OBJEK 3

PEWARNAAN BAKTERI

I. TUJUAN
1. Mengetahui dan memahami cara macam-macam pewarnaan bakteri
2. Mengetahui dan dapat melakukan pewarnaan sederhana/positif
3. Mengetahui dan dapat melakukan pewarnaan gram
4. Mengetahui dan dapat melakukan pewarnaan negatif
5. Mengetahui dan dapat melakukan preparat tetesan bergantung
II. LANDASAN TEORI
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu
metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya,
ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan
bakteri Klebsiella pneumoniae (Anonim, 2008).
Pada tahun 1883, Christian Gram, seorang ahli bakteriologi dari
Denmark menemukan metode pewarnaan bakteri secara tidak sengaja.
Pewarnaan Gram merupakan pewarnaan deferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Pewarnaan ini
merupakan tahap penting dalam pencirian dan identifikasi bakteri.
Pewarnaan gram memilahkan bakteri menjadi kelompok gram-positif
dan kelompok gram-negatif. Bakteri gram-positif berwarna ungu disebabkan
kompleks zat warna kristal violet yodium tetap dipertahankan meskipun diberi
larutan pemucat, sedangkan bakteri gram-negatif berwarna karena kompleks
tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mengambil
zat warna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan
struktur kedua kelompok bakteri tersebut.
 Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan
segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat
kemungkinan penympangan hasil pewarnaan gram. Karena pada biakan tua
banyak sel mengalami kerusakan pada dinding selnya. Kerusakan pada
dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan
larutan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram-positif dengan dinding yang
rusak tidak lagi dapat mempertahankan kompleks warna kristal violet yodium
sehingga terlihat sebagai bakteri gram-negatif.

Macam-Macam Pewarnaan

A. Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya
untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang
paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus,
basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu
macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-
pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).

Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan
dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat
untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna
yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10
detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

B. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan

menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi
atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut
ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram
tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam,
yaitu dari genus.

Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia.

Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat
lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding
sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum
sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa,
seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

a. Zat warna utama (violet kristal)

b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk
mengintensifkan warna utama.
c. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
d. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga
alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif
akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan
alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu,
yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

C. Pewarnaan negative

Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar

belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme
kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami
pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka
terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan
sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin
atau tinta cina.

Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau

negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan
menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada
permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan
latar belakang berwarna.

D.Preparat Tetasan Bergantung

Pada preparat ini diamati mikroba yang hidup, sedangkan pada

preparat yang diwarnai mikroba tersebut mati. Preparat tetas
bergantung digunakan untuk mengamati pergarakan mikroba. Cara ini
lebih menguntungkan tidak cepat mengering.
III. PROSEDUR KERJA
3.1.Alat
- Objek glass
- Cover glass
- Jarum ose
- Kapas/ tissu
- Bunsen
- Tusuk gigi
3.2.Bahan
- Metilen blue
- Alkohol
- Kristal violet
- Iodine
- NaCl-Faali
- Larutan karbol fuksin-basa
- Lugol
- Safranin
- Tinta cina
3.3.Cara Kerja
A. Cara membuat preparat ulas
1) Biakan Cair
(a) Bersihkan kaca objek dengan sepotong kapas yang dibasahi
dengan alkohol
(b) Tulislah kode organisme pada sudut kaca objek dengan spidol
(c) Kocok tabung yang berisi suspensi bakteri, kemudian dipindahkan
2 mata ose suspensi kebagian tengah kaca objek
(d) Ulaskan suspensi diatas kaca objek
(e) Biarkan preparat mengering di udara sebentar
(f) Fiksasi diatas api untuk membunuh dan melekatkan bakteri pada
kaca objek
 2) Biakan Padat
(a) Bersihkan kaca objek
(b) Tulislah kode organisme
(c) Teteskan 2 mata ose NaCl-Faali di bagian tengah kaca objek
(d) Sentuh ose pada biakan bakteri, kemudian dicampur dengan NaCl-
Faali sehingga merata. Ulaskan campuran ini diatas kaca objek
(e) Biarkan preparat mengering di udara sebentar
(f) Fiksasi diatas api
B. Pewarnaan Sederhana
Bahan dan Alat : 1. Kultur bakteri
2. Zat warna : larutan biru metilen, larutan karbol
fuksin-basa, kristal violet
3. Kaca objek yang bersih
Cara Kerja
1) Buat preparat ulas
2) Beri larutan zat warna, larutan zat warna yang digunakan adalah
larutan biru metilen atau larutan karbol fuksin-basa
3) Biarkan zat warna selamaa 30 detik
4) Cuci dan keringkan hati-hati dengan kertas saring
5) Periksa dengan mikroskop 100x bila preparat ulas dan teknik
pewarnaan dilakukan dengan benar, maka mikroorganisme berwarna
dengan larutan biru metilen, dan warna merah dengan larutan karbol
fuksin-basa
6) Laporkan hasil pengamatan
C. Pewarnaan Gram
Cara kerja:
1) Buat preparat ulas
2) Beri larutan kristal violet selama 1 menit
3) Cuci dengan air
4) Beri larutan lugol selama 1 menit
 5) Beri larutan pemucat selama 10-20 detik. Perhatikan waktu pemucatan
karena pemucatan yng terlalu lama akan memberikan hasil pewarnaan
yang menyimpang
6) Cuci dengan air
7) Beri larutan safranin selama 15 detik
8) Cuci dengan air, kemudian keringkan dengan kertas saring
9) Periksa dengan mikroskop 100x
10) Laporkan hasil pengamatan
D. Pewarnaan Negatif
Cara kerja:
1) Ambil 2 kaca objek, beri 1 tetes tinta cina pada bagian ujung kanan
salah satu kaca objek
2) Ambil kotoran gigi, tusuk gigi menggunakan tusuk gigi, kemudian
campur dengan tinta bak diatas kaca objek
3) Tempatkan salah satu sisi kaca objek yang lain pada campuran ini,
kemudian gesekkan kesamping kiri
4) Biarkan preparat mengering diudara. Preparat tidak boleh dipanaskan
diatas api
5) Periksa dengan mikroskop 100x dan laporkan hasil pengamatan
IV. HASIL

Tabel 1. hasil pewarnaan sederhana

NO Sampel Hasil Literatur

1. PDA  Tumbuh jamur  Tumbuh jamur
 Bentuk jamur : coccus  Bentuk jamur : coccus
 Membentuk hifa dan  Membentuk hifa dan spora
spora dipermukaan dipermukaan media
media

2. NA  Tumbuh bakteri  Tumbuh bakteri

 Bentuk bakteri : coccus  Bentuk bakteri : coccus
 Tidak membentuk hifa  Tidak membentuk hifa dan
dan spora spora
 Tabel 2. hasil pewarnaan gram

No Sampel Hasil Literatur

 Bentuk :  Bentuk: coccus(bulat), gram

batang/panjang positif
1 Staphylococcus (basil)  Warna S.A. : ungu
aureus (S.A)  Warna : ungu
Bakteri gram positif

 Bentuk :  Bentuk : batang atau basil

coccus/bulat yang tidak membentuk
 Warna : merah spora
2 Escherichia Bakteri gram negatif  Warna E.Coli. : merah
coli (E.C)
 Tabel 3. hasil pewarnaan gram negatif

No. Sampel Hasil Literatur

1. NA Bentuk : coccus/bulat, tapi  Tumbuh bakteri
tidak terlalu jelas, mungkin  Bentuk bakteri : coccus
diakibatkan pemberian tinta
cina yang tidak terlalu merata
dan perbesaran mikroskop
yang kurang memadai.

2. PDA bentuk jamur tidak terlihat  Tumbuh jamur

jelas hanya berupa bulat yang  berbentuk hifa dan telah
morfologinya tidak terlalu berubah menjadi misellium
jelas. Hal ini diakibatkan (kumpulan benang hifa).
karena pemberuian tinta cina
yang tidak merata dan
perbesaran mikroskop yang
tidak memadai.
V. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan

sederhana. Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum
digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri seperti coccus, bacillus dan
lainnya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya menggunakan satu macam zat warna saja.
Pewarnaan sederhana menggunakan kristal violet yang merupakan jenis
pewarnaan bermuatan positif sehingga dapat berikatan dengan permukaan sel
bakteri. Sebelum proses pewarnaan dilakukan fiksasi, fungsinya untuk
menginaktivasi enzim yang dapat merusak morfologi sel atau menguatkan
struktur sel sehingga dapat menyulitkan proses pewarnaan . Selain itu fiksasi juga
untuk memepertahankan posisi sel, membunuh sel dan melekatkan sel dengan
preparat sehingga sel bakteri tidak hilang ketika proses pencucian.

Pewarnaan gram yaitu salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling dan
paling banyak digunakan untuk bakteri. Prinsip pewarnaan ini yaitu kemampuan
dinding sel terhadap zat warna dasar setelah dilakukan pemucatan. Dinding sel
gram positif mengandung peptidoglikon sehingga terlihat warna ungu setelah
pemucatan, dikarenakan dinding sel bakteri mengikat Kristal violet dengan kuat.
Dinding sel bakteri gram negatif lebih banyak mengandung lipid, menyebabkan
pori-pori mudah membesar sehingga bakteri tidak berwarna setelah dilakukan
pemucatan karena Kristal violet melarut.

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang dilakukan

bukan pada mikrobanya melainkan ditujukan pada latar belakang dari sel
mikroba. Prinsip pewarnaan ini yaitu tidak akan menembus/berikatan dengan
dinding sel bakteri, pewarna akan membentuk deposit disekitar bakteri
menghasilkan latar belakang hitam sehingga bakteri tampak tidak berwarna
sementara latar belakangnya berwarna gelap. Tidak akan berikatan karena daya
tolak menolak antara muatan negatif pewarna dan muatan negatif dinding sel
bakteri.

Perbedaan gram positif & negative yaitu : bakteri gram negatif tidak
mempertahankan zat warna Kristal violet pada proses pewarnaan gram sehingga
akan berwarna merah bila diamati mikroskop. Sedangkan gram positif memiliki
beberapa lapisan peptidoglikon yang tebal pada dinding selnya, mengandung
teihoic acid. Bakteri gram negative memiliki lapisan peptidoglikon lebih tipis,
namun memiliki membrane luar yang terdiri dari (Lps) Lipopolisakarida,
lipoprotein, dan fosfolipid serta tidak mengandung teihioc acid.

Escherichia coli merupakan bakteri gram negative diketahui memalui pengamatan

bakteri ini berwarna merah. Warna merah disebabkan karena zat kedua warna
yaitu safranin yang (+) setelah pemucatan. Hal ini dikarenakan dinding sel bakteri
E-coli banyak mengandung lipid sehingga pada saat dilakukan pemucatan lipid
ikut larut dan pori-pori didinding sel membesar. Pengamatan dengan pembesaran
100x menunjukkan E-coli benbertuk cocoid/menyerupai bulat dengan penataan
tunggal, serta menghasilkan warna merah muda.

Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif dengan melalui

pengamatan ini bakteri berwarna ungu. Pengamatan dengan perbesaran 100x ini
menunjukkan bentuk sel adalah bulat dengan penataan bergerombolan seperti
buah anggur atau disebut bentuk coccus.
VI. KESIMPULAN dan SARAN
6.1.Kesimpulan
1. Macam-macam pewarnaan yang dilakukan yaitu pewarnaan sederhana,
pewarnaan gram, dan pewarnaan negatif.
2. Pewarnaan bakteri dipengaruhi factor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan
warna, subtract, intensifikasi pewarnaan & penggunaan zat warna
penutup.
3. Perbedaan gram negatif dan gram positif terletak pada warnanya, pada
gram positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna
kristal violet sedangkan gram negatifberwarna merah. Serta perbedaan
terjadi pada dinding selnya, gram positif memiliki lapisan lebih tebal
daripada gram negative.
4. Pengamatan pada bakteri E.coli dengan SA yaitu menghasilkan bentuk
coccus bergerombolan seperti anggur, berwarna ungu pada SA.
Sedangkan bentuk cocoid/cocobacill, berwarna merah muda tersusun
tunggal pada E.coli.

6.2.Saran
1. Upayakan kebersihan dan sterilisasi sabelum melakukan praktikum agar
terjadi kontaminasi
2. Dalam pembuatan preparat jangan terlalu tebal atau tipis dalam
pengolesan bakteri.
 DAFTAR PUSTAKA

Afrianti, R, Nessa. 2019. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Padang:

STIFI Yayasan Perintis Padang

Dwidjoseputro,D. 1994. Dasar-Dasar mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

Hadi Utomo, Ratna S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT

Gramedia Pustaka Utama: Jakarta

Pelczar, M.J. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi.UI Press: Jakarta

Sutedjo,M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta: Rhineka Cipta