APLIKASI POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KONVENSIONAL

DAN REAL TIME PCR UNTUK DETEKSI WHITE SPOT SYNDROME VIRUS
PADA KEPITING

SIDANG KOMPREHENSIF

RINA NOVITA PRANAWATY

NPM. 230110080062

Dibawah bimbingan:
Ir. Ibnu Dwi Buwono, Msi
Ir. Evi Liviawaty, MP
UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI PERIKANAN
JATINANGOR
LATAR BELAKANG...

Serangan virus Metoda

white spot Deteksi Virus
• PCR
Konvensional
• Real Time PCR
Produksi Organisme
Udang Windu Carrier
PCR Konvensional

PCR adalah reaksi berantai suatu primer dari urutan (sequence) DNA
dengan bantuan enzym polymerase sehingga terjadi amplifikasi DNA
target secara in vitro.

Pada analisa Polymerase Chain Reaction konvensional deteksi

keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan
keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah
dilakukan proses elektroforesis.
 Real Time PCR
Real Time Polymerase Chain Reaction adalah suatu metoda
analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR
adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung
(kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi
tersebut (Fatimi 2010).

Data yang dihasilkan dapat dianalisis dengan perangkat

lunak komputer yang terhubung dengan thermal cycler untuk
menghitung jumlah kopi DNA atau threshold cycle (Ct) dari
patogen dalam sampel pangan tertentu (Fatimi 2010).
 • Berdasarkan uraian diatas maka dapat
diidentifikasi masalah yaitu sejauh mana potensi
IDENTIFIKASI dan tingkat serangan kepiting sebagai carrier
MASALAH dalam penginfeksian penyakit White Spot
Syndrome Virus pada udang windu dengan
menggunakan PCR Konvensional dan Real Time PCR

• Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode deteksi

TUJUAN White Spot Syndrome Virus yang terbaik pada
kepiting sebagai carrier WSSV yang menginfeksi
PENELITIAN udang windu dengan menggunakan PCR
Konvensional dan Real Time PCR.

• Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan

KEGUNAAN informasi kepada petambak udang windu tentang
potensi kepiting yang merupakan carrier WSSV
PENELITIAN yang menyerang udang windu sehingga petambak
dapat mengantisipasi secara dini penyakit WSSV.
 Pendekatan Masalah...

Budidaya Udang Windu

Mengalami penurunan
produksi

Penurunan
Serangan
mutu Hama
penyakit
lingkungan
PCR
Deteksi Konvensional
Organisme
Kepiting
carrier
Real
Time PCR
Hasil Penelitian
 Hasil penelitian Kanchanaphum et al (1998) yang mengifeksi
WSSV pada 3 spesies kepiting melalui suntikan menunjukkan bahwa
ketika kepiting yang terinfeksi WSSV dimasukkan kedalam akuarium
yang berisi udang yang sehat, maka dengan cepat WSSV langsung
menginfeksi udang windu tersebut. Lo et al (1996a,b) dalam
Kanchanaphum et al (1998) menyatakan bahwa WSSV pada carrier
dapat dideteksi dengan amplifkasi PCR.

Berdasarkan hasil penelitian Otta et al. (1999), bahwa sampel

kepiting sebagai vektor virus dan udang dengan kodisi sehat (tanpa
gejala klinis WSSV) memberikan hasil negatif WSSV dengan uji one
step PCR dan sebaliknya memberikan hasil positif WSSV ketika uji
Nested PCR.

Hasil penelitian Tang dan Lightner (2001) yang menentukan sensitivitas pengujian real
time PCR dengan mengkloning setiap genom virus. Plasmid yang dihasilkan dari kloning
digunakan sebagai standar. Konsentrasi ditentukan dan dinyatakan sebagai jumlah molekul per
rekasi. Pada pengujian 1 sampai 108 kopi dari setiap kontrol positif, ditentukan bahwa batas
deteksi real time PCR adalah 1-10 kopi untuk DNA IHHNV dan DNA WSSV. Maka, real time
PCR lebih sensitif daripada PCR konvensional, yaitu 3-6 x 104 kopi/µg DNA.
 TEMPAT WAKTU
Pengambilan sampel dilakukan di
tambak udang windu di Kecamatan
Indramayu dan Pasekan Kabupaten
Indramayu.

Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium

Bioteknologi Perikanan Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Penelitian ini dilaksanakan
Padjadjaran pada Bulan Mei sampai Juli
2012.
Pemeriksaan dengan PCR konvensional
dan pemeriksaan dengan real time PCR
dilakukan di Laboratorium Biologi
Molekuler Balai Uji Standar Karantina
Ikan Jakarta
Alat-Alat Penelitian
Pengambilan Sampel

• Botol plastik, cool box

Isolasi

• Autoclave, Analytical balance, gunting, pinset, sumpit plastik, mikrotube 1,5 ml, rak
mikrotube, centrifuge, refrigerator, waterbath, vortex, mikropipet, mikrotips, timer,,
sarung tangan, spidol marker

Amplifikasi

• PCR Chamber, GeneAmp PCR System 9700, Mesin Rotor-Gene Q yang dihubungkan
dengan perangkat komputer, vortex, microcentrifuge, deep freezer, mikrotube 0,2 ml
dan 0,5 ml, mikropipet, mikrotips, cooler block, beaker glass, sarung tangan

Elektroforesis

• Bejana elektroforesis dilengkapi dengan power supply, tangki, sisir, tutup, Analytical
balance, Botol Scott, Gelas ukur ukuran 50 ml, corong, microwave, Ultraviolet
illuminator, sendok kecil, mikropipet, mikrotips, waterpass, cooler block, parafilm,
sendok pipih, refrigerator, kamera digital, sarung tangan
 BAHAN-BAHAN PENELITIAN
Metode Real Time
Metode PCR Konvensional
PCR

Amplifikasi
Pengambilan
Isolasi Amplifikasi Elektroforesis dengan Real
Sampel
Time PCR
• Larutan • Sampel kepiting • Promega Go • Agarose • Rnase-free water,
Preservasi • Nuclei Lysis Taq® Green • TAE (Tris Acetic • 2x QuantiTect
Alkohol : Gliserol Solution Master Mix Acid EDTA) Buffer Probe PCR Master
(4:1) • 0,5M EDTA pH • Plasmid (+) 50X Mix
• Es Curai 8,0 standar sebagai • Sybr Safe • Primer WSSV
• Proteinase K kontrol positif • Loading Dye 270 dan Primer
• RNase Solution WSSV • DNA Marker WSSV 345
• Protein • Nuclease Free • Ethidium Bromide • Probe WSSV
Precipitation Water (NFW) (EtBr) 296T
Solution • Primer WSSV • Aquadest Steril • Standar Positif
• Isopropanol 270 dan WSSV (+) WSSV 2 x
345 105
• Ethanol 70% • DNA template
• DNA Rehydration • DNA template
Solution
• Es curai
METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang digunakan adalah metode

survei dengan analisis deskriptif kualitatif. Penelitin
ini akan dilakukan dalam beberapa tahap yakni
pengambilan sampel, penelitian di laboratorium, dan
analisis data.
PROSEDUR PENELITIAN
Pengambilan
Isolasi
Sampel
Kepiting sebanyak
7 ekor dari setiap
lokasi tambak Pemeriksaan dengan
Pemeriksaan dengan
PCR Konvensional Real Time PCR

Amplifikasi Setting Profil PCR

Elektroforesis Preparasi Reagen PCR

Proses Real Time PCR

Analisis
Interpretasi Data
Data
First Step PCR

8,5µl NFW x (jumlah 1µl F1 x (jumlah 1µl R1 x (jumlah 12,5µl Master Mix x
sampel + 2)* sampel + 2)* sampel + 2)* (jumlah sampel + 2)*

23µl 23µl 23µl 23µl

Kontrol Negatif

2 µl template 2 µl template 2 µl plasmid +

DNA sampel DNA sampel sebagai kontrol
positif
 ELEKTROFORESIS

Pembuatan Gel Agarose

Loading Hasil Amplifikasi

PCR

Running Elektroforesis

Dokumentasi Gel dengan UV

 1µl + 9µl 1µl + 9µl
NFW NFW

Pengenceran
Standar Positif
Pembuatan
Stok 105 104 103
Campuran
Reaksi Real
Time PCR
9 µl Rnase-free water x 12.25 µl 2x QuantiTect 0.5µl Primer WSSV270 x 0.5µl Primer WSSV345 x 0.5µl Probe WSSV296T x
(jumlah sampel + 4)* Probe PCR Master Mix x (jumlah sampel + 4)* (jumlah sampel + 4)* (jumlah sampel + 4)*
(jumlah sampel + 4)*

23µl 23µl 23µl 23µl

23µl 23µl
23µl

2 µl template 2 µl template 2 µl template 2 µl plasmid 2 µl plasmid 2 µl plasmid

2 µl NTC DNA sampel DNA sampel DNA sampel kontrol + 105 kontrol + 104 kontrol + 103
Analisa Data...

Data yang diperoleh dari hasil penelitian

akan dianalisis secara deskriptif kualitatif
yaitu membandingkan hasil DNA WSSV
yang terdeteksi dengan menggunakan metoda
PCR Konvensional dan Real Time PCR.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan Gejala Klinis

Pengukuran Kualitas Dan Kuantitas DNA

Genom

Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR

Konvensional

Hasil Deteksi Wssv Dengan Real Time

PCR

Perbandingan Hasil Deteksi PCR

Konvensional Dan Real Time PCR
 PENGAMATAN GEJALA KLINIS

Lokasi Organisme Jumlah (ekor)

Scylla serrata 2
Pasekan Helice tridens 1
Pachygrapsus marmoratus 4
Helice tridens 4
Karangsong Ocypode quadrata 1
Uca minax 2
Total 14

Secara fisik, semua sampel kepiting yang diperoleh tidak menunjukkan gejala klinis
terserang virus white spot, yaitu adanya bintik putih pada bagian tubuh.
Pengukuran
1 Kualitas Dan Kuantitas DNA Genom

Panjang Gelombang Rasio

Konsentrasi/
Sampel (nm) Absorbansi
C (ng/µl)
A260 A280 (R)
Pachygrapsus marmoratus (A1) 0,031 0,012 160 2,583
Pachygrapsus marmoratus (A2) 0,039 0,018 185 2,167
Pachygrapsus marmoratus (A3) 0,001 0,009 5 0,111
Pachygrapsus marmoratus (A4) 0,133 0,074 665 1,797
Scylla serrata (B1) 0,021 0,007 105 3,000
Scylla serrata (B2) 0,067 0,035 330 1,914 SPEKTROFOTOMETER
Helice tridens (C1) 0,016 0,004 75 4,000
Helice tridens (D1) 0,200 0,111 1005 1,802
Helice tridens (D2) 0,109 0,050 540 2,180
Helice tridens (D3) 0,354 0,180 1765 1,967
Helice tridens (D4) 0,115 0,053 565 2,170
Uca minax (D5) 0,099 0,046 490 2,152
Ocypode quadrata (D6) 0,059 0,026 290 2,269
Uca minax (D7) 0,064 0,030 320 2,133

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

ELEKTROFORESIS
:

Hasil Deteksi WSSV Dengan PCR Konvensional

1

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Keterangan :
M = Marker 100 bp DNA Ladder 9 = Sampel C1 Helice Tridens
1 = Kontrol Positif (76 bp) 10 = Sampel D1 Helice Tridens
2 = Kontrol Negatif 11 = Sampel D2 Helice Tridens
3 = Sampel A1 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 12 = Sampel D3 Helice Tridens
4 = Sampel A2 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 13 = Sampel D4 Helice Tridens
5 = Sampel A3 Pachygrapsus marmoratus (76 bp) 14 = Sampel D5 Uca minax
6 = Sampel A4 Pachygrapsus marmoratus 15 = Sampel D6 Ocypode quadrata (76 bp)
7 = Sampel B1 Scylla serrata (76 bp) 16 = Sampel D7 Uca minax (76 bp)
8 = Sampel B2 Scylla serrata (76 bp)
 Hasil Deteksi WSSV Dengan Real Time PCR

Pengenceran Standar
Kurva
Kurva standar sampel asal tambak
Pasekan memiliki nilai slope -
y = -4.457x + 39.629 4,45724, nilai efisiensi 67,63%
CT (Siklus ke-)

dan nilai R2 mencapai 0.99398.

Adapun persamaan garis dari kurva
standar yaitu y = -4.457x + 39.629
dengan y adalah nilai Ct dan x
adalah log konsentrasi virus yang
Konsentrasi WSSV
diuji.

Kurva standar sampel sampel asal

tambak Karangsong memiliki nilai
slope -4.64589, nilai efisiensi
CT (Siklus ke-)

64,15% dan nilai R2 mencapai

0.99941. Persamaan garis dari
kurva standar yaitu y = -4.646x +
43.805 dengan y adalah nilai Ct
dan x adalah log konsentrasi virus
yang diuji. Konsentrasi WSSV
 Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Pasekan

Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
 Amplifikasi Sampel Uji Asal Tambak Karangsong

Keterangan :
6 Sampel positif WSSV
1 Sampel negatif WSSV
 PERBANDINGAN HASIL DETEKSI PCR
KONVENSIONAL DAN REAL TIME PCR
Kode Real Time Jumlah Kopi
No. Spesies PCR Konvensional* Nilai Ct WSSV
Sampel PCR
1. Kontrol + Std wssv 2 x 105 16.20 180,335.5
2. Kontrol + Std wssv 2 x 104 20.06 24,599.6
3. Kontrol + Std wssv 2 x 103 25.12 1,803.4
4. A1 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 29.84 157.0
5. A2 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 30.86 92.5
6. A3 Pachygrapsus marmoratus Positif Positif 31.68 60.8
7. A4 Pachygrapsus marmoratus Negatif Positif 30.92 89.9
8. B1 Scylla serrata Positif Positif 30.19 131.2
9. B2 Scylla serrata Positif Positif 31.67 61.0
10. C1 Helice tridens Negatif Negatif - -
11. D1 Helice tridens Negatif Positif 37.39 24.1
12. D2 Helice tridens Negatif Negatif - -
13. D3 Helice tridens Negatif Positif 37.83 19.3
14. D4 Helice tridens Negatif Positif 37.78 19.8
15. D5 Uca minax Negatif Positif 37.19 26.5
16. D6 Ocypode quadrata Positif Positif 36.67 34.3
17. D7 Uca minax Positif Positif 35.03 77.6

Keterangan :
12 Sampel positif WSSV (terinfeksi WSSV)
2 Sampel negatif WSSV (tidak terinfeksi WSSV
 KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut :
1. Real Time PCR lebih mampu mendeteksi keberadaan WSSV pada kepiting tanpa gejala klinis
dibandingkan dengan PCR konvensional.
2. Kepiting yang berpotensi sebagai carrier WSSV diantaranya adalah Pachygrapsus marmoratus,
Scylla serrata, Helice tridens, Ocypode quadrata, dan Uca minax.
3. Deteksi dengan PCR konvensional tujuh sampel kepiting positif WSSV pada ukuran fragmen 76
bp, terdiri dari 3 sampel Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan
Pasekan, sedangkan sampel Ocypode quadrata dan Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.
4. Deteksi dengan real time PCR menunjukkan 12 sampel positif WSSV yang ditandai dengan
adanya akumulasi pada signal fluoresen. Dua belas sampel positif terdiri dari 4 sampel
Pachygrapsus marmoratus dan 2 sampel Scylla serrata asal Kecamatan Pasekan, 3 sampel Helice
tridens, 1 sampel Ocypode quadrata dan 2 sampel Uca minax asal Karangsong, Kecamatan
Indramayu.

SARAN
Berdasarkan kesimpulan diatas, saran yang dapat diberikan yaitu dianjurkan
penggunaan real time PCR untuk deteksi WSSV yang tidak menunjukkan gejala klinis,
serta perlu adanya penelitian lanjutan mengenai deteksi WSSV pada jenis kepiting lain.
TERIMA KASIH