee Hidrokarbon @-Karotena 422,444,473, B-Karotena 4254,451,482 ‘7-Karotena 437,462,494 €-Karotena 419,444,475, 418,442,471+ Likopena 446,472,505 456,485,520 Xantofil Lutein 420,447,477 428,456,497 Violaxantin =, 448,472 424,452,432 Zeaxantin 428,451,483 429,462,494 Neoxantin, 415,437,466 421,447,477 Rubixantin 432,462,494 439,474,509 . * Fukoxantin 425,450,478 = 457,492 Kriptoxantin 425,451,483 433,463,497 es «untuk. pengukuran spektrum Ialah karbon disulfida, "Data dari Davies (1976). Pela benzena, etancl, + Bahu * Diukur dalam etanol, bukan dalam Kloroform. Pembanding autentik 6-Karotena, kantaxantin, dan krosin (dari safron) digunakan sebagai ~Pewarna makanan dan dapat dibeli di pasaran, Lutein, violaxantin, gan neoxantin dapat diisolasi dari daun‘sebarang tumbuhan tinggi. Likopena dapat diperolch dari tomat dan kapsantin dari cabe. ‘Capsicum (cara isolasi libat Ikan, 1969). _3.5.3 Percobean laboratorium (a) Karotenoid daun Keempat karotenoid yang terdapat'umum dalam jaringan daun dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan cara yang lebih sederhana daripada cara yang telah dipaparkan pada bagian terdahulu. Sebagian cara berikut didasarkan pada percobaan Maroti dan Gabnai (1971). Potongan daun segar (0,25—0,5 g) digerus bersama pasir dan MgCO3 Serta aseton dingin (1 ml) dan eter minyak bumi (t d-60—80°C) (2 ml). Ekstrak ditotolkan berupa garis pada pelat KLT selulosa~ silike gel. G (2: 1) yang telah diaktifkan dengan pemanasan. Pelat dikem. bangkan 40 menit memakai benzena—eter minyak bumi—etanol air (10 : 10 : 2: 1), @-Karotena bergerak ke garis depan, klorofil menunjukkan, Re 49-53 dan xantofil R- 24-40. Kedua. pita karotenoid diclusi dari pclat dengan eter sebelum pelat mengering. Pita 6-karotena dimurnikan dengan KLT pada pelat silika gel @ memakai Pengembang benzena—eter minyak bumi (t d 90—100°C) (1 = ll,Ry 82. Senyawa ini dapat dielusi dari pelat dan identitasnya dipasti- kan dengan mengukur spektrumnya (tabel 8.9) dan dengan cara ko-kromatografi dengan pembanding autentik (pengembang lihat tabel 3.8). i Pita xantofil dikromatografi ulang pada pelat silika gel memakai metilena diklorida—etil asetat (4: 1) dan ketiga pita lainnya, yaitu berturut-turut, mulai dengan R- yang paling tinggi, lutein, violaxantin, dan neoxantin, diclusi dengan eter. Identitas ini dapat dipastikan de- ngan mengukur spektrum. Harus diingat bahwa viclaxantin dan neoxantin, yang merupakan senyawa epoksida, dapat dibedakan ber. dasarkan geser hipokrom pada spektrumnya bila larutan senyawa dalam etanol ditambahi HCI 6,1M. (b) Karotenoid daun bunga Xebanyakan warna bunga kuning pada tumbuhan hias disebabkan oleh karotenoid dan setelah diisolasi-kebanyakan berupa campuran rumit. Valadon dan Mummery (1967, 1971) telah melakukan telaah khusus mengenai pigmen karotena dalam bunga anggota suku Com- positae. Cara yang baik untuk memperoleh pengalaman dalam memi. sahkan campuran karotenoid ialah dengan menerapkan cara umum yang telah dikemukakan pada bagian terdahulu (Lihat h. 161—166) pada salah satu tumbuban tersebut ‘atau lebih. Berbagui marigold (Tagetes), Chrysanthemum, Gerbera, dan Hieracium terdapat di sejumlah kebun, sementara Taraxacum dan Senecio merupakan gulma yang tumbuh subur. di banyak bagian dunia yang beriklim sedang. Cara umum harus dikerjaken samnpai ke tahap pemisahan sterol dengan mendinginkan larutan dalam eter. minyak bumi pada—10°C. Lalu, fraksi akhir karotena dan.xantofil harus dikromatografi pada kolom MgO—‘celite’ (1 : 2) secara terpisah dan dielusi dengan heksana yang mengandung eter dengan kadar yang semakin' meningkat. Berbagai pita yang terbentuk dielusi, lalu diidentifikasi berdasarkan letaknya pada kolom dan berdasarkan sifat spektrum serta sifat kromatografi. Pada bunga kuning atau jingga dari marigold Afrika, Tagetes erecta, terdapat paling sedikit 9pigmen disertai beberapa pigmen lainnya dalam. jumlah sesepora. Dalam fraksi hidrokarbon kita dapat meng. identifikasi: senyawa ‘berikutmenurut ufutan.elusinya: fskarotena (kurang'lebih 1% dari Karotenoid total), 5,6-monoepoksikarotena (kira-kira 40%), '5,6-diepoksikarotena (kira-kira 25%), dan. kripto- xantin (kira-kira 3%). Demikian juga fraksi xantofil harus nienghasil- kan: 5,6-epoksilutein, lutein, zeaxantin, krisantemaxantin, dan flavoxantin (semuanya kira-kita 2—5% dari karotenoid total).(c) Karotenoid buah . a4 ; Kadang-kadang kita dapat mengisolasi karotenoid. yang nisbi: murni dari tumbuhan. tertentu. Hal itu dapat kita lakukan pada kapsantin dari daging buah cabe merah, Capsiciim annuum. Cata di bawah ini diambil dari buku Tkan (1969). Daging buah cabe yang digiling halus (100 g) diekstraksi dengan 200 ml eter minyak bumi (t d 40—60°C) Sclama. empat jam. Setelah disaring, ekstrak diencerkan dengan 600 ml ctcr, tambahkan 100 ml larutan KOH 30% dalam metanol, dan campuran diaduk sclama delapan jam. Lapisan eter dikumpulkan, dicuci, lalu dikcringkan dan diuapkan sampai 20 ml. Bila diencerkan dengan 60 ml eter minyak bumi dan dibiarkan 24 jam dalam lemari Pendingin, kristal kapsantin yang hampir murni akan memisah, Bil, dikehendaki, pemurnian Icbih lanjut dapat dilakukan dengan kro- matografi kolom pada kolom CaCO, memakai pengelusi benzene ter ‘(1 1). Kapsuntin mempunyai iy ¢4, 486 dan 520 nm dalam benzena, 475 dan 504 nm dalam n-heksana, 503 dan 542 nm dalam karbon disulfida. Bila larutan kapsantin dalam kloroform ditambahi Hz S04 pckat atau antimon klorida, terbentuk'warna bira kelasi.